具有含基於萘醌的調節劑和FAD‑GDH的酶試劑層的基於電化學的分析測試條的製作方法

2023-09-14 00:08:35 1

技術領域

本發明整體涉及醫療裝置，並且具體涉及基於電化學的分析測試條和在其中使用的酶試劑。

相關領域的描述

醫學領域中特別關注對流體樣本中的分析物或流體樣本的特性的測定(例如，檢測和/或濃度測量)。例如，可期望測定體液諸如尿液、血液、血漿或間質液的樣本中的葡萄糖、酮體、膽固醇、脂蛋白、三甘油酯、對乙醯氨基酚、血細胞比容和/或HbA1c的濃度。可使用基於例如視覺、光度或電化學技術的分析測試條來實現此類測定。常規的基於電化學的分析測試條在例如美國專利5,708,247和6,284,125中有所描述，所述專利中的每個專利據此全文以引用方式併入本文。

附圖說明

併入本文中並且構成本說明書的一部分的附圖示出了本發明的目前優選實施例，並且與上面給出的一般描述和下面給出的詳細描述一起用於說明本發明的特徵，其中：

圖1為根據本發明的實施例的基於電化學的分析測試條的簡化分解透視圖；

圖2是沿其縱向軸線截取的圖1的基於電化學的分析測試條的一部分的簡化橫截面側視圖(未按比例繪製)；

圖3為根據本發明實施方案的酶試劑的線性性能圖；

圖4為根據本發明實施方案的酶試劑的尿酸敏感度的圖；並且

圖5為根據本發明實施方案的另一種酶試劑的線性性能圖。

例示性實施方案的具體實施方式

應結合附圖來閱讀下面的具體實施方式，其中不同附圖中相同元件的編號相同。各附圖未必按比例繪製，僅出於說明的目的示出示例性實施方案，並不旨在限制本發明的範圍。具體實施方式以舉例的方式而不是限制性方式示出本發明的原理。此具體實施方式將清楚地使得本領域的技術人員能夠形成和使用本發明，並且描述了本發明的多個實施方案、改型、變型、替代方案和用途，包括目前據信是實施本發明的最佳模式。

如本文所用，針對任何數值或範圍的術語「約」或「大約」指示允許部件或多個部件的集合執行如本文所述的指定用途的適當公差。

本發明公開了一種根據本發明實施方案的用於測定體液樣本中的分析物(諸如葡萄糖)的基於電化學的分析測試條，該基於電化學的分析測試條包括電絕緣基底層、設置在電絕緣基底層上並且包括至少一個電極的導電層、設置在該至少一個電極上的酶試劑層、圖案化隔層和頂層。此外，酶試劑層包括至少一種基於萘醌的調節劑和FAD-GDH酶。基於萘醌的調節劑可為以下形式：

其中R為有機取代基。

例如，R可為–S-(CH2)n-X，其中n為1-6，通常為2-3，並且X為-SO3H或-COOH。此類基於萘醌的調節劑可為例如1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)和1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)。

酶試劑層還可包含表面活性劑、增稠劑，以及任選的乾燥的緩衝至pH為7的磷酸鹽水溶液。基於萘醌的調節劑可在塗覆至基於電化學的分析測試條期間以大約0.1mM至大約200mM、大約0.175mM、大約175mM或大約40mM範圍內的濃度存在。具體地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)可在塗覆至基於電化學的分析測試條期間以大約0.175mM或大約175mM的濃度存在。另選地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)可在塗覆至基於電化學的測試條期間以大約40mM的濃度存在。

可使用絲網印刷技術或噴墨印刷技術施用酶試劑層。酶試劑層的厚度可在大約0.1微米至大約15微米、大約0.1微米至大約5微米或大約5微米至大約15微米的範圍內。通常，使用絲網印刷技術塗覆酶試劑層，並且厚度在大約5微米至大約15微米的範圍內，或者使用噴墨技術塗覆酶試劑層，並且具有在大約0.1微米至大約5.0微米範圍內的厚度。

體液樣本可為全血樣本，並且分析物可為葡萄糖。

根據本發明實施方案的基於電化學的分析測試條是有利的，因為至少一種基於萘醌的調節劑(例如，1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)和1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)中的至少一種)和FAD-GDH酶的組合形成生化有效(例如，調節劑為雙電子受體，產生不通過自由基途徑進行的酶反應，並且酶反應(對一些基於萘醌的調節劑來說)的一級速率常數大於常規FAD-GDH調節劑鐵氰化鉀的一級速率常數)並且不受來自尿酸、對乙醯氨基酚、穀胱甘肽和抗壞血酸的幹擾影響的酶試劑層。

