一種多指標並行檢測的蛋白晶片檢測系統的製作方法
2023-09-14 09:16:50 1
專利名稱：一種多指標並行檢測的蛋白晶片檢測系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種多指標並行檢測的蛋白晶片檢測系統及製備方法。
背景技術：
生物晶片技術是九十年代中期興起的一種新型生物學技術，它基於生物大分子(核酸、蛋白質等)間相互作用的大規模並行分析方法，並結合微電子、微機械、化學、物理、計算機等多領域的技術，將生命科學研究中所涉及的樣品反應、檢測、分析等過程連續化、集成化、微型化，已成為當今生命科學研究領域發展最快的技術之一。
生物晶片可以廣泛應用於農業、環境、食品、法庭、軍事、科研等領域。不僅如此，由於生物晶片可同時檢測多種疾病相關基因或蛋白，從而對遺傳病、腫瘤、傳染性疾病進行輔助診斷，所以它還具有重要的臨床應用價值。
生物晶片主要分為三大類核酸晶片、蛋白晶片和晶片實驗室。
蛋白晶片是檢測蛋白質之間相互作用的生物晶片。目前研究中的蛋白晶片技術大多基於抗原和抗體特異性結合的原理，將多種蛋白質結合在固相基質(如特殊處理的玻片、有機膜片、矽微球等)上，檢測生物樣品所含有的可與之專一性結合的對應蛋白質。
蛋白晶片可通過發現體內特定蛋白質的含量變化，準確地對生理/病理變化作出判斷。在臨床診斷領域，蛋白晶片具有廣闊的應用前景。
本發明人在中國專利01105023.3中已公開了一種能同時檢測多指標的蛋白晶片檢測系統及製備方法，實現了對一些特異性高但在體液中含量很低蛋白的臨床同時檢測。
發明內容
本發明所要解決的技術問題，是在原申請01105023.3基礎上，對蛋白晶片檢測系統加以改進，以增加檢測系統的穩定性，提高檢測靈敏度。
中國專利申請01105023.3中己公開了一種用於多指標並行檢測的蛋白晶片檢測系統，該檢測系統包括(1)用於多指標並行檢測的蛋白晶片；(2)以一定濃度配比製成的，並帶有發光標記的多蛋白混合液即反應液；(3)一系列已知濃度且濃度遞增的被測蛋白的混合液即標準品；(4)一種蛋白晶片的洗滌液。
本發明修改了被測蛋白標準品溶液的配方，使不同蛋白質混合後不會喪失活性，增加了其穩定性，提高了檢測的準確性。
所述的已知濃度且濃度遞增的被測蛋白(或稱目標蛋白A)的標準品溶液配方為40％-60％胎牛血清+各種高濃度純化抗原+0.02-0.1‰NaN3或PH7.0-7.8 0.05M PB(KH2PO4-Na2HPO4)+2-30％BSA+1.5-2.5％蔗糖+0.02-0.1‰NaN3+各種高濃度純化抗原。該一系列已知濃度且濃度遞增的目標蛋白A的混合液配製後凍幹保存。
本發明所要解決的另一技術問題是提供一種改進的上述檢測系統中的蛋白晶片的製備方法。
本發明所述蛋白晶片包括固相載體和固定於載體上用於多指標並行檢測的蛋白，該蛋白晶片是利用晶片自動點樣系統，通過物理吸附或共價結合的方式，將多種蛋白質以一定的排列次序固定在固相載體上；然後用封閉液將固相載體的非點樣部位封閉，乾燥保存。蛋白質可以是抗原、抗體、受體、配體等，進一步指能與體內疾病性標誌蛋白特異結合的蛋白，尤其是腫瘤標誌性蛋白。
其中所述的固相載體可以是無機片基或有機化合物片基，無機片基包括半導體矽片、玻璃片、微孔矽片、微孔玻璃片等，優選玻璃片；有機片基包括醋酸纖維素膜、硝酸纖維素膜，尼龍膜，聚丙烯膜等。
該蛋白晶片是通過下述技術方案獲得的1、確定多種不同的被測物蛋白(簡稱目標蛋白A)和A特異性的抗原、抗體或受體等(簡稱B)，如體內疾病標誌性蛋白和能與之特異結合的多種蛋白；2、將上述所述B即不同的蛋白探針以一定濃度溶於包被液中，然後用晶片自動點樣系統將這些蛋白質點制在固相載體上，點樣密度25-200點/cm2，點樣量0.1-10ng/點；3、4度放置過夜；4、用封閉液將蛋白晶片封閉；5、乾燥處理，儲存於4度；為了使晶片上所點的多種蛋白質在發生一系列反應後產生的光信號能在相鄰兩個數量級上(最強點/最弱點＜100)，以便於檢測儀器的檢測，事先調節了晶片上蛋白質的濃度。(最適點樣濃度)。
本發明提供的包被液配方為pH為7.0-8.0的PB(KH2PO4-Na2HPO4)。
本發明提供的封閉液配方為含1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PB(KH2PO4-Na2HPO4)。其優點是BSA都有封閉作用，蔗糖是惰性物質，能隔絕空氣，BSA和蔗糖可作為支持框架結構的物質。封閉液的作用使固相載體的其他部位不能結合蛋白質，從而保證實驗數據的準確性。
本發明在製備方法中緩衝液配方的改進與原發明相比降低非特異性吸附，減少背景信號值；並增加了蛋白晶片的穩定性，提高了檢測的靈敏度。
