一種高含量羥脯氨酸的鹿膠原肽的製備方法

2023-09-14 11:17:30

專利名稱：一種高含量羥脯氨酸的鹿膠原肽的製備方法
技術領域：
本發明涉及鹿膠原肽的製備方法，本發明製備所得膠原蛋白得率高、羥脯氨酸的含量高、分子量小，可應用於食品、化妝品、保健品、藥品等領域。
背景技術：
膠原蛋白是地球上最豐富的蛋白質，存在於皮膚、骨頭、軟骨、肌腱等組織中，起著支撐、保護、連結等作用，脊椎生物中膠原蛋白的含量可達25-30%。膠原蛋白是由三條螺旋結構的肽鏈組成，分子量30萬道爾頓，不溶於水。膠原蛋白的三螺旋結構中有高度重複的Gly-X-Y (甘氨酸-X-Y，XY是不同的胺基酸)序列，特異性存在Gly-PiO-Hpy (甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸)序列。膠原蛋白經水解後使原本包含在蛋白質中的肽段釋放出來而表現促進骨細胞分化、血管緊張素轉化酶抑制、抗氧化等生物活性，因此膠原蛋白水解所得的膠原肽廣泛應用於保健食品、化妝品等領域。膠原肽分子量小、在水中溶解性好，可穿過腸障礙進入血液系統，從而達到皮膚組織，臨床前及臨床研究已經證明膠原蛋白水解物可改善皮膚狀況(ITE Lett.2006，7，386-390)。羥脯氨酸是膠原蛋白的特徵胺基酸，在其他蛋白質中很少見。文獻證明膠原肽中主要成分Pro-Hyp可促進皮膚纖維細胞生長(Agric.Food Chem.2009, 57,444-449)和改善關節炎症狀(Osteoarthri tis and Cartilage,17(12)，1620-1627)，食用膠原肽中的Pro-Hyp對身體具有積極的作用(Food Chemistry129(2011) 1019-1024)。因此膠原肽製備過程中最大限度地提取、保留羥脯氨酸對膠原肽的活性具有至關重要。膠原蛋白中羥脯氨酸的含量主要與原料來源相關，但是同一來源的膠原肽中羥脯氨酸的含量主要取決於製備方法(吉林大學學報自然科學學報，2001,106-108)。膠原肽的提取方法有:酸法、鹼法和酶法，酸法和鹼法會破壞膠原肽中胺基酸而很少應用，酶法是目前研究和應用較多的方法。酶法分為一步法和兩步法，一步法所採用的酶可以是單酶也可以是複合酶，二步法是不同單酶分次酶解。目前文獻報導的各種來源的膠原肽中羥脯氨酸的含量均不超過12%，文獻報導的鹿`皮膠原肽中羥脯氨酸的含量僅為8.6% (吉林大學學報自然科學學報，2001，106-108)，鹿茸膠原蛋白水解物中羥脯氨酸僅為6.7% (李銀清，長春中醫藥大學博士論文，2010)。本發明提供一種簡單易行的單酶、複合酶相結合的二步法鹿膠原肽製備方法，可顯著提高膠原蛋白提取率和羥脯氨酸含量。

發明內容
本發明的目的是提供一種高含量羥脯氨酸鹿膠原肽的製備方法，其以鹿皮、鹿筋為原料，所製備的膠原肽羥脯氨酸大於16%，分子量小於3000道爾頓，在醫藥領域和功能性食品領域具有良好的應用前景為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下:以新鮮的鹿皮、鹿筋等為原料，鹿皮或鹿筋用純水清洗乾淨，剪為2 3平方釐米的碎片，鹿皮或鹿筋碎片按照1:1 100質量比加入0.0lM醋酸緩衝液，再按1: 10 500加入胃蛋白酶，於20 50°C攪拌反應I 10小時。將上述反應液的pH用IM NaOH調至6 8，加入複合酶進行酶解，加酶量為反應物質量的0.1 I %，於20 70°C攪拌反應I 10小時，反應結束後90°C滅活20min。將上述反應液5000rpm離心5min，收集上清，冷凍乾燥得到鹿膠原肽。酶解過程為兩步法，第一步用單酶酶解，第二步用複合酶酶解。單酶酶解所用酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中一種，複合酶為胰蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、鹼性蛋白酶或中性蛋白酶其中兩種、三種、四種或五種酶組合使用。按照所述的製備方法製備的膠原肽具有以下特徵:膠原肽得率> 90%，羥脯氨酸的含量> 16%，分子量 90%，羥脯氨酸含量> 16%，分子量< 3000道爾頓，易於被人體吸收，高含量羥脯氨酸可顯著提高膠原肽的生物活性和對皮膚的保溼性能。3.本發明的製備工藝簡單，對環境無汙染，綠色環保。

