一種快速定量評價藥物核酸相互作用的方法

2023-09-14 03:01:30 1

專利名稱：一種快速定量評價藥物核酸相互作用的方法
技術領域：
本發明屬於化學與物理科學，具體涉及晶片電泳技術；特別提供了一 種使用專用的陣列微流控晶片對藥物核酸相互作用進行定量評價的方法。
背景技術：
核酸分子是多態的(包括序列、結構等)，在它們的結構中往往含有特 定的位點作為一些藥物的作用靶點， 一些藥物與核酸作用會導致核酸的裂 解或者空間螺旋結構的畸變，而許多這些核酸-藥物的相互作用能顯示出生 物學和臨床藥學方面的效能，如抑制腫瘤細胞增長、病毒、細菌、真菌 和寄生蟲感染等，因此，研究核酸-藥物的相互作用對藥物設計、開發性研 究和臨床用藥有極其重要的指導意義。儘管目前已有很多基於核酸靶點的 藥物應用於臨床治療，但是這些藥物往往具有很大的毒性；另一方面，這 些藥物的作用機理大都不十分明確。現有報導的藥物與核酸作用的方式有 三種共價結合、非共價結合和斷裂作用。共價結合主要表現為核酸的烷 基化、鏈間交聯和鏈內交聯等，其中以順鉑和卡鉑為典型代表藥物。非共 價結合則以嵌插結合和溝區結合二種方式進行，其中溝區結合包括大溝區 結合和小溝區結合，以紡錘菌素為代表藥物。而博來黴素類抗腫瘤藥物是 一類天然存在的糖肽類抗生素，這類藥物直接作用於腫瘤細胞的核酸，使 核酸鏈斷裂和裂解，最終導致腫瘤細胞的死亡。闡明藥物和核酸之間相互 作用的本質，包括作用位點、作用模式、序列長短的影響、誘導結構變化
等等，是生物學家、化學家以及藥學家研究的熱點。
定量評價核酸-藥物的相互作用是藥物研發過程中的重要環節。對於開 發新型核酸結合藥物的需求促進了多種定量方法的發展，例如核磁共振、
拉曼光譜、電噴霧質譜、圓二色譜、紫外光譜、x-射線單晶衍射、足跡法
和毛細管電泳分離等方法已經被應用於定量評價核酸-藥物的相互作用。一 般來說，簡單快速的方法不能得到更高的信息量，而相對信息量大的方法 卻有耗時和高儀器要求的。因此，引入一種高信息量、低樣品消耗和快速 簡單的分析方法能夠極大地促進核酸-藥物相互作用的研究。更進一步地， 為了滿足不斷增長的分析同量的要求，發展一種具有平行分析多個樣品能 力的技術更為重要。
微流控晶片以其高效、快速、微量及便於自動化等特點，已經被廣泛用 於生物分子的分析測定。而陣列微流控晶片以其高通量平行分析的能力在 基因測序和分析領域發揮了重要的作用。將陣列微流控晶片應用到定量評 價藥物核酸相互作用領域對研製和開發作用於核酸靶藥物具有重要的意 義。

發明內容
本發明的目的是提供一種快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，即 使用專用的陣列微流控晶片對藥物核酸相互作用進行定量評價。
本發明提供了一種快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在 於使用專用的陣列微流控晶片對藥物核酸相互作用進行定量評價；
所述的陣列微流控晶片由四組平行的電泳單元(電泳單元是指可提供 分析物在高壓直流電場下定向運動，並根據分析物在該電場中的遷移速度 的不同進行分離和分析的微通道系統。)組成，每個電泳單元(1)由樣品
池(2)、進樣通道(3)、緩衝液儲液池(4)、分離通道(5)、緩衝液廢液 池(6)組成。 方法過程為
將晶片電泳緩衝液放入陣列微流控晶片緩衝液儲液池(4)中，並充滿 分離通道(5)和進樣通道(3);
將不同藥物-核酸濃度配比的混合樣品分別放入的樣品池(2);
然後對樣品池(2)和緩衝液廢液池(6)之間施加電壓進行進樣；
進樣完成後，在緩衝液儲液池(4)和緩衝液廢液池(6)之間施加電 壓，進行電泳分離和檢測。記錄核酸的峰高峰面積變化，用於計算藥物核 酸的結合常數，定量評價相互作用。
本發明提供的快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於 所述的每個電泳單元的組成部分結構相同或成鏡像對稱，分離通道(5)在 檢測區域集中排列。