在根據本發明的基於電化學的分析測試條中使用的酶試劑包含至少一種基於萘醌的調節劑，諸如例如(i)1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)和(ii)1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)中的至少一種；以及黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶，本文縮寫為FAD-GDH酶。此類酶試劑的有利之處在於它們形成生化有效(即，調節劑為雙電子受體並且酶反應不通過自由基途徑進行)並且不受來自尿酸、對乙醯氨基酚、穀胱甘肽和抗壞血酸的幹擾影響的酶試劑層。此外，該酶試劑可在使用常規技術諸如噴墨印刷和絲網印刷製造基於電化學的分析測試條期間施加。

酶試劑可包含緩衝至pH為7的磷酸鹽水溶液、表面活性劑和增稠劑。酶試劑可包含消泡劑。

基於萘醌的調節劑可以大約20mM至大約200mM、大約175mM或大約40mM的濃度存在。具體地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)可以大約175mM的濃度存在。另選地，1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)可以大約40mM的濃度存在。

圖1為根據本發明的實施方案的基於電化學的分析測試條100的簡化分解透視圖。圖2為沿圖1透視圖的縱向軸線截取的基於電化學的分析測試條100的一部分的簡化橫截面側視圖(未按比例繪製)。圖3為根據本發明實施方案的酶試劑的線性性能圖。圖4為根據本發明實施方案的酶試劑的尿酸敏感度的圖。圖5為根據本發明另一個實施方案的酶試劑的線性性能圖。

參考圖1至圖5，用於測定體液樣本(例如，全血樣本)中的分析物(諸如葡萄糖)的基於電化學的分析測試條100包括電絕緣基底層102、圖案化導電層104、圖案化絕緣層106、酶試劑層108、圖案化隔層110，以及由親水性亞層114和頂帶116組成的頂層112。

在圖1和圖2的實施方案中，至少圖案化隔層和頂層限定基於電化學的分析測試條100內的樣本接收室118(具體參見圖2)。

電絕緣基底層102可為本領域的技術人員已知的任何合適的電絕緣基底層，包括例如尼龍基底層、聚碳酸酯基底層、聚醯亞胺基底層、聚氯乙烯基底層、聚乙烯基底層、聚丙烯基底層、糖化聚酯(PETG)基底層或聚酯基底層。電絕緣基底層可具有任何合適的尺寸，包括例如約5mm的寬度尺寸、約27mm的長度尺寸和約0.5mm的厚度尺寸。

電絕緣基底層102向基於電化學的分析測試條100提供結構，以便於處理，並且還用作塗覆(例如，印刷或沉積)後續層(例如，圖案化導電層和通過根據本發明和本文所述酶試劑的噴墨印刷或絲網印刷形成的酶試劑)的基底。

圖案化導電層104設置在電絕緣基底層102上，並且包括第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c。第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c可例如分別被構造為反電極/參考電極、第一工作電極和第二工作電極。因此，第二電極和第三電極在本文中也被稱為工作電極104b和工作電極104c，並且第一電極也被稱為反電極104a。雖然僅用於說明的目的，基於電化學的分析測試條100被描述為包括總共三個電極，但包括本發明的實施方案的基於電化學的分析測試條的實施方案可包括任何合適數量的電極。

基於電化學的分析測試條100的包括第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c的圖案化導電層104可由包括例如基於導電碳的材料的任何合適的導電材料形成，該基於導電碳的材料包括碳墨。應當指出的是，根據本發明的實施方案的基於電化學的分析測試條中所採用的圖案化導電層可採取任何合適的形狀，並且可由任何合適的材料形成，該材料包括例如金屬材料和導電碳材料。

具體地參考圖1和圖2，設置第一電極104a、第二電極104b和第三電極104c以及酶試劑層108，使得基於電化學的分析測試條100被構造用於對已填充的樣本接收室118的體液樣本(諸如全血樣本)中的分析物(諸如葡萄糖)進行電化學測定。此類全血填充的方向在圖2中由標記為「S」的箭頭示出。

酶試劑層108設置在圖案化導電層104的至少一部分上(參見圖1和圖2)。酶試劑層108包括至少一種基於萘醌的調節劑以及FAD-GDH酶。如本文所用的術語「基於萘醌的調節劑」是指以下形式的調節劑：

其中R為任何合適的有機取代基。

適用於本發明實施方案的基於萘醌的調節劑的尤其有利的示例為1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)[在本文中也稱為化合物A]和1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)[在本文中也稱為化合物B]。然而，一旦獲悉本發明，本領域的技術人員便可採用常規試驗選擇合適的有機取代基(即，合適的「R」基團)以形成具有有利的反應動力學、合適的水溶性以及不受幹擾效應影響的其它基於萘醌的調節劑。在此方面，合適的R基團可為例如充分親水的，以賦予調節劑以合適的水溶性。

