異鼠李醇在食管癌化學預防中的應用的製作方法

2023-09-14 05:39:40

本申請屬於癌症治療和預防技術領域，具體涉及異鼠李醇在食管癌化學預防中的應用。

背景技術：

食管癌在世界上是最常見的惡性腫瘤，在導致癌症死亡最常見的腫瘤中，位居第六位，預後非常差，五年生存率僅為8~12%。食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）是食管癌的兩個主要組織學類型。ESCC是發展中國家最常見的亞型，但在美國和其他西方國家食管癌主要是EAC。近年來，儘管食管癌早期診斷、早期發現技術有了很大進步，標準的化療和放療已在臨床上應用了幾十年，但大多數臨床中晚期病人的整體生存率仍無明顯改善，提示了僅強調腫瘤早期發現和治療而忽視腫瘤預防，結果收效甚微。

癌症是否可以預防？早在20世紀80年代中期，世界衛生組織（WHO）就已經明確地提出了3個1/3的觀點，即1/3的癌症可以預防，1/3的癌症患者可以治癒，1/3的患者積極治療後可以提高生活質量，延長生存期。現有研究認為，食管癌變是一個多階段進行性發展過程(正常－基底細胞增生－不典型增生－原位癌－食管鱗狀細胞癌），並確立了癌前病變的概念。食管癌前病變呈現明顯的雙向發展的不穩定特性，即這些病變可向癌的方向發展，也可退回到較輕度的病變，或維持同一狀態多年不變。食管癌癌前病變的這一特點提示如果在早期介入幹預，癌前病變可能被逆轉或發展過程被阻斷，從而抑制食管癌的發生和發展。更好地了解食管癌癌前病變的基因和/或癌前病變發生機制會對確定癌前病變發展的關鍵分子起決定作用，因此，需要開發針對這些關鍵基因的安全、有效的靶向藥物，進而逆轉，抑制，或停止癌前病變進一步進展為癌症。因此構建能夠模擬食管癌發生發展過程的動物模型可以為食管癌化學預防提供一個好的思路。

食管癌發生發展是環境因素和基因相互作用的結果。通過對河南地區食管癌高發區人群的流行病學調查研究，發現甲基苄基亞硝胺（N-nitrosomethylbenzylamine，NMBA）與食管癌的發生具有密切的正相關性。目前NMBA誘導的大鼠食管鱗狀細胞癌變模型，廣泛地用於評估食管癌的病理生理學過程，以確認化學預防藥物在人類試驗中的應用前景。大鼠從正常的食管上皮發展為鱗狀細胞癌經歷了增生、黏膜白斑、不典型增生、乳頭狀瘤，這種應變反應與人類病變過程極為相似，可以充分模擬人食管上皮癌變的過程，採用該動物模型可以進一步探討食管癌變過程的分子機制，從而為尋找分子靶標，並為進一步篩選幹預或者延緩食管癌發生發展的癌症化學預防藥物提供了一個平臺。

食管癌化學預防研究中，除了維生素和多種微量元素外，多種化合物也被用來嘗試進行食管癌的化學預防研究，如茶多酚、凍乾草莓、沒食子酸、抗氧化類及非甾體類抗炎藥物等，這些化合物通過不同的靶向分子預防食管癌的發生和發展，但其作用機制還需要更深入地研究。但根據預先確定的食管癌預防靶點，篩選安全性好、效率好、低毒的化合物是開展食管癌預防的基礎設計目標。

異鼠李醇是多種藥用植物中的一種槲皮素衍生物。槲皮素為一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在於多種中藥，研究表明，槲皮素通過調節癌基因 c-fos 和 c-jun 基因表達，以及抑癌基因 p53、p21、p27，癌基因 c-myc、c-src 等的表達發揮抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡的作用，並且對MEK-ERK、STAT3等信號傳導通路都具有調控作用。異鼠李醇的同分異構體異鼠李素在腫瘤中的研究也非常多，異鼠李素能通過降低凋亡抑制基因bcl-2表達、增加促凋亡蛋白Bax的數量以及激活caspase活性誘導腫瘤細胞凋亡，並且對 MEK-ERK、PKC、JNK等信號傳導通路都具有調控作用。而關於異鼠李醇抗腫瘤作用的研究非常少，異鼠李醇僅僅在皮膚癌和乳腺癌中研究報導過，在皮膚癌中，異鼠李醇通過其靶點Erk阻止皮膚癌細胞的轉化過程，同時其還可以抑制乳腺癌細胞的增殖。而關於異鼠李醇與食管癌的關係則缺少相應的研究。

