一種檢測柯薩奇病毒抗體的合成肽試劑的製作方法

2023-09-14 08:32:05

專利名稱：一種檢測柯薩奇病毒抗體的合成肽試劑的製作方法
技術領域：
本發明屬病毒抗體檢測領域。
合成肽可以模擬完整的蛋白質，代替後者檢測抗體[Leinikki，P.et al.Adv Virus Res.43(1)149-186；1993.]。應用合成肽檢測抗體主要是使用固相免疫法(如ELISA，放射免疫法)。合成肽能夠提供化學組成確定的、均勻一致的抗原用於檢測抗體，特異性強、重複性好。由於合成肽包被於固相上的密度很高，能明顯增加檢測的敏感性。此外，合成肽還具有製備簡單，穩定、易保存，價格性能比合理等優點。因此應用合成肽檢測抗體的研究受到越來越多的重視。
柯薩奇B組病毒(CVB)有6個血清型，CVB感染可引起心肌炎，心包炎，流行性胸痛(Bornholm病)，無菌性腦炎，無菌性腦膜炎，肌松馳性癱瘓症，熱性皮疹，夏季感冒，中耳炎，肺炎，胰腺炎，胃腸炎，以及肝炎等多種疾病[向近敏，醫學病毒學，339-342，上海科學技術出版社，1986]。檢測CVB抗體的常用方法包括用中和試驗、補體結合試驗從血清或腦脊液中檢測特異性病毒抗體。近年來還發展了應用免疫酶法(EIA)或固相放射免疫法(SPRIA)來檢測病毒抗體[Bendinelli，M.Coxsackieviruses--Ageneral update.PlenumPress.203-219；1988.]。然而，這些方法都不盡如人意，中和試驗雖然敏感性和特異性均好，但是需要大量的組織培養工作，通常要求檢測雙份血清，耗時費力，操作繁瑣。
由於在血清中檢測到CVBIgM抗體通常表明患者存在急性或持續CVB感染[Bendinelli，M.Coxsackieviruses-A general update.PlenumPress.203-219；1988.]，用固相免疫法檢測血清中CVBIgM抗體具有高度敏感性和特異性，且可在一天內完成。因此，在CVB感染的血清學檢測中，應用CVB病毒顆粒的固相免疫法得到廣泛的研究和重視。並發展了間接固相免疫法(ISPIA，indirect solid-phase immunoassay)，和捕捉IgM抗體免疫法(IgM antibody-capture immunoassay，MACIA)兩種主要檢測CVBIgM抗體的方法。但是，固相免疫法仍需使用病毒抗原，需要培養病毒，而且CVB和其它腸道病毒之間存在廣泛的交叉反應，導致假陽性。因此，尋找CVB的共同抗原表位作為廣譜的檢測CVB抗體的合成肽試劑，建立快速、準確的檢測CVBIgM抗體的免疫酶法，具有重要的臨床價值。
本發明的目的是提供一種用合成肽代替CVB病毒檢測CVB抗體的檢測試劑，建立快速、準確的檢測CVBIgM抗體的間接ELISA法，及捕捉IgM抗體ELISA法(MAC-ELISA)。
本發明的技術方案是使用含有CVB共同優勢抗原表位的合成肽(VP1-1肽和VP3-1肽)作為抗原，代替CVB病毒檢測CVBIgM抗體鑑於CVB衣殼蛋白中存在著多處保守序列[Lizuka，N.et al.Virology.15664-73；1987.Lindberg，A.M.et al.Virology.15650-63；1987.Jenkins，O.et al.J.Gen.Virol.681835-1848；1987.Zhang，G.et al.J.Gen.Virol.74845-853；1993.Klump，W.M.et