圖1為本發明改進緩衝液配方的製備方法製備的蛋白晶片信號圖象圖2為原發明製備方法製備的蛋白晶片信號圖象
具體實施例方式實施例一、用改良後的緩衝液(包括封閉液、包被液)配方製備腫瘤檢測蛋白晶片與以原有緩衝液配方製備的蛋白晶片背景和信號值比較1、用改進緩衝液配方的蛋白晶片製備方法製備蛋白晶片E1.1將AFP、CEA、PSA、free-PSA、CA125、CA15-3六種腫瘤標誌物的對應抗體(一抗)以一定濃度溶於包被液中，然後用晶片自動點樣系統將這些蛋白質點制在固相載體上，點樣密度48點/cm2，點樣量0.5ng/點，每種一抗對應點4個平行點；1.2 4度放置過夜；1.3 用封閉液將蛋白晶片封閉1小時；1.4 乾燥處理2小時，儲存於4度備用。
其中用到的包被液配方為pH為7.8的PB(KH2PO4-Na2HPO4)。
其中用到的封閉液配方為3％BSA，5％蔗糖，0.5％NaN3的PB(KH2PO4-Na2HPO4)。
2、用原蛋白晶片製備方法製備蛋白晶片F其中用到的包被液配方為pH為9.6的CBS(NaHCO3-Na2CO3)。
其中用到的封閉液配方為含0.2％Tween20，0.1％酪氨酸，5％BSA，4％蔗糖，0.5％proclin的TBS。
將上述蛋白晶片E、F與配套的反應液、洗液、和已知濃度的血清樣品反應，(剩餘的血清樣品留待下一次實驗使用)。並用生物晶片檢測儀進行拍攝和數椐分析。信號值如表1所示
(表1)將上述晶片4℃貯存放置，6個月後與取上述實驗中同一批號地反應液、洗液、和上述的剩餘血清樣品反應，信號值如表2所示
(表2)與蛋白晶片F相比，按本發明的緩衝液配方製備的蛋白晶片E其穩定性明顯增加。
另外，由生物晶片拍攝出的蛋白晶片E信號圖象見圖1，蛋白晶片F信號圖象見圖2。由兩圖可見，圖1的背景明顯低於圖2。
實施例二、用改良後的標準品緩衝液配方製備標準品與原有標準品穩定性比較1.以如下配方配製標準品緩衝液60％胎牛血清+各種高濃度純化抗原+0.05‰NaN3另加入60μlAFP，CEA，NSE高濃度純化抗原製成標準品溶液A；2.以如下配方配製標準品緩衝液PH7.8 0.05M PB(KH2PO4-Na2HPO4)+15％BSA+2.5％蔗糖+0.05‰NaN3，另加入60μ1AFP，CEA，NSE高濃度純化抗原製成標準品溶液B；3.按原有配方配製標準品緩衝液，另加入60μlAFP，CEA，NSE高濃度純化抗原製成標準品溶液C。
注溶液A、B、C中的AFP、CEA、NSE終濃度是一致的。
將以上三種標準品溶液凍幹，分別是標準品a、b和c，用化學發光自動分析儀進行標定，標定的濃度值結果如表3
(表3)將a、b、c三種標準品貯存於4℃，放置3個月後，用同一臺化學發光自動分析儀進行復標，標定的濃度值結果如表4
(表4)與原有緩衝體系製備的標準品c相比，標準品a、b的濃度更為穩定，可保存更長的時間不喪失活性。
權利要求
1.一種多指標並行檢測的蛋白晶片檢測系統，由用於多指標並行檢測的蛋白晶片、以一定濃度配比製成的，並帶有發光標記的多蛋白混合液即反應液、一系列已知濃度且濃度遞增的被測蛋白的混合液即標準品、和洗滌液組成，其特徵在於其中所述的標準品溶液配方為40％-60％胎牛血清+各種高濃度純化抗原+0.02-0.1‰NaN3或PH7.0-7.8 0.05M PB+2-30％BSA+1.5-2.5％蔗糖+0.02-0.1‰NaN3+各種高濃度純化抗原。
2.一種如權利要求1所述的蛋白晶片檢測系統的製備方法，其中蛋白晶片製備包括下列步驟1)確定多種不同的被測物蛋白，簡稱目標蛋白A和A特異性的抗原、抗體或受體等，簡稱B，如體內疾病標誌性蛋白和能與之特異結合的多種蛋白；2)將上述所述B即不同的蛋白探針以一定濃度溶於包被液中，然後用晶片自動點樣系統將這些蛋白質點制在固相載體上，點樣密度25-200點/cm2，點樣量0.1-10ng/點；3)4度放置過夜；4)用封閉液將蛋白晶片封閉；5)乾燥處理，儲存於4度；其特徵在於其中所述的包被液配方為pH為7.0-8.0的PB。
3.一種如權利要求2所述的蛋白晶片檢測系統的製備方法，其特徵在於其中所述的封閉液配方為含1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PB。
全文摘要
本發明提供了一種多指標並行檢測的蛋白晶片檢測系統及製備方法。本發明通過對現有蛋白晶片檢測系統及製備的改進，增加了檢測系統的穩定性，提高了檢測靈敏度。
文檔編號G01N33/68GK1492229SQ02137620
公開日2004年4月28日 申請日期2002年10月24日 優先權日2002年10月24日
發明者胡賡熙 申請人:上海數康生物科技有限公司