技術實現要素：

本發明通過構建NMBA誘導的大鼠食管癌變的動物模型，對於異鼠李醇與食管癌癌變關係進行了初步研究，證明了異鼠李醇可以用於預防食管癌的癌變，具有較好地潛在應用價值。

本發明所採取的技術方案如下所述。

異鼠李醇在食管癌化學預防中的應用，用於預防食管上皮的癌變過程。

具體而言，異鼠李醇用於食管上皮永生化細胞（SHEE細胞）時，10μM濃度以下時對於細胞毒性較小，且可抑制食管上皮永生化細胞轉化；

用於預防食管癌病變時，按70~350mg/m2劑量應用；進一步而言，用於大鼠時， 70~350mg/m2劑量，相當於等效劑量10~50 mg/kg，可以預防大鼠食管癌病變；用於小鼠時，按照70~350mg/m2劑量，相當於等效劑量15.4~78.54mg/kg，可以預防小鼠食管癌病變，用於人時，相當於等效劑量1.5~7mg/kg。

本申請的總體設計思路為：NMBA誘導的大鼠食管癌變過程中，通過影響癌前病變的發生率、多樣性，以及通過免疫組化方法判斷ki67，c-jun指標的表達情況來對異鼠李醇對與食管癌的化學預防作用進行判定。

實驗過程中，申請人通過體外實驗，篩選獲得了最佳的用於SHEE細胞的異鼠李醇濃度，並證實了異鼠李醇可以強烈的抑制SHEE細胞在癌變過程中的細胞增殖以及錨定非依賴型生長。

進一步地，通過構建NMBA誘導的大鼠食管上皮癌變模型，對異鼠李醇幹預食管癌發生發展的效果做了具體評價。結果表明，適當濃度的異鼠李醇對於食管癌病變的預防具有較好地效果，為食管癌的化學預防提供了新的思路和參考借鑑的可能性。

附圖說明

圖1為異鼠李醇對SHEE細胞增殖及轉化能力的影響結果，其中A為通過CCK8試劑盒檢測異鼠李醇對SHEE細胞毒性的實驗結果，圖中10μM異鼠李醇細胞的存活率在80%左右；B為異鼠李醇對SHEE細胞生長抑制作用結果，其結果表明，在0~10μM時，異鼠李醇對SHEE細胞的抑制作用具有時間和劑量依賴性；C為異鼠李醇對SHEE 細胞轉化能力的影響結果，其結果表明，隨著異鼠李醇濃度的升高，細胞轉化能力和克隆數量下降，異鼠李醇能夠抑制EGF誘導食管上皮永生化細胞SHEE 的轉化；

圖2為實驗分組情況，其中A為溶劑對照組，皮下注射無菌水，每周3次，共5周；0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃（10ml/kg）；B為NMBA組，皮下注射NMBA（0.5mg/kg），每周3次，共5周（0周到5周）；C為增生平組，從-1周開始灌胃增生平（4g/kg），在0周到5周皮下注射NMBA（0.5mg/kg），每周3次；D為異鼠李醇低劑量組，從-1周開始灌胃異鼠李醇（10mg/kg），在0周到5周皮下注射NMBA（0.5mg/kg），每周3次；E為異鼠李醇高劑量組，從-1周開始灌胃異鼠李醇（50mg/kg），在0周到5周皮下注射NMBA（0.5mg/kg），每周3次；註：↑表示NMBA注射時間，在0~5周，每周注射3次；

圖3為35周時，各實驗組大鼠食管黏膜鱗狀上皮ki67表達情況（×400），其中A為溶劑對照組樣品圖，B為甲基苄基亞硝胺組樣品圖，C為增生平組樣品圖，D為異鼠李醇低劑量組樣品圖，E為異鼠李醇高劑量組樣品圖，F為各實驗組ki67陽性細胞百分比（與NMBA組相比，差異有統計學意義，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）；

圖4為35w時，各實驗組大鼠食管黏膜鱗狀上皮c-jun表達情況（×400），其中A為溶劑對照組樣品圖，B為甲基苄基亞硝胺組樣品圖，C為增生平組樣品圖，D為異鼠李醇低劑量組樣品圖，E為異鼠李醇高劑量組樣品圖，F為各實驗組c-jun陽性細胞百分比（與NMBA組相比，差異有統計學意義，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）；