al.J.Virol.641573-1583；1990.6-10]，本發明在計算機的輔助下，以CVB4衣殼蛋白VP1及VP3的序列為基準，對CVB衣殼蛋白VP1及VP3的保守區的親水性，疏水性[Hoop，T.P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.783824-3828；1981.Parker，J.M.R.et al.Biochemistry.255425-5432；1986.Manavalan，P.et al.Nature(London).275673-674；1978.Kyte，J.et al.J.Mol.Biol.157105-132；1982.]，抗原性[Welling，G.W.et al.FEBS.188215-218；1985.]，表面概率[Emini，E.A.et al.J.Virol.55836-839；1985.]及二級結構[Chou，P.Y.et al.Adv.Enzymal.4745-148；1978.]進行分析和預測，以確定CVB的共同抗原表位。選擇序列的原則包括肽段位於β-轉角豐富的區域，兩側為α-螺旋或β-摺疊結構，或者具有較高的親水性、兩親性、表面概率或抗原性。經過分析我們選用CVB4-VP1的237-249殘基的肽段(VP1-1肽，RIYFKPKHVKAYV)，以及CVB4-VP3的115-133殘基的肽段(VP3-1肽，KLTFMFCGSAMATGLFLLA)，進行固相化學合成，多肽經分離純化後進行胺基酸組成分析。
ELISA法證實這兩條多肽與兔抗CVB1、2、3、4、5、6型血清均有交叉反應。用VP1-1肽和VP3-1肽分別免疫家兔製備出高效價的抗多肽血清。ELISA法檢測兔抗多肽血清與CVB1、2、3、4、5、6型病毒亦均有交叉反應。上述結果證實VP1-1肽及VP3-1肽含有CVB1-6的共同抗原表位。
以這兩條多肽作抗原，用間接ELISA對病毒性心肌炎(VMC)患者的血清進行CVBIgM抗體的檢測(90例中37例陽性，41.1％)。與使用CVB1-6病毒混合抗原的斑點印跡法(90例中45例陽性，50％)進行比較，結果用多肽檢測CVBIgM抗體的敏感性為86.5％，特異性為75.5％，陽性率與用CVB1-6病毒混合抗原檢測CVBIgM抗體的陽性率無顯著差別，卻有顯著的相關性(P＜0.001)。表明這兩條多肽可代替CVB病毒抗原用於檢測CVBIgM抗體。本發明提供了用多肽檢測CVBIgM抗體的間接ELISA法。
在這兩條多肽的自由氨基上標記上生物素後，用MAC-ELISA對VMC患者血清進行CVBIgM抗體的檢測(90例中39例陽性，43.3％)。並與使用CVB1-6病毒混合抗原的斑點印跡法進行比較，結果用多肽檢測CVBIgM抗體的敏感性為87.2％，特異性為78.4％，陽性率與用CVB1-6病毒混合抗原檢測CVBIgM抗體的陽性率無顯著差別，卻有顯著的相關性(P＜0.001)。因此，本發明提供了用多肽檢測CVBIgM抗體的MAC-ELISA法。
本發明用合成肽代替CVB病毒檢測CVBIgM抗體，具有較高的敏感性和特異性，重複性好，檢測速度快，合成肽製備簡單，穩定性高，價格合理。為CVB感染的實驗室檢測提供了新方法。
實施例1CVB共同優勢抗原表位的確定採用Chou-Fasman的方法對CVB4衣殼蛋白VP1及VP3的二級結構進行分析，可見其VP1的237-249肽段(保守區，表1)中間的殘基組成一個β轉角，兩側的殘基是β摺疊構象(圖1)，親水性及疏水性分析顯示該區段呈兩親性(圖2-3)，表面概率計算(圖4)顯示該段位於蛋白質表面，抗原指數計算(圖5)指示該段為一強抗原區。對VP3的分析結果可見其115-133肽段(保守區，表2)也是兩側為β摺疊，中間為β轉角的結構(圖6)。親水性及疏水性分析顯示該段呈兩親性(圖7-8)。經分析，選用CVB4-VP1蛋白上的一段13個胺基酸的肽段(VP1-1肽)，VP3蛋白上的一段19個胺基酸的肽段(VP3-1肽)，進行多肽的固相化學合成。同時在VP3-1肽N端的賴氨酸α氨基上連接上d-生物素，即直接合成了d-生物素標記的VP3-1肽(B-VP3-1肽)。
