吡嗪類化合物及其製備方法、用途與流程
2023-09-14 08:54:15 1
本發明涉及植物提取領域，特別涉及化合物及其製備方法、用途。
背景技術：
天然芳香性成分和天然香料是一類重要的高附加值化工產品，主要應用於食品、化妝品及醫藥等領域。目前在香型種類較為固定的背景下，開發出一類全新新香型的化學成分將會特別受到人們的歡迎，具有巨大的市場前景。
吡嗪類化合物是一種國際上公認的香料類型，在市場上有廣泛的應用，尤其在食品領域。吡嗪類化合物具有典型的燒烤香味特點，是高檔雪茄、白酒、咖啡、茶葉、香腸、烤肉等飲料和食品的主要香型成分，深受人們喜歡。
韭菜，屬百合科多年生草本植物，具特殊強烈氣味，根莖橫臥，鱗莖狹圓錐形，簇生；鱗式外皮黃褐色，網狀纖維質；葉基生，條形，扁平；傘形花序，頂生。葉、花葶和花均作蔬菜食用；種子等可入藥，具有補腎，健胃，提神，止汗固澀等功效。在中醫裡，有人把韭菜稱為「洗腸草」。韭菜適應性強，抗寒耐熱，全國各地到處都有栽培。韭菜又叫起陽草，是中國傳統蔬菜，味道非常鮮美，還有獨特的香味，已有3000多年的食用歷史。韭菜含有揮發性的硫化丙烯，因此具有辛辣味，有促進食慾的作用。韭菜除做菜用外，還有良好的藥用價值。其根味辛，入肝經，溫中，行氣，散瘀，葉味甘辛鹹，性溫，入胃，肝，腎經，溫中行氣，散瘀。韭菜活血散瘀，理氣降逆，溫腎壯陽，韭汁對痢疾桿菌，傷寒桿菌，大腸桿菌，葡萄球菌均有抑制作用。《本草綱目》中說："韭籽補肝及命門，治小便頻數，遺尿，"民間常用韭菜治療身體虛弱，肺結核盜汗，噎嗝反胃，婦女產後血暈，吐清水及跌打刀傷腫痛，神經性和過敏性皮炎，新生小兒硬皮症等。
目前的研究報導將韭菜的獨特香味歸因於其所含硫化物，但硫化物的成分在大蒜或蔥中也含有，但其氣味與韭菜完全不同，因此未見韭菜中特異性香型成分的相關報導。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明提供了化合物及其製備方法、用途。該4種化合物均具有特殊的燒烤香味，且化合物從常吃蔬菜中提取得到，無任何毒副作用，可以安全食用。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了一種化合物，其結構如式V所示：
其中：
R1選自或CH3；
R2選自H或CH3；
R3選自或H；
R4選自H、
在本發明的一些具體實施方案中，所述化合物的結構如下所示：
式I：R1＝R2＝H R3＝R4＝H
式II：R1＝R2＝CH3 R3＝H R4＝
式III：R1＝R2＝H R3＝H R4＝
式IV：R1＝CH3 R2＝CH3 R3＝H R4＝
本發明還提供了所述化合物的製備方法，包括如下步驟：
步驟1：取韭菜粉碎後經有機溶劑浸提，獲得粗提物；
步驟2：取所述粗提物分離，純化，鑑定；
所述分離包括第一分離和第二分離；
所述第一分離採用大孔吸附樹脂分離，淋洗採用有機溶劑淋洗；
所述第二分離為取第一分離後的收集物與水混合採用凝膠柱分離，淋洗，收集餾分；
步驟1或步驟2中所述有機溶劑選自乙醇；
步驟1中所述有機溶劑的體積分數為95％；步驟2中所述第一分離中所述有機溶劑的體積分數為15％～30％。
在本發明的一些具體實施方案中，所述第二分離中的淋洗為使用5倍柱體積淋洗，所述收集餾分為每150mL收集一個餾分。
在本發明的一些具體實施方案中，所述目的餾分為體積分數為15％的有機溶劑的第10次餾分和體積分數為30％的有機溶劑的第4次餾分。
在本發明的一些具體實施方案中，所述純化為取分離的產物經高效液相色譜分離，收集保留時間為10.50～43.50min的產物。
在本發明的一些具體實施方案中，所述純化具體為：取體積分數為15％的有機溶劑的第10次餾分經高效液相色譜分離，流動相為體積分數為25％的甲醇，收集保留時間為33.50～35.00min內的產物，得到化合物Ⅰ。
