一種芽孢桿菌及其酯酶的提取方法和應用的製作方法
2023-09-14 11:17:45 1
專利名稱：一種芽孢桿菌及其酯酶的提取方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種芽孢桿菌及其酯酶的提取方法和應用。
背景技術：
有機磷農藥在保護農作物免受病、蟲害，提高糧食產量方面具有巨大作用，但其過 度使用經常導致蔬菜和水果等農產品農藥殘留超標，直接危害人們的身體健康，因此有效 控制農產品的農藥殘留是我國當前解決食品安全問題的主要任務之一。減少農產品農藥殘 留危害的最有效的途徑之一是建立快速有效的農藥殘留檢測方法。目前國內大部分的農貿 市場都在使用酶抑制法來檢測果蔬的有機磷農藥殘留，該法涉及了酶試劑、底物和顯色劑， 其中的關鍵技術是對有機磷和氨基甲酸酯類農藥敏感的酯酶的提取和獲得。目前國內現有 的用於規模生產的酯酶都是從動物中提取的，主要還存在以下缺點和問題(1)篩選酶源 工作量很大、成本較高；( 酶來源不穩定，不同批次不同個體來源的酶的差異較大。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，提供一種成本低、靈敏度高以及酶來源 穩定的芽孢桿菌酯酶的提取方法。該菌命名為芽孢桿菌(Bacillus brevis)GDXEase8，編號為。本發明芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8的分子分類地位的確定。該菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。該菌株在平板上的菌落呈圓形、淺黃色、不透明、表面光滑、邊緣整齊。細胞呈杆 狀，直徑0. 8 μ m左右，長度約2-3 μ m,革蘭氏染色為陽性，芽孢呈橢圓形，近端生。對該菌株進行的抗生素抗性、接觸酶實驗結果表明，菌株對萘啶酮酸和大觀黴素 有抗性，接觸酶實驗結果為陽性。本發明還提供了芽孢桿菌酯酶的提取方法，包括以下步驟(1)斜面菌種將芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8接種到營養瓊脂斜面上 培養；(2)擴大種子液培養將斜面菌種接種到裝有種子培養基的三角瓶中，37士3°C， 100-300rpm，搖床培養12-14小時；所述種子培養基為蛋白腖1%，酵母膏0. 5%, NaCl 0. 5%,pH7. 0 ；(3)發酵培養將擴大培養種子液接種到發酵培養基中，於37士3°C培養M-26小 時；所述發酵培養基為葡萄糖1 %，蛋白腖2%，K2HPO4O. 1 %，NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7.0 ；(4)芽孢桿菌酯酶的提取將發酵菌液3000-5000rpm離心10-20min，收集菌體， 用0. 01-003mol/L pH7. 0磷酸緩衝液洗滌後再次用磷酸緩衝液懸浮，用超聲波破壁法提酶， 3000-5000rpm離心10_20min，所得上清即為芽孢桿菌酯酶。本發明還提供了該芽孢桿菌酯酶在農藥殘留檢測方面的應用。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果1.本發明以一株芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8為出發菌株進行發酵後 提取酶液，該酶在菌種不發生變異的情況下其性質完全相同，重複性好，克服了不同動植物 個體來源的酯酶存在差異的問題。2.本發明以芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8進行發酵提取酶液，不需要 篩選酶源，也不需要純化，降低了酶提取的工作量和成本。3.本發明提供的芽孢桿菌酯酶在甲胺磷、敵敵畏濃度分別為0. 3ppm、0. 005ppm時 抑制率都高於50%，使檢測限度遠低於相關的國家標準，克服了目前產品對有機磷農藥的 敏感度不高，特別是對甲胺磷等的敏感度低的缺點。本發明芽孢桿菌(Bacillus brevis)GDXEase8已於2010年11月9日保藏於國 家知識產權局指定的保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為No. CCTCC M 2010295。
具體實施例方式實施例1本發明提供的芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8具有下述性質1.形態特徵菌株在平板上的菌落呈圓形、淺黃色、不透明、表面光滑、邊緣整齊。細胞呈杆狀， 直徑0. 8 μ m左右，長度約2-3 μ m,革蘭氏染色為陽性，芽孢呈橢圓形，近端生。2.生理生化鑑定對菌株進行的抗生素抗性、接觸酶實驗結果表明，菌株對萘啶酮酸和大觀黴素有 抗性，接觸酶實驗結果為陽性。3. 16SrDNA 序列該菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。實施例2實施例1所述的芽孢桿菌酯酶的製備方法(1)斜面菌種將保藏的菌種接種到營養瓊脂斜面上培養，0-4°C保存。