多肽的合成採用固相化學合成法，多肽粗製品經半製備反相HPLC分離純化，純化的多肽在胺基酸自動分析儀上進行胺基酸組成分析，結果與理論值一致。B-VP3-1肽分子中的生物素基團的數目用HABA-親和素法(Green N.M.，Biochem.J.，9423；1965.)測出，生物素與肽的摩爾比是0.96∶1。
間接ELISA證實VP1-1肽或VP3-1肽與兔抗CVB1、2、3、4、5、6型血清(中和效價分別為1∶160，1∶1280，1∶640，1∶1280，1∶320，1∶1280)均有交叉反應。將VP1-1肽和VP3-1肽分別免疫家兔製備出高效價的抗多肽血清，ELISA效價均達到1∶10000。間接ELISA檢測兔抗VP1-1肽血清或兔抗VP3-1肽血清與CVB1、2、3、4、5、6型病毒亦均有交叉反應。上述結果證實VP1-1肽及VP3-1肽含有CVB1-6的共同抗原表位。實施例2生物素標記的VP1-1肽(B-VP1-1肽)將VP1-1肽用DMSO配成1.2mg/ml，調pH至9.0，加入20mM BAC-DulfoNHS 100μl，室溫下反應2小時，上樣於Sephadex G-25柱，用36％醋酸洗脫，分部收集，測0D280值，收集主峰。
B-VP1-1肽分子中的生物素基團的數目用HABA-親和素法測出，生物素與肽的摩爾比是1.33∶1。實施例3.
間接ELISA檢測患者血清中的CVBIgM抗體VP1-1肽或VP3-1肽用包被液(PH9.6，50mM碳酸鹽緩衝液)稀釋至濃度為10μg/ml，單獨或混合使用VP1-1肽或VP3-1肽包板，100μl/孔，置溼盒中4℃過夜。吸去包被液，用PH7.4，10mM PBS洗3×3分鐘(下同)，加2％BSA/PBS，200μl/孔，37℃，1小時。洗滌，患者血清用1％BSA/PBS1∶640稀釋，100μl/孔，37℃，1小時。洗滌，加HRP標記的兔抗人μ鏈(DAKO，1∶1000)，於37℃孵育30分鐘。洗滌，加入含TMB-過氧化氫的底物溶液，100μl/孔，室溫下30分鐘，用1/2體積的2M硫酸終止反應。450/630nm雙波長下測OD值。每次均設陰性及陽性對照，控制陰性對照的OD值在0.15以內，以待測標本0D值高於陰性對照OD值0.15為陽性。實施例4捕捉IgM抗體ELISA法(MAC-ELISA)檢測患者血清中的CVBIgM抗體兔抗人μ鏈(DAKO)用包被液(PH9.6，50mM碳酸鹽緩衝液)稀釋至濃度為1μg/ml，包板，100μl/孔，置溼盒中4℃過夜。吸去包被液，用PH7.4，10mM PBS洗3×3分鐘(下同)，加2％BSA/PBS，200μl/孔，37℃，1小時，洗滌。患者血清用1％BSA/PBS 1∶640稀釋，100μl/孔，37℃，1小時。洗滌，B-VP1-1肽稀釋成1μg/ml，B-VP3-1肽稀釋成2.5μg/ml，加入稀釋的B-VP1-1肽或/和B-VP3-1肽，100μl/孔，於37℃孵育1小時。洗滌，加預先室溫下孵育30分鐘的ABC複合物(1∶400)，37℃ 1小時，洗滌，加入含TMB-過氧化氫的底物溶液，100μl/孔，室溫下15分鐘，用1/2體積的2M硫酸終止反應。450/650nm雙波長下測OD值。每次均設陰性及陽性對照，控制陰性對照的OD值在0.15以內，以待測標本OD值高於陰性對照OD值0.15為陽性。