在本發明的一些具體實施方案中，，所述純化具體為：取體積分數為30％的有機溶劑的第4次餾分經高效液相色譜分離，流動相為體積分數為48％的甲醇，收集保留時間為20.75～21.25min的產物，得到化合物Ⅱ；
取體積分數為30％的有機溶劑的第4次餾分經高效液相色譜分離，流動相為體積分數為48％的甲醇，收集保留時間為21.50～22.50min的產物，得到化合物Ⅲ；
取體積分數為30％的有機溶劑的第4次餾分經高效液相色譜分離，流動相為體積分數為48％的甲醇，收集保留時間為10.50～12.00min的產物，再經高效液相色譜分離，流動相體積分數為40％的甲醇，收集保留時間為42.25～43.50min的產物，得到化合物Ⅳ。
本發明還提供了所述的化合物或所述的製備方法製得的化合物作為食品添加劑的應用。
本發明還提供了所述的化合物或所述的製備方法製得的化合物在食品中的應用。
通過UV、ESI-MS、HRESIMS、1HNMR、13CNMR等技術對四種新化合物進行結構鑑定，明確其構型。該4種化合物均具有特殊的燒烤香味，且化合物從常吃蔬菜中提取得到，無任何毒副作用，可以安全食用。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1示4種化合物純化後的氣相檢測圖。
圖2示I化合物的質譜圖。
圖3示II化合物的質譜圖。
圖4示III化合物的質譜圖。
圖5示IV化合物的質譜圖。
具體實施方式
本發明公開了化合物及其製備方法、用途，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明提供了從韭菜中分離出的四種有特異性香型的新化合物，如式Ⅴ所示：
其中：
R1選自或CH3；
R2選自H或CH3；
R3選自或H；
R4選自H、
具體的，本發明提供的化合物包括：
I：R1＝R2＝H R3＝R4＝H
II：R1＝R2＝CH3 R3＝H R4＝
III：R1＝R2＝H R3＝H R4＝
IV：R1＝CH3 R2＝CH3 R3＝H R4＝
本發明提供了從韭菜中分離出的四種有特異性香型的新化合物，如式(I、II、III、IV)所示。
本發明的新化合物可以通過下列方法得到：
步驟1製備韭菜提取物：
40kg鮮韭菜樣品經過淋洗去除泥土等雜質，使用中藥材樣品粉碎機粉碎後置於50L提取罐中。加入40L 95％乙醇浸提48h，將浸提液取出，過布氏漏鬥後減壓濃縮至適當體積；重複上述步驟4次，合併濃縮後的浸提液，冷凍乾燥，將凍幹後的粗提物稱重，共得到粗提物粉末158.5g；
步驟2對韭菜粗提物粉進行柱分離：
食品級95％(體積比)的乙醇浸漬大孔吸附樹脂(HP-20)4小時，然後用蒸餾水淋洗至流出液在玻璃柱中用水稀釋不渾濁時為止，然後用水反覆洗滌，至酒精計測量乙醇含量降為1％以下；將步驟1得到的158.5g粗提物溶於水後使用大孔吸附樹脂進行初步分離，分別使用30L水、15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇以及95％乙醇進行淋洗，共獲得5個不同餾分，分別濃縮後冷凍乾燥，稱重後分別為15.7g、31.5g、20.3g、22.6g以及32.3g；根據所需填充玻璃柱體積大小稱取定量300g的葡聚糖凝膠(LH-20)置於玻璃燒杯中，使用甲醇進行溶脹4h，將溶脹充分的葡聚糖凝膠裝填於玻璃柱中，用水反覆洗滌，至甲醇被完全替換，然後將通過大孔吸附樹脂分離得到各餾分分別溶於水中，過濾，將得到的濾液分別過裝填好的凝膠柱，使用5倍柱體積進行淋洗，每150mL收集一個餾分，依次為15％-1到15％-30共計30瓶餾分；30％-1到30％-40共計40瓶餾分，將收集得到的各餾分分別濃縮、冷凍乾燥，並通過高效液相色譜進行檢測；
步驟3分離純化：
通過液相檢測之後，將步驟2得到的餾分15％-10(25.2mg)、30％-4(55.2mg)分別溶於水中，使用製備高效液相色譜進行分離純化，使用的製備色譜柱為YMC-Pack ODS-AQ(250mm×20mm i.d.S-5μm，12nm)，流動相為甲醇-水，體積流量6mL/min，檢測器為SPD-20A紫外檢測器；