圖5為實驗期間，大鼠一般生理學統計指標情況，其中A為各組大鼠體重情況，各組相比差異無統計學意義；B為各組大鼠食物攝入情況，各組相比差異無統計學意義，C為各組大鼠飲水情況，各組相比差異無統計學意義；

圖6為大鼠病變類型統計情況，其中各組大鼠病變（增生、黏膜白斑、不典型增生）均與NMBA組相比，具體情況為：

增生，增生平組差異無統計學意義，異鼠李醇低劑量組差異有統計學意義(P <0.05)，異鼠李醇高劑量組差異有統計學意義(P <0.0001)；

黏膜白斑，增生平組、異鼠李醇低劑量組和異鼠李醇高劑量組差異均有統計學意義(P<0.000)；

不典型增生，增生平組差異有統計學意義(P <0.05)，異鼠李醇低劑量差異有統計學意義(P <0.01)，異鼠李醇高劑量組差異均有統計學意義(P <0.000)（*表示P <0.05，**表示P<0.01，***表示P <0.001）；

圖7為大鼠食管黏膜HE染色病理分級標準參考圖，其中 A為NMBA組大鼠食管中段樣品形態觀察圖；B中a為正常食管黏膜， b為食管黏膜增生性病變，c為食管黏膜白斑性病變，d為食管黏膜不典型增生（×400）；

圖8為15周、25周、35周時大鼠食管黏膜病變統計結果。

增生性改變，與對照組相比，NMBA組在15周、25周、35周時增生病變明顯增多，差異均有統計學意義(P<0.05)；

黏膜白斑，35周NMBA組大鼠食管病變與15周, 25周NMBA組相比，黏膜白斑增多，差異有統計學意義(P<0.05)；

不典型增生，35周NMBA組與15周, 25周NMBA組相比病變程度嚴重，差異有統計學意義(P<0.05)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的技術方案進行詳細的介紹，在介紹實施例前，首先對本發明中所用部分實驗材料及動物模型構建簡要介紹如下。

細胞株：SHEE細胞株（Shantou human embryonic esophageal epithelial cell line，人胚食管上皮細胞汕頭株，也稱永生化食管上皮細胞株，由汕頭大學醫學院腫瘤病理研究室李恩民教授惠贈），細胞株採用10% FBS/DMEM培養基，培養箱內37℃恆溫、5% CO2條件下培養、備用。

異鼠李醇：由鄭州大學化學系人工合成提供，通過對蘆丁醚化、水解等過程人工合成製備而成，主要製備步驟為：

第一，取蘆丁（20g，33 mmol）於500 mL圓底燒瓶中，加入DMF溶劑160 mL，室溫攪拌至蘆丁完全溶解；

加入K2CO3（22.7 g， 165 mmol）於油浴中加熱至50℃；

再緩慢加入苄基溴4.5eq.（注意：苄基溴的加入量要看TLC，反應產生兩個主要點，其中上邊的主點要濃於下邊的主點，若不濃於下面的點，再補加1eq. 的苄基溴，延長反應時間，直至上邊的點比下面的點濃才可停止反應，否則後續反應收率會受較大影響），反應停止後，緩慢加入醋酸水溶液（體積比，醋酸：水=1:1），調節PH為中性；

加入大量的水，乙酸乙酯萃取，TLC檢測是否萃取完全；

將有機相合併後再用水洗兩次，有機相蒸乾得紅褐色粘稠物；

第二，將上述蒸乾的紅褐色粘稠物加入30mL濃鹽酸、100mL乙醇，加熱回流4h後TLC檢測是否反應完全；

將冷卻的瓶子放於冰箱1h，抽濾，冰水洗滌兩次，黃色固體60℃烘乾即可；

正常情況下，上述第一、第二兩個步驟中的收率在80~90%左右；

第三，取第二步驟中黃色固體（20g，35mmol）於250mL圓底燒瓶中，加入80mL無水DMF，再加入K2CO3（8.7g， 63 mmol），滴加入CH3I（2.6ml，42 mmol），30℃攪拌（反應若進行不完全，適當補加CH3I）；