本發明提供的快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於 所述的進樣通道(3)或分離通道(5)的深度或寬度的範圍為10 100微 米。進樣通道(3)或分離通道(5)的最適宜深度尺寸是10 20微米。深 度太淺，進樣量過小，對檢測器靈敏度要求很高，不宜匹配；深度太深， 晶片製作耗時長，物料成本增加，並且對分離造成負面的影響。從理論上 講，進樣通道(3)或分離通道(5)的寬度越窄越好，通道越窄越有利於 所針對的可操作物質的分離，但窄的通道不宜製作且容易堵塞，因此一般 40 60微米的寬度較好，既可以滿足分離要求，也可以滿足晶片的製作。
本發明提供的快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於 所述陣列微流控晶片中的不同的電泳單元中所使用的緩衝液是同一種緩衝 液。該緩衝液能溶解進行相互作用的所有藥物和核酸。電泳過程常用一些 緩衝液作為運行溶液，例如磷酸緩衝液、硼砂緩衝液和醋酸緩衝液等。
本發明提供的快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於 藥物-核酸的混合樣品中濃度比例範圍為0.5: 1~2: 1。
本發明提供的快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於 所述各個電泳單元使用的電泳場強一致，場強範圍為150 1000伏/釐米。 一般從低場強向高場強逐次實驗確定所用的場強，其最佳範圍是300 600
伏/釐米。
本發明提供的快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於
所述的檢測器同時檢測多個通道，在各分離通道的相同位置同時採集信號，
通常採用電荷藕合器件圖像傳感器(CCD)的採集系統。
多個平行的電泳單元公用一個緩衝液池(4)是為了方便操作，在本發 明所進行的實驗中均採用此種設計。公用的緩衝液廢液池(6)就是用來存 儲廢液的，沒有其他特殊用途。採用獨立的緩衝液廢液池當然也可以實現 本發明的目的。
微流控晶片技術是當前儀器分析的研究熱點，該技術主要以分析化學 和生物化學為基礎，利用微機電加工技術，在矽、玻璃、石英、高聚物表 面加工出10-100微米的微通道網絡，主要以電滲流和電泳流為驅動力，通 過改變驅動電壓，控制流體在微通道網絡中的流動方向和速率，不僅易於 實現對目標分析物的採樣、稀釋、富集、萃取、混合、反應、分離、檢測
等操作，而且易於將操作單元陣列化。迄今為止，採用多組平行電泳單元 進行快速定量評價藥物核酸相互作用的報導還沒有。本發明創造性地設計 了用於定量評價藥物核酸相互作用的陣列微流控晶片，可實現多個不同樣
品的同時分離測定。整個過程在50秒內完成，樣品消耗在微升級。本發明 與液相色譜，核磁共振，微孔板等傳統相互作用研究方法相比，具有直接、 快速、操作簡單和樣品用量少等優勢。
總之，本發明可在一塊幾平方釐米的塑料、玻璃或石英晶片上，在短 時間內完成多個樣品的分離分析，並利用得到的數據計算藥物核酸的結合 常數，進而定量評價藥物核酸的相互作用。相對於現有技術而言，本發明 具有直接、快速、操作簡單和樣品用量少的特點，具有可預見的巨大的科 學價值和經濟價值。


圖1為陣列微流控晶片的結構圖，
圖2為螢光標記核酸的電泳譜圖，
圖3為不同濃度的紡錘菌素核酸混合物的電泳譜圖；
具體實施例方式
實施例1
對螢光標記的核酸測定。本實驗所用晶片為圖1所示含四個電泳單元 的玻璃晶片，通道寬50拜，深15脾。緩衝液放入緩衝液儲液池(4)，並 應用負壓將緩衝液充滿分離通道(5)和廢液池(6),將l(HiM螢光標記的 核酸混合10pM內標物螢光素，將四份樣品加入到樣品池(2)。在樣品池 (2)和廢液池(6)之間加電壓(場強400V)，時間6秒，然後切換電壓 至緩衝液儲液池(4)和廢液池(6)之間(場強400V)，樣品池(2)施加 抑制電壓以防止樣品洩漏，在距離進樣點3 cm處檢測(結果見圖2)。從 圖中可以看出，各個分離通道之間螢光標記的核酸與內標物的峰高峰面積 比例基本一致，整個分析過程在50秒內完成。 實施例2