使用製備高效液相色譜對餾分15％-10進行分離製備，流動相為25％甲醇，收集保留時間為33.50-35.00min段內的樣品，將得到的餾分在40℃條件下進行減壓濃縮，-80℃條件下冷凍乾燥，得到化合物Ⅰ共計7.2mg；
使用製備高效液相色譜對餾分30％-4進行分離製備，流動相為48％甲醇，收集保留時間為10.50-12.00min、20.75-21.25min、21.50-22.50min段內的樣品，分別記做30％-4-1、30％-4-7、30％-4-8。
將得到的餾分30％-4-7、30％-4-8在40℃條件下進行減壓濃縮，-80℃條件下冷凍乾燥，得到化合物Ⅱ(30％-4-7)：7.6mg，化合物Ⅲ(30％-4-8)：8.5mg；
使用製備高效液相色譜對餾分30％-4-1(15.2mg)進行純化，流動相為40％甲醇，收集保留時間為42.25-43.50min段內的樣品，將得到的餾分在40℃條件下進行減壓濃縮，-80℃條件下冷凍乾燥，得到化合物Ⅳ共計6.8mg；
步驟4結構鑑定：
通過高效液相色譜、氣相色譜-質譜聯用等進行純度分析；通過液相檢測，柱溫:25℃，流速為1ml/min，流動相為15％的甲醇/0.005甲酸水，等度衝洗，時間20分鐘，檢測器為二極體陣列(PDA)檢測器，波長220nm。通過GC檢測，柱溫：初始50℃，以4℃/min升至160℃。8℃/min升至250℃/min。進樣口溫度240℃，轉移線溫度280℃/min，載氣，高純氦氣，柱壓24kPa。EI源：全掃描方式。
通過UV、ESI-MS、HRESIMS、1HNMR、13CNMR等技術對四種新化合物進行結構鑑定，明確其構型。該4種化合物均具有特殊的燒烤香味，且化合物從常吃蔬菜中提取得到，無任何毒副作用，可以安全食用。
本發明提供的化合物及其製備方法、用途中所用原料及試劑均可由市場購得。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例1製備韭菜提取物
40kg鮮韭菜樣品經過淋洗去除泥土等雜質，使用中藥材樣品粉碎機粉碎後置於50L提取罐中。加入40L 95％乙醇浸提48h，將浸提液取出，過布氏漏鬥後減壓濃縮至適當體積；重複上述步驟4次，合併濃縮後的浸提液，冷凍乾燥，將凍幹後的粗提物稱重，共得到粗提物粉末158.5g。
實施例2對韭菜粗提物粉進行柱分離
食品級95％(體積比)的乙醇浸漬大孔吸附樹脂(HP-20)4小時，然後用蒸餾水淋洗至流出液在玻璃柱中用水稀釋不渾濁時為止，然後用水反覆洗滌，至酒精計測量乙醇含量降為1％以下；將步驟1得到的158.5g粗提物溶於水後使用大孔吸附樹脂進行初步分離，分別使用30L水、15％乙醇、30％乙醇、50％乙醇以及95％乙醇進行淋洗，共獲得5個不同餾分，分別濃縮後冷凍乾燥，稱重後分別為15.7g、31.5g、20.3g、22.6g以及32.3g；根據所需填充玻璃柱體積大小稱取定量300g的葡聚糖凝膠(LH-20)置於玻璃燒杯中，使用甲醇進行溶脹4h，將溶脹充分的葡聚糖凝膠裝填於玻璃柱中，用水反覆洗滌，至甲醇被完全替換，然後將通過大孔吸附樹脂分離得到各餾分分別溶於水中，過濾，將得到的濾液分別過裝填好的凝膠柱，使用5倍柱體積進行淋洗，每150mL收集一個餾分，依次為15％-1到15％-30共計30瓶餾分；30％-1到30％-40共計40瓶餾分，將收集得到的各餾分分別濃縮、冷凍乾燥，並通過高效液相色譜進行檢測。
實施例3分離純化
通過液相檢測之後，將步驟2得到的餾分15％-10(25.2mg)、30％-4(55.2mg)分別溶於水中，使用製備高效液相色譜進行分離純化，使用的製備色譜柱為YMC-Pack ODS-AQ(250mm×20mm i.d.S-5μm，12nm)，流動相為甲醇-水，體積流量6mL/min，檢測器為SPD-20A紫外檢測器；