化合物A的分子式為C13H12S2O5，分子量為312.36，並具有以下結構：

化合物A為橙色的無定形固體，可在室溫下溶於鹼性和中性磷酸鹽緩衝液。化合物A具有以下有利的電化學特性：

相對於Ag/AgCl(0.1M KCl)的E0＝0.086V

kcat＝900s-1

其中E0為相對於Ag/AgCl的形式氧化還原電勢(相比於鐵氰化物的0.25V)，並且kcat為調節劑(即，化合物A)和酶輔助因子FAD之間均勻電子傳遞的速率常數。應當注意，鐵氰化物的E0為0.25V，並且鐵氰化物的kcat為230s-1。化合物A的E0有利地低於鐵氰化物的E0(並因此不易受幹擾物的影響)並且其kcat有利地高於鐵氰化物的kcat。此外，化合物A在40攝氏度下存放26天後表現出對葡萄糖的敏感度沒有下降。

化合物A以如下步驟合成。將1,2-萘醌-4-磺酸鈉鹽(10mmol)加入蒸餾水(100ml)中並攪拌，直到形成澄清的溶液。立即加入3-巰基-1-丙磺酸單鈉鹽(10mmol)，生成深棕色溶液。靜置溶液，12小時之後，將澄清的棕色溶液蒸發至乾燥以得到深黃色固體。用氯仿洗滌深黃色固體並在真空下乾燥以得到作為橙色固體的1,2-萘二酮-4-(3-巰基-1-丙磺酸)(1.48g，47％)。質譜分析確認了該成分。然而，一旦獲悉本公開，本領域的技術人員便可開發用於合成化合物A的其它方法。

化合物B的分子式為C13H10S2O4，分子量為262.28，並具有以下結構：

化合物B為橙色無定形固體，可在室溫下溶於鹼性和中性磷酸鹽緩衝液。化合物A具有以下有利的電化學特性：

相對於Ag/AgCl(0.1M KCl)的E0＝0.016V

kcat＝100s-1

其中E0為相對於Ag/AgCl的形式氧化還原電勢(相比於鐵氰化物的0.25V)，並且kcat為調節劑(即，化合物A)和酶輔助因子FAD之間均勻電子傳遞的速率常數。應當注意，鐵氰化物的E0為0.25V，並且鐵氰化物的kcat為230s-1。化合物B的E0有利地低於鐵氰化物的E0(並因此不易受幹擾物的影響)，並且kcat低於鐵氰化物的kcat，但仍為合適的。此外，化合物B在40攝氏度下存放26天後表現出對葡萄糖的敏感度沒有降低。

化合物B以如下步驟合成。將1,2-萘醌(10mmol)加入甲醇(50ml)中，並於冰中攪拌5分鐘。加入3-巰基丙酸(10mmol)，並且5分鐘內溶液變得澄清，並將其蒸發至乾燥。使用乙酸乙酯作為洗脫液於矽膠中純化深棕色固體，得到1,2-萘二酮-4-(3-巰基丙酸)(1.19g，51％)。質譜分析確認了該組成。然而，一旦獲悉本公開，本領域的技術人員便可開發用於合成化合物B的其它方法。

根據本發明的包括化合物B的酶試劑的示例性但為非限制性的示例包括以下組分：

10ml的緩衝至pH為7的0.1M磷酸鹽水溶液，已向其加入下列組分：

1％(w/v)Pluronic 103，一種以伯羥基基團封端的雙官能嵌段共聚物表面活性劑

2.5％(w/v)羥乙基纖維素，一種增稠劑；

最終濃度為40mM的化合物B

0.05g FAD-GDH

該酶試劑在本文中也稱為「化合物B酶試劑」。

包括化合物A的根據本發明的酶試劑的另一個示例性但為非限制性的示例如下：

100mL的緩衝至pH為7的0.01M磷酸鹽水溶液，已向其加入以下組分：

1％(w/v)二氧化矽

1％(w/v)Pluronic 103

5滴Dow Corning Antifoam 1500(可從VWR International,United Kingdom商購獲得)

5％羥乙基纖維素。

進行軌道式混合之後，加入以下組分：

最終濃度為175mM的化合物A

0.33g FAD-GDH，由Amano Enzyme China Ltd供應

該酶試劑在本文中也稱為「化合物A酶試劑」。

具體地參考圖3和圖4，採用化合物B酶試劑的分析測試條通過在製備期間使用噴墨技術施加酶試劑進行製備。此類噴墨技術通常產生厚度在大約0.1微米至5微米範圍內的最終幹酶層。測試所得分析測試條的結果示出於圖3和圖4中，所述圖示出有利的線性關係，並且不含來自根據本發明實施方案的分析測試條的尿酸的幹擾。