4.通過本發明製備的鹿膠原肽活性肽可用於化妝品和保健食品，因此具有良好的應用前景。


圖1採用本發明的製備工藝所製備的鹿膠原肽的分子量分布的MALD-TOF質譜圖。
具體實施例方式實施例1以新鮮鹿皮為原料，按照以下工藝製備鹿膠原肽:以新鮮的鹿皮為原料，鹿皮用純水清洗乾淨，剪為2 3平方釐米的碎片，鹿皮碎片按照1:1質量比加入0.0lM醋酸緩衝液中，再按胃蛋白酶與鹿皮的質量比1: 10、加入胃蛋白酶，於20°C攪拌反應I小時。將上述反應液的pH用IM NaOH調至7，加入複合酶(按質量比，胰蛋白酶:鹼性蛋白酶為1:1)進行酶解，加酶量為反應物鹿皮質量的0.1%，於20°C攪拌反應I小時，反應結束後90°C滅活20min。將上述反應液5000rpm離心5min，收集上清，上清冷凍乾燥得到鹿膠原肽。膠原肽得率為92%。膠原肽中羥脯氨酸含量採用氯氨T氧化，對甲胺基苯甲醛顯色，分光光度法測定，質量含量為17.9% (按照中華人民共和國國家標準:肉與肉製品L-羥脯氨酸含量測定GB9695.23-90 操作)。
分子量分布採用MALD-T0F-MS測定，分子量分布如圖1所示，分子量均< 3000道爾頓。實施例2以新鮮的鹿筋為原料，鹿筋用純水清洗乾淨，剪為2 3平方釐米的碎片，按照鹿筋碎片:醋酸緩衝液的質量比為1: 100、鹿筋碎片加入0.0lM醋酸緩衝液中，再按胃蛋白酶與鹿皮的質量比1: 500、加入酸性蛋白酶，於50°C攪拌反應10小時。將上述反應液的pH用IMNaOH調至8，加入複合酶(按質量比，木瓜蛋白:菠蘿蛋白酶，中性蛋白酶為1:1)進行酶解，加酶量為反應物鹿筋質量的I %，於70°C攪拌反應10小時,反應結束後90°C滅活20min。將上述反應液5000rpm離心5min,收集上清,冷凍乾燥得到鹿膠原肽。膠原肽得率95%。膠原肽中羥脯 氨酸含量採用氯氨T氧化，對甲胺基苯甲醛顯色，分光光度法測定，含量為16.9%。分子量分布米用MALD-T0F-MS測定,分子量均分布如圖1所不，分子量均
<3000道爾頓。
權利要求
1.一種高含量羥脯氨酸的鹿膠原肽的製備方法，其特徵在於: 所述鹿膠原肽的製備過程如下，以新鮮的鹿皮和/或鹿筋為原料，鹿皮和/或鹿筋用純水清洗乾淨，破碎為2 3平方釐米的碎片，按照鹿皮和/或鹿筋與醋酸緩衝液質量比為I: I 100，將鹿皮和/或鹿筋碎片加入0.01-0.1M醋酸緩衝液中，再按單酶與鹿皮和/或鹿筋質量比為1: 10 500、加入胃蛋白酶，於20 50°C攪拌反應I 10小時； 將上述反應液的pH用0.1-1M NaOH溶液調至6 8，加入複合酶進行酶解，加複合酶量為反應物鹿皮和/或鹿筋質量的0.1 I %，於20 70°C攪拌反應I 10小時，反應結束後滅活；將上述反應液離心，收集上清，上清冷凍乾燥得到鹿膠原肽。
2.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於: 酶解過程為兩步法，第一步用單酶酶解，第二步用複合酶酶解； 單酶酶解所用酶為胃蛋白酶、酸性蛋白酶其中一種； 複合酶為胰蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、鹼性蛋白酶或中性蛋白酶其中兩種、三種、四種或五種酶組合使用；每種酶於複合酶中的質量含量為20-80%。
3.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於: 滅活是指，反應結束後60-100°C滅活10-60min。
4.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:離心是指，將反應液3000-8000rpm離心5_60min。
5.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於: 製備的膠原肽具有以下特徵:膠原肽得率>90%，羥脯氨酸的含量> 16%，分子量<3000道爾頓。
全文摘要
本發明是一種高含量羥脯氨酸的鹿膠原肽的製備方法，以新鮮的鹿皮和/或鹿筋為原料，破碎為2～3平方釐米的碎片，將鹿皮和/或鹿筋碎片按其與緩衝液質量比為1∶1～100加入0.01-0.1M醋酸緩衝液中，再按單酶與鹿皮和/或鹿筋質量比為1∶10～500加入單酶，於20～50℃攪拌反應1～10小時；將反應液的pH用0.1-1M NaOH溶液調至6～8，加入複合酶進行酶解，加複合酶量為反應物鹿皮和/或鹿筋質量的0.1～1％，於20～70℃攪拌反應1～10小時，滅活；反應液離心，收集上清，冷凍乾燥得到鹿膠原肽。以含高含量羥脯氨酸鹿膠原肽為活性成份，在醫藥及保健品領域具有良好的應用前景。
文檔編號C12P21/06GK103173510SQ20111043395
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者鄒漢法, 靳豔, 劉曉豔 申請人:中國科學院大連化學物理研究所