使用製備高效液相色譜對餾分15％-10進行分離製備，流動相為25％甲醇，收集保留時間為33.50-35.00min段內的樣品，將得到的餾分在40℃條件下進行減壓濃縮，-80℃條件下冷凍乾燥，得到化合物Ⅰ共計7.2mg；
使用製備高效液相色譜對餾分30％-4進行分離製備，流動相為48％甲醇，收集保留時間為10.50-12.00min、20.75-21.25min、21.50-22.50min段內的樣品，分別記做30％-4-1、30％-4-7、30％-4-8。
將得到的餾分30％-4-7、30％-4-8在40℃條件下進行減壓濃縮，-80℃條件下冷凍乾燥，得到化合物Ⅱ(30％-4-7)：7.6mg，化合物Ⅲ(30％-4-8)：8.5mg。
使用製備高效液相色譜對餾分30％-4-1(15.2mg)進行純化，流動相為40％甲醇，收集保留時間為42.25-43.50min段內的樣品，將得到的餾分在40℃條件下進行減壓濃縮，-80℃條件下冷凍乾燥，得到化合物Ⅳ共計6.8mg。
實施例4結構鑑定
通過高效液相色譜、氣相色譜-質譜聯用等進行純度分析；通過液相檢測，柱溫:25℃，流速為1ml/min，流動相為15％的甲醇/0.005甲酸水，等度衝洗，時間20分鐘，檢測器為二極體陣列(PDA)檢測器，波長220nm。通過GC檢測，柱溫：初始50℃，以4℃/min升至160℃。8℃/min升至250℃/min。進樣口溫度240℃，轉移線溫度280℃/min，載氣，高純氦氣，柱壓24kPa。EI源：全掃描方式。
通過UV、ESI-MS、HRESIMS、1HNMR、13CNMR等技術對四種新化合物進行結構鑑定，並CD測定和ECD計算，明確其構型。
新化合物I為無色油狀,有特殊的燒烤香氣。通過高分辨質譜數據(m/z169.0965[M+H]+,calculated 169.0977)，確定其分子式為,C8H12N2O2.
新化合物II為無色油狀,有特殊的燒烤香氣.通過高分辨質譜數據(m/z153.1020[M+H]+,calculated 153.1028)，確定其分子式為,C8H12N2O.
新化合物III為無色油狀,有特殊的燒烤香氣。通過高分辨質譜數據HRESIMS(m/z 153.1027[M+H]+,calculated 153.1028)，確定其分子式為,C8H12N2O.
新化合物IV為無色油狀,有特殊的燒烤香氣.通過高分辨質譜數據HRESIMS(m/z 153.1027[M+H]+,calculated 153.1028)，確定其分子式為,C8H12N2O.
表1.四種新化合物的1H和13C核磁數據(500MHz for 1H和125MHz for 13C)a
a1,2和3溶劑為DMSO-d6和4溶劑為MeOD
實施例5四種化合物氣味感官鑑評試驗
1、鑑評小組人員：選用成年男女6名，男鑑評員年齡範圍為25-50歲，平均年齡35歲，女鑑評員年齡範圍為22-45歲，平均年齡31歲，以上鑑評員均無鼻咽病史和吸菸史，實驗前一天並無接觸任何辛辣刺激氣味及使用特殊香味化妝品。
2、鑑評環境：鑑評室光線充足、柔和適宜；溫度為25℃，溼度60％，恆溫恆溼，空氣新鮮，無香味及邪雜氣味。
3、鑑評器械：無色玻璃10ML西林瓶
4、氣味感官評定方法(參照中華人民共和國輕工業部食品發酵工業科學研究所提出標準)：
①色澤
將西林瓶中的樣品在明亮處觀察，記錄其色澤、粘稠程度、清亮程度、沉澱及懸浮物情況。
②香氣
用鼻進行聞嗅，至西林瓶於鼻下5-8cm左右，頭略低，輕嗅其氣味，記錄其香氣特徵。
5鑑評結果見表2。
表2鑑評結果統計表
該4種化合物均具有特殊的燒烤香味，且化合物從常吃蔬菜中提取得到，無任何毒副作用，可以安全食用。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。