反應完全後，水淬滅反應，乙酸乙酯萃取三次，水洗滌兩次，無水硫酸鈉乾燥，蒸乾過柱得淡黃色固體，PE/EA/DCM=80/15/15；

產品用無水乙醇洗滌一次得淡黃色固體（收率約50%左右）；

第四，取第三步驟中所得淡黃色固體15g投於加氫反應釜中，先加入四氫呋喃110mL攪拌至溶解，再加入甲醇110mL，Pd/C 1.5g；

氣體置換三次，反應15h，TLC檢測是否反應完全；

反應完全後取出反應液，用硅藻土濾過Pd/C，過柱，極性：四氫呋喃/二氯甲烷=8/1，得黃色固體（收率約90%左右）；

產品合成路線如下：

。

食管癌變動物模型的構建：

動物模型構建過程中所用大鼠為：雄性、4~5周齡的F344大鼠（購自北京維通利華）；模型構建過程中，大鼠按5隻/籠標準條件飼養，恆溫（22～25℃），恆溼（40～60%），每 12 小時光/暗循環一次，經高壓滅菌的清潔級動物飼料和水供動物自由食用；兩周更換一次鼠籠，並定期清潔動物房；

動物模型構建過程參考Stoner GD所做NMBA誘導大鼠食管癌變模型構建過程（Stoner GD et.al.，Etiology and chemoprevention of esophageal squamous cell carcinoma，Carcinogenesis，2001，22(11)：1737~1746），具體為：

按皮下注射NMBA 0.5mg/kg的量，3次/周、連續5周（也可根據需要修改為：1次/周、連續15周）方式來構建大鼠食管癌變動物模型，並在15周、25周和35周分別處死一批大鼠，從而分階段對大鼠食管癌前病變過程進行分類和量化（細化），以利於尋找每個階段發生改變的基因，通過分析癌前病變的分子機制，從而為不同階段選用化學預防靶點提供理論依據；

同時下述實施例中，進行化合物預防食管癌變實驗時，在給予NMBA皮下注射前一周給予藥物灌胃，進行藥物的化學預防。

需要解釋的是，如果進行食管癌的化合物治療實驗，可在NMBA皮下注射完成後，再進行化合物灌胃，共進行藥物幹預35周。

實施例1

由於異鼠李醇在進行生物應用時，對於細胞可能存在一定毒性，因而首先需對異鼠李醇對於細胞的毒性和生長影響進行初步評價，相關實驗過程簡要介紹如下。

細胞毒性實驗

實驗過程為：SHEE細胞以1×104個/每孔接種於96孔板進行培養（10% FBS/DMEM，37℃，5% CO2），12小時後，更換新鮮培養基並加入不同濃度的異鼠李醇（0 μM、1μM 、2.5μM、 5μM、10μM、20μM），分別培養24和48小時後，每孔加入10 μL CCK-8（cell counting kit-8，日本同仁），繼續培養2小時，最後在酶標儀上 450nm進行吸光度檢測。

實驗結果如圖1A所示。從圖1A中可以看出，通過CCK-8試劑盒的檢測，可以發現0~10μM的異鼠李醇對細胞的影響非常小，但是20μM的異鼠李醇表現出一定的細胞毒性。因而在後續實驗中選擇10μM作為實驗最高劑量。

細胞增殖實驗

實驗過程為：SHEE細胞以5×103個/每孔接種於96孔板進行培養（10% FBS/DMEM，37℃，5% CO2），12小時後，更換新鮮培養基並加入不同濃度的異鼠李醇（0 μM、1μM 、2.5μM、5μM、10μM），分別在培養0、24、48、72和 96小時後，每孔加入10μL的CCK-8，繼續培養2小時，最後在酶標儀上 450nm 波長條件下進行吸光度檢測。

實驗結果如圖1B所示。

從圖1B中可以看出，1μM 、2.5μM濃度的異鼠李醇作用SHEE細胞24、48、72和96小時後，對SHEE細胞沒有抑制作用，5μM、10μM濃度的異鼠李醇對SHEE細胞具有抑制作用，並且呈現具有時間和劑量依賴性。

錨定非依賴性生長實驗

實驗過程為：在6孔板上每孔鋪入3 mL BME培養基（含10% FBS和 0.5%瓊脂），待凝固後鋪入混懸有8×103個 SHEE細胞的上層膠（1 mL BME培養基，含 10% FBS 和0.33% 瓊脂），在培養箱（37℃，5% CO2）培養7天後，待克隆形成，利用顯微鏡進行克隆計數。