對紡錘菌素(netropsin)和核酸的結合常數測定。本實驗所用晶片為圖 l所示含四個電泳單元的玻璃晶片，通道寬50pm,深15nm。緩衝液放入 緩衝液儲液池(4)，並應用負壓將緩衝液充滿分離通道(5)和廢液池(6)， 將紡錘菌素和螢光標記的核酸按0.5: 1-2: l濃度比例混合(加入10nM內 標物螢光素)，將四種不同濃度比例的混合溶液加入到樣品池(2)。在樣品 池(2)和廢液池(6)之間加電壓(場強400V)，時間6秒，然後切換電 壓至緩衝液儲液池(4)和廢液池(6)之間(場強400V)，樣品池(2)施 加抑制電壓以防止樣品洩漏，在距離進樣點3 cm處檢測(結果見圖3)。 從圖中可以看出，隨著紡錘菌素加入濃度的增加，內標物峰高峰面積不變, 核酸峰高、峰面積下降。整個分析過程在50秒內完成。
權利要求
1.一種快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於使用專用的陣列微流控晶片對藥物核酸相互作用進行定量評價；所述的陣列微流控晶片由四組平行的電泳單元(1)組成，每個電泳單元由樣品池(2)、進樣通道(3)、緩衝液儲液池(4)、分離通道(5)、緩衝液廢液池(6)組成；方法過程為將晶片電泳緩衝液放入陣列微流控晶片緩衝液儲液池(4)中，並充滿分離通道(5)和進樣通道(3)；將不同藥物-核酸濃度配比的混合樣品分別放入的樣品池(2)；然後對樣品池(2)和緩衝液廢液池(6)之間施加電壓進行進樣；進樣完成後，在緩衝液儲液池(4)和緩衝液廢液池(6)之間施加電壓，進行電泳分離和檢測，記錄核酸的峰高峰面積變化，用於計算藥物核酸的結合常數，定量評價相互作用。
2、 按照權利要求l所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特 徵在於所述的每個電泳單元(1)的組成部分結構相同或成鏡像對稱，分 離通道(5)在檢測區域集中排列。
3、 按照權利要求l所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特 徵在於所述的進樣通道(3)和分離通道(5)的深度或寬度的範圍為10 100微米。
4、 按照權利要求3所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特 徵在於所述的進樣通道(3)和分離通道(5)的深度範圍為10 20微米， 寬度的範圍為40 60微米。
5、 按照權利要求l所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特 徵在於所述陣列微流控晶片中的不同的電泳單元中所使用的緩衝液是同 一種緩衝液。
6、 按照權利要求l所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特 徵在於藥物-核酸的混合樣品中濃度比例範圍為0.5: 1~2: 1。
7、 按照權利要求l所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特 徵在於所述各個電泳單元使用的電泳場強一致，場強範圍為150 1000 伏/釐米。
8、 按照權利要求7所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特 徵在於所述各個電泳單元使用的電泳場強一致，場強範圍為300 600伏/釐米。
9、 按照權利要求l所述快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於所述的檢測器同時檢測多個通道，在各分離通道的相同位置同時採集信號。
全文摘要
一種快速定量評價藥物核酸相互作用的方法，其特徵在於使用專用的陣列微流控晶片對藥物核酸相互作用進行定量評價。相對於現有的技術，本發明具有直接、快速、操作簡單和樣品用量少的特點，對作用於核酸靶藥物的高通量篩選有廣泛的應用。
文檔編號C12Q1/68GK101372709SQ20071001257
公開日2009年2月25日 申請日期2007年8月24日 優先權日2007年8月24日
發明者戴忠鵬, 林炳承, 錚 沈, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所