圖3的數據是使用加入某些物質的靜脈全血採集到的，所述靜脈全血來自3個具有正常血細胞比容(即，在的38％至42％範圍內)的代表性供體。圖4的數據比較了該測試條和可商購獲得的基於電化學的分析測試條的性能，並使用YSI血漿葡萄糖濃度為65mg/dL的單個供體血液進行。向血液中加入尿酸，至22mg/dL的最終濃度。與YSI血漿葡萄糖水平的偏差值是按照相關測試儀葡萄糖信號的增加計算並繪製的，所述信號的增加是相對於未添加尿酸的對照組而言的。圖4示出採用化合物B酶試劑的分析測試條沒有幹擾效應。此處未詳述的進一步研究顯示出相似不含對乙醯氨基酚、穀胱甘肽和抗壞血酸的幹擾。

具體地參考圖5，採用化合物A酶試劑的分析測試條通過在製備期間使用絲網印刷技術塗覆酶試劑進行製備。此類絲網印刷技術通常產生厚度在大約5微米至15微米範圍內的最終幹酶層。測試所得分析測試條的結果在圖5中示出，該圖示出根據本發明另一個實施方案的分析測試條的有利線性關係。圖5的數據是使用加入某些物質的靜脈全血採集到的，所述靜脈全血來自3個具有正常血細胞比容(即，在38％至42％範圍內)的代表性供體。

一旦獲悉本公開，本領域的技術人員便將認識到，可配製包含化合物A和/或化合物B和FAD-GDH的多種合適酶試劑。此類合適的酶試劑可包含例如檸檬酸三鈉、檸檬酸、聚乙烯醇、羥乙基纖維素、消泡劑、熱解法二氧化矽(具有或不具有疏水表面改性)、PVPVA和水。一般來講，關於試劑層和基於電化學的分析測試條的更多細節在美國專利6,241,862和6,733,655中，這些專利的內容全部以引用方式併入本文中。

參考圖1和圖2，圖案化絕緣層106可由包括商購獲得的可絲網印刷的介電油墨的任何合適的電絕緣電介質材料形成。

圖案化隔層110可由例如從Apollo Adhesives,Tamworth,Staffordshire,UK商購獲得的可絲網印刷的壓敏粘合劑形成。在圖1和圖2的實施方案中，圖案化隔層110限定樣本接收室118的外壁。圖案化隔層110的厚度可為例如大約110微米，可為非導電的，並且可由具有頂側丙烯酸類壓敏粘合劑和底側丙烯酸類壓敏粘合劑的聚酯材料形成。

例如，頂層112可為具有親水特性的透光膜，該親水特性促進基於電化學的分析測試條100被流體樣本(例如，全血樣本)潤溼和填充。此類透光膜可從例如Minneapolis,Minnesota U.S.A.的3M和Coveme(San Lazzaro di Savena,Italy)商購獲得。頂層112可為例如塗覆有表面活性劑的聚酯膜，該表面活性劑提供小於10度的親水性接觸角。頂層112也可為塗覆有表面活性劑或其它表面處理的聚丙烯膜。在此類情況下，表面活性劑塗層用作圖案化親水性亞層114。頂層112可具有例如約100μm的厚度。

可製造基於電化學的分析測試條100，例如通過以圖案化導電層104、圖案化絕緣層106、酶試劑層108、圖案化隔層110和頂層112的順序排列形成。可使用本領域的技術人員已知的任何合適的技術來實現此類順序排列形成，所述技術包括例如絲網印刷、噴墨印刷、照相平版印刷、照相凹版印刷、化學氣相沉積和條帶層合技術。然而，根據本發明實施方案的酶試劑尤其有用，因為可將它們配製成適用於成本相對較低並且原本也是常見的噴墨印刷技術和絲網印刷技術的含水組合物。例如，可採用此類酶試劑，以在高達至少700mg/dL的葡萄糖濃度的全血樣本中，產生具有電化學生成的電流和葡萄糖濃度之間的線性響應的酶試劑層。

雖然本文已示出和描述了本發明的優選實施方案，但對本領域的技術人員顯而易見的是，此類實施方案僅作為舉例提供。在不脫離本發明的情況下，本領域的技術人員可以設想出各種變型、更改和替代形式。應當理解，本文所述的本發明實施方案的多種另選形式可用於實施本發明。以下權利要求書旨在限定本發明的範圍，並覆蓋落入這些權利要求的範圍內的裝置和物質的組成及其等同物。