實驗結果如圖1C所示。

從圖1C中可以看出，和EGF（表皮細胞生長因子）組相比，DMSO（二甲基亞碸）溶劑對照組的SHEE細胞沒有克隆形成能力；SHEE細胞受 EGF 誘導後，細胞形成克隆，但加入異鼠李醇可以抑制EGF誘導的SHEE細胞克隆形成，並且隨著異鼠李醇濃度的升高，克隆數量逐漸下降，說明在低毒性濃度的情況下，異鼠李醇能夠抑制 EGF 誘導的 SHEE 細胞克隆形成能力。

上述細胞研究中，以人食管上皮SHEE細胞為對象，選用0 μM、1μM、 2.5μM、 5μM、10μM、20μM濃度的異鼠李醇進行毒性實驗，篩選出安全的藥物濃度，濃度確定為0μM、1μM、 2.5μM、 5μM、10μM。通過進一步的增殖實驗，觀察到5μM、10μM濃度的異鼠李醇對SHEE細胞具有增殖抑制作用。最後通過錨定非依賴生長實驗檢測正常SHEE細胞和EGF誘導的SHEE細胞的轉化能力，並且可檢測異鼠李醇對EGF誘導的SHEE細胞轉化的抑制作用，觀察到異鼠李醇在低毒性的條件下具有抑制正常細胞向腫瘤細胞轉化的作用。

綜上細胞毒性、細胞增殖、錨定實驗等結論，可以認定，10μM以下濃度的異鼠李醇對SHEE細胞的毒性是在可接受範圍的，而且在此濃度範圍內，異鼠李醇對SHEE細胞具有增殖抑制作用；並且由於異鼠李醇對EGF誘導的SHEE細胞的轉化具有抑制作用，因而可初步認定，異鼠李醇在低濃度條件下具有抑制正常細胞向腫瘤細胞轉化的作用，或者說，在安全的異鼠李醇藥物濃度範圍基礎上（10μM以下時），可以有效的抑制SHEE細胞的增殖和惡性轉化。

實施例2

本發明以食管癌變動物模型的同步構建為基礎，通過在NMBA誘導食管癌變過程中同步添加異鼠李醇，通過異鼠李醇對於模型構建過程的影響，從而對異鼠李醇對食管癌變的化學預防作用做出初步評價。

實驗過程中，為評價異鼠李醇對於食管癌變的影響，在食管癌動物模型構建過程中，通過設置不同實驗組別以對異鼠李醇的化學預防作用進行初步評價。具體實驗組別設置如圖2所示，具體如下（新購買大鼠適應環境一周後，再按如下組別分組實驗）：

第一組：溶劑對照組（大鼠數量n=20），常規飼養，皮下注射無菌水，每周三次，共五周；同時按大鼠體重1mL/100g 的劑量灌胃0.5%的羧甲基纖維素，每天一次，共35周；

第二組：NMBA模型組（大鼠數量n=33），常規飼養，皮下注射NMBA，每周三次，共五周；

第三組：增生平組（大鼠數量n=8），在NMBA注射基礎上，同時用增生平給大鼠灌胃（4g/kg），每天一次，共35周；

第四組：異鼠李醇低劑量組（大鼠數量n=10），在NMBA注射基礎上，按10mg/kg劑量將異鼠李醇混懸於0.5%羧甲基纖維素中進行灌胃，每天一次，共進行35周；

第五組：異鼠李醇高劑量組（大鼠數量n=10），在NMBA注射基礎上，按50mg/kg劑量將異鼠李醇混懸於0.5%羧甲基纖維素中進行灌胃，每天一次，共進行35周。

實驗過程中，大鼠自由飲食。在15 周和 25 周時，從第一組和第二組中分別取 5 只和10隻大鼠，麻醉後解剖大鼠（為便於其他檢測分析，可在解剖時腹主動脈取血，分離血清血漿後保存至-80℃備用），將食管取出並縱行剖開，分為上中下三段，一半快速冰凍保存於液氮中，以備後續的DNA、RNA、蛋白的提取分析，另一半於10%的中性甲醛中固定24小時，並進行石蠟包埋和HE染色，以備後續的病理組織學評價和分析。35周時實驗結束時，處死各組所有大鼠，並保留食管以進行具體的免疫組織化學分析和其他方面的分析評價。