(2)擴大種子液培養將斜面菌種接種到裝有IOOml種子培養基(蛋白腖1%，酵 母膏 0.5%，NaCl 0. 5%, pH7. 0)的 250ml 三角瓶中，37°C，200rpm，搖床培養 12 小時。(3)發酵培養將IOOml擴大培養種子液接種到IOL發酵罐中，於37°C培養M小 時(培養基配方葡萄糖 1%，蛋白腖 2%，K2HPO4O. 1 %, NaH2PO4O. 1%, pH7. 0) (4)酶液的提取將發酵菌液離心(4000rpm) 15min,收集菌體，用0. 02mol/ L磷酸緩衝液(pH7.0)洗滌後再次用磷酸緩衝液懸浮，用超聲波破壁法提酶，離心 (4000rpm) 15min，所得上清即為酯酶液。實施例3實施例2所述的芽孢桿菌酯酶對有機磷農藥的敏感度檢測材料細菌酯酶、靛酚乙酸酯溶液和磷酸緩衝液儀器恆溫水浴鍋、分光光度計酯酶活力測定在試管中加入4. 7mL 0. 02mol/L, ρΗ7· 0磷酸緩衝液，200 μ L2%靛 酚乙酸酯，混勻，37°C水浴10分鐘，加入100 μ L芽孢桿菌酯酶，反應5分鐘後加入5mL無水乙醇終止反應(對照管在加無水乙醇後再加芽孢桿菌酯酶)，測0D605。抑制率計算(0D0-0D1)/ODOX 100% (0D0 不被抑制時的OD值；ODl 抑制後的OD
值)測定結果(1)芽孢桿菌酯酶對敵敵畏的敏感度敵敵畏濃度為0. 005ppm時，抑制率高於50 %，低於相關標準[GB/T 5009. 199-2003蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測]。(2)芽孢桿菌酯酶對敵百蟲的敏感度敵百蟲濃度為0. Ippm時，抑制率高於50%，低於相關標準[GB/T5009. 199-2003蔬
菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測]。(3)芽孢桿菌酯酶對甲胺磷的敏感度甲胺磷濃度為0. 5ppm時，抑制率高於50%，低於相關標準[GB/T5009. 199-2003蔬
菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測]。(4)芽孢桿菌酯酶對樂果的敏感度樂果濃度為2ppm時，抑制率高於50%，低於相關標準[GB/T 5009. 199-2003蔬菜 中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測]。(5)芽孢桿菌酯酶對乙醯甲胺磷的敏感度乙醯甲胺磷濃度為0. 6ppm時，抑制率高於50 %，低於相關標準[GB/ T5009. 199-2003蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測]。
權利要求
1.一種芽孢桿菌(Bacillus brevis)⑶XEase8，其特徵在於其保藏編號為CCTCC M 2010295。
2.根據權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillusbrevis)⑶XEase8，其特徵在於所述芽 孢桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。
3.—種權利要求1或2的所述的芽孢桿菌酯酶的提取方法，其特徵在於包括以下步驟(1)斜面菌種將芽孢桿菌(Bacillusbrevis)⑶XEaseS接種到營養瓊脂斜面上培養；(2)擴大種子液培養將斜面菌種接種到裝有種子培養基的三角瓶中，37士 3°C， 100-300rpm，搖床培養12-14小時；所述種子培養基為蛋白腖1%，酵母膏0.5%，NaCl 0. 5%,pH7.0 ；(3)發酵培養將擴大培養種子液接種到發酵培養基中，於37士3°C培養M-26小時； 所述發酵培養基為葡萄糖1 %，蛋白腖2%，K2HPO4 0.1%，NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7.0 ；(4)芽孢桿菌酯酶的提取將發酵菌液3000-5000rpm離心10-20min，收集菌體，用 0. 01-003mol/L pH7. 0磷酸緩衝液洗滌後再次用磷酸緩衝液懸浮，用超聲波破壁法提酶， 3000-5000rpm離心10_20min，所得上清即為芽孢桿菌酯酶。
4.如權利要求3所述的芽孢桿菌酯酶在農藥殘留檢測方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種芽孢桿菌(Bacillus brevis)GDXEase8及其酯酶的提取方法和應用，該菌已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期為2010年11月9號，保藏編號為CCTCC No:M2010295。本發明成本低、靈敏度高以及酶來源穩定。
文檔編號C12R1/08GK102134559SQ201010546319
公開日2011年7月27日 申請日期2010年11月15日 優先權日2010年11月15日
發明者肖桂秋, 隆湘蕾 申請人:廣州吉家莊生物科技有限公司