表1. VP1-1肽的序列與其它型別CVB胺基酸同源性的比較肽 胺基酸序列CVB4-VP1R I Y F K P K H V K A Y VCVB1-VP1R V Y F K P K H V K A W VCVB3-VP1R V Y F K P K H V K A W ICVB5-VP1R V Y F K P K H V K T W V表2. VP3-1肽的序列與其它型別CVB胺基酸同源性的比較肽 胺基酸序列CVB4-VP3K L T F V F C G S A M A T G K F L L ACVB1-VP3K L T F M F C G S A M A T G K F L L ACVB3-VP3K L T F M F C G S A M A T G K F L L ACVB5-VP3K L T F M F C G S A M A T G K F L L A


圖1. VP1-1肽段及其鄰近殘基的二級結構分析(按Chou-Fasman方法所作的四肽平均圖)。圖2. VP1-1肽段及其鄰近殘基的親水性分析。圖3. VP1-1肽段及其鄰近殘基的疏水性分析。圖4. VP1-1肽段及其鄰近殘基的表面概率分析。圖5. VP1-1肽段及其鄰近殘基的抗原性分析。圖6. VP3-1肽段及其鄰近殘基的二級結構分析(按Chou-Fasman方法所作的四肽平均圖)。圖7. VP3-1肽段及其鄰近殘基的親水性分析。圖8. VP3-1肽段及其鄰近殘基的疏水性分析。
權利要求
1.一種檢測柯薩奇B組病毒(CVB)抗體的合成肽試劑。其特徵在於使用含有CVB共同優勢抗原表位的合成肽作為抗原，建立檢測CVBIgM抗體的間接ELISA法和捕捉IgM抗體ELISA法(MAC-ELISA)。
2.按權利要求1所述的檢測柯薩奇B組病毒(CVB)抗體的合成肽試劑，其特徵是所述的合成肽為VP1-1肽和VP3-1肽，VP1-1肽選自CVB4-VP1蛋白，其胺基酸序列為RIYFKPKHVKAYV；VP3-1肽選自CVB4-VP3蛋白，其胺基酸序列為KLTFVFCGSAMATGKFLLA。
3.按權利要求2所述的檢測柯薩奇B組病毒(CVB)抗體的合成肽試劑，其特徵是所述的合成肽VP1-1肽的第二個胺基酸殘基異亮氨酸殘基(I)可以用纈氨酸殘基(V)代替，第十一個胺基酸殘基丙氨酸殘基(A)可以用蘇氨酸殘基(T)代替，第十二個胺基酸殘基酪氨酸殘基(Y)可以用色氨酸殘基(W)代替。
4.按權利要求2所述的檢測柯薩奇B組病毒(CVB)抗體的合成肽試劑，其特徵是所述的合成肽VP3-1肽的第五個胺基酸殘基纈氨酸殘基(V)可以用甲硫氨酸殘基(M)代替。
5.按權利要求1所述的檢測柯薩奇B組病毒(CVB)抗體的合成肽試劑，其特徵是所述的合成肽上標記了生物素，建成檢測CVBIgM抗體的捕捉IgM抗體ELISA法。
全文摘要
本發明屬病毒抗體檢測領域。本發明運用抗原表位預測的方法和合成肽技術確定了柯薩奇B組病毒(CVB)衣殼蛋白VP1上的一段保守區(RIYFKPKHVKAYV)和VP3上的一段保守區(KLTFVFCGSAMATGKFLLA)為CVB的共同優勢抗原表位。應用這兩條代表CVB共同優勢抗原表位的合成肽，建立了檢測CVBIgM抗體的間接ELISA法，同時，在合成肽上標記上生物素後，建立了檢測CVBIgM抗體的捕捉IgM抗體ELISA法(MAC-ELISA)。本發明敏感性和特異性高，操作簡便，檢測速度快，價格合理。
文檔編號G01N33/569GK1157413SQ9611625
公開日1997年8月20日 申請日期1996年2月15日 優先權日1996年2月15日
發明者楊英珍, 楊昌生 申請人:上海市心血管病研究所