組織學評價，主要是對石蠟包埋並HE染色後的每個大鼠的所有食管黏膜樣品中的正常黏膜、增生、黏膜白斑、不典型增生的類型進行判定、計數和統計；

免疫組織化學分析，主要是對食管樣品進行免疫組織化學染色後，然後對樣品性質進行判定，免疫組織化學染色過程為：對石蠟包埋樣品常規脫蠟水化後，以0.01mol的枸櫞酸鹽修復液微波10min修復抗原，滴加H2O2封閉內源性過氧化物酶(室溫10 min)，第一抗體ki67（1:50）、c-jun(1:50) ( 4℃過夜)，滴加二抗(室溫孵育30 min)，DAB顯色，蒸餾水洗終止顯色，蘇木素復染、水洗、分化後充分水洗返藍，常規脫水透明，中性樹膠封片，同時以PBS代替一抗作陰性對照。

35w結束時，各實驗組大鼠食管黏膜鱗狀上皮ki67、和上皮c-jun的表達情況如圖3、圖4所示，從圖中可以看出，相較於NMBA組，各實驗組均具有統計學差異，而相較於增生平組，隨著異鼠李醇用量不同，其作用效果也有一定程度優化。

而實驗期間大鼠的體重、飲水量、食物量等形態學指標如圖5所示，從圖中可以看出，各組大鼠在飲食、體重方面沒有明顯差異。

對大鼠食管的上皮組織進行形態學觀察，並進行食管黏膜HE染色病理分級和統計。形態學觀察時，由兩位病理科醫師在雙盲狀態下，光鏡下觀察食管病理組織學變化並記錄每個視野下（×100）不同病理分級所佔百分比。食管的癌前病變病理分級如圖7所示，具體分級標準為：將食管黏膜上皮變化分為正常、增生、黏膜白斑、不典型增生4種類型；

正常，正常食管鱗狀上皮，無變化；

增生，增生型病變分為基底細胞增生、上皮細胞（棘細胞）增生；

黏膜白斑，基底細胞和棘細胞均顯著增多，增生的基底細胞形成3-6層以上，可佔全層的1/2；

不典型增生，基底層細胞增生活躍，層次紊亂且較多，向基底部突出，可超過上皮全層的2/3；細胞增大，大小和形態不一致，排列不整。

大鼠食管癌變情況統計結果如圖6及下表所示。

異鼠李醇對F344大鼠食管癌變程度以及數量的影響：

註：a表示與NMBA組相比，差異有統計學意義（P <0.05），b表示與NMBA組相比，差異有統計學意義（P <0.01）， c表示與NMBA組相比，差異有統計學意義（P <0.001）。

從圖6及上表統計結果可以看出，對照組大鼠只有增生病變，而甲基苄基亞硝胺組大鼠出現增生、黏膜白斑、不典型增生癌前病變，異鼠李醇高劑量組和低劑量組也存在增生、黏膜白斑、不典型增生的癌前病變，但和甲基苄基亞硝胺組相比，病變明顯減輕，差異有統計學意義，同時未發現心，肝，腎，脾等異常進一步地，對NMBA模型組中F344大鼠食管上皮癌變演進過程中各病變（增生、黏膜白斑、不典型增生）的個數進行統計（均數±標準差），具體結果如圖8及下表所示：

15w、25w、35w大鼠食管黏膜病變統計結果：

註：a表示與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）；b表示與35周NMBA組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。

NMBA組在15周、25周、35周時增生明顯增多，和對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。對照組未發現黏膜白斑和不典型增生，而NMBA組在15周，25周，35周均存在黏膜白斑和不典型增生，並且隨著時間延長，病變逐漸增多。

黏膜白斑，35周NMBA組大鼠食管病變與15周，25周NMBA組相比，黏膜白斑增多，差異有統計學意義(P<0.05)；

不典型增生，35周NMBA組與15周，25周NMBA組相比病變程度嚴重，差異有統計學意義(P<0.05)。

綜合上述光學顯微鏡的觀察結果和統計結果，可以明顯看出，在NMBA誘導15周、25周、35周時，食管上皮中增生、黏膜白斑以及不典型增生等病變明顯增多，這一結果說明NMBA成功誘導了大鼠食管上皮癌變過程的發生。