黃芩苷在製藥中的應用的製作方法

2023-09-14 20:22:35 2

專利名稱：黃芩苷在製藥中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及黃芩苷的新用途，尤其涉及在製備預防和治療紅斑狼瘡腎炎、類風 溼性關節炎和血管炎的藥物中的應用。
背景技術：
自身免疫性疾病是一種免疫細胞介導的危害人類健康的疾病，常伴有多器官和 多系統的損傷，重者威脅到生命。激素等免疫抑制劑作為目前治療的一線藥物，常 因為嚴重的副作用使病情加重，甚至治療終止。而隨著環境汙染和生活工作壓力等 的改變，自身免疫性疾病的發病率在逐年增加。尋找安全有效的治療自身免疫病的 藥物已經成為世界範圍深入研究的課題。
自身免疫性疾病常伴有免疫耐受的破壞。免疫耐受對於維持體內免疫平衡和防 止自身免疫性疾病很重要。胸腺首先會清除自身反應性T細胞，如果胸腺不能完全去 除自身反應性T細胞，牝時健康個體並沒有發生自身免疫性疾病，因為存在有外周免 疫耐受。調節性T細胞(Treg)具有免疫抑制作用，在外周免疫耐受中起關鍵作用， 可防止自身免疫性疾病的發生。越來越多的研究支持自身免疫性疾病如紅斑狼瘡、 類風溼關節炎等都伴有Treg細胞數量的減低，而促進T細胞向Treg細胞轉化的藥物 對治療自身免疫性疾病將會起重要作用。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(Forkhead/ winged helix transcription factor (Foxp3))，是Treg細胞發育過程中的核心轉 錄因子，調控幼稚性T細胞向Treg細胞轉化。Fo鄧3基因敲處的小鼠可發生嚴重的自 身免疫性疾病，說明Foxp3在維持免疫耐受和防止自身免疫性疾病的發生中起重要作 用。目前為止公認的具有上調Foxp3的藥物寥寥無幾，天然藥物至今未有發現。
分泌IL-17的CD4+T細胞(Thl7)是新近發現的一新T細胞亞群，其主要通過分泌 白,胞介素-17A (IL-17A),白細胞介素-17F (IL-17F),腫瘤壞死因子-a (TNF-a)和白細胞介素-6 (IL-6)等細胞因子刺激血管內皮細胞分泌粘附分子，介導炎 細胞對組織的浸潤和組織的損傷；同時Thl7細胞也可以分泌細胞毒物質直接損傷組 織。越來越多的研究表明Thl7細胞在一些自身免疫性疾病如風溼性關節炎、紅斑 狼瘡、銀屑病和多發性硬化的發病中起關鍵作用。因此尋找同時能夠抑制Thl7細胞
3亞群的藥物就有可能緩減自身免疫性疾病。黃芩是傳統的清熱解毒中藥，味苦，性 寒，傳統醫學中用於治療溼熱痞滿、肺熱咳嗽、癰腫瘡毒等症。黃芩苷(7-glucuronic acid-5，6-dihydroxyflavone)是黃芩的主要成份，分子式為C2孔Ab分子量為 446.35，結構式
在以往的應用和研究中，已知黃芩苷具有保肝利膽、降壓、利尿、抗菌的作用， 但黃芩苷在調控T細胞向Treg和Thl7轉化中的作用未見報導，同時在治療系統性 紅斑狼瘡腎炎和風溼性關節炎也未見報導。
本發明的目的是提供黃芩苷在製藥中的新用途。
為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供黃芩苷在製備預防和治療紅斑狼 瘡腎炎、類風溼性關節炎和Thl7細胞介導的血管炎的藥物中的應用。
下面用黃芩苷的藥理實驗和結果來說明其在製藥領域中的新用途。
黃芩苷體外誘導T細胞向Treg轉化，同時抑制向Thl7轉化首先我們用流式 細胞儀分選小鼠脾臟中的幼稚T淋巴細胞(CD4+CD25—)， 96孔板中培養，每孔1X106 個細胞，同時加入2^g/ml的anti-CD3和2^g/ml的anti-CD28。加入轉化生長因子 (TGF-{3 ) 5ng/ml誘導向Treg細胞轉化；加入轉化生長因子(TGF-e ) 5ng/ml + 白細胞介素-6 (IL-6) 20ng/ml誘導向Thl7細胞轉化。同時在培養液中加入20幽 的黃芩苷(溶解在二甲基亞碸(DMSO))。細胞培養3天後，通過流式細胞儀檢測 CD4+Fo鄧3+和CD4+IL-17+的T細胞在CD4+細胞中的百分率，結果如圖1所示。該圖說 明了黃芩苷能夠體外調控T細胞向Treg和Thl7細胞的轉化。
、黃芩苷上調Fo鄰3 mRNA的表達首先我們用流式細胞儀分選小鼠脾臟中的幼稚 T淋巴細胞，96孔板中培養，每孔1X1(T個細胞，設三復孔。同時加入2^g/ml的 anti-CD3和2Pg/ml的anti-CD28。單獨加入轉化生長因子(TGF-P ) 5ng/ml、 20, 的黃芩苷或兩者同時加。細胞培養3天後，通過實時定量聚合酶聯反應(實時定量 PCR)檢測Foxp3 mRNA的表達，結果如圖2所示。該圖說明了黃芩苷能夠上調Foxp
發明內容
4mRNA的表達。
黃芩苷改善自發性狼瘡小鼠的腎臟損傷12隻五月齡自發性狼瘡小鼠
(MRL/lpr)購自中國科學院上海生命科學研究院上海斯萊克實驗動物有限公司。治 療組腹腔注射100mg/kg/天黃芩苷(溶解在生理鹽水，保存在-2(TC的冰箱)，連續 治療9周。分別在第O周、3周、6周和9周收集小鼠24小時尿液，檢測尿蛋白含 量，計算相對尿蛋白增加=待測時間尿蛋白-第0周尿蛋白。如圖3所示，*〈0.001， 說明黃芩苷能夠改善狼瘡小鼠的24小時尿蛋白。第9周處死動物，取腎臟做病理蘇 木素一伊紅(HE)和Masson三色染色了解腎臟損傷情況，如圖4所示，說明黃芩苷 能夠改善狼瘡小鼠的腎臟損傷。取脾細胞檢測黃芩苷是否能促進T細胞向Treg細胞 的轉化，如圖5所示，說明黃芩苷能夠促進狼瘡小鼠體內T細胞向Treg轉化。
黃芩苷緩解佐劑性關節炎小鼠關節損傷18隻8周齡雄性C57BL/6小鼠購自中 國科學院上海生命科學研究院上海斯萊克實驗動物有限公司。造模使用100ri含有 熱休克的10mg/ml的結核桿菌的完全佛式佐劑免疫小鼠後足，小鼠2周後關節炎症 狀到達高峰，此時開始腹腔注射100mg/kg/天的黃芩苷1周。取關節組織行病理切 片評價治療效果，如圖6所示，說明黃芩苷能夠改善關節炎小鼠的關節損傷，取小 鼠關節組織通過實時定量PCR檢測黃芩苷對白細胞介素-17 (IL-17) mRNA的影響， 如圖7所示，說明黃芩苷能夠抑制關節炎小鼠關節組織中IL-17mRNA的表達。
黃芩苷抑制IL-17誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)炎症因子的表達 HUVEC培養在6孔板中，待細胞至80%融合時，加入50ng/ml IL-17和20幽黃苳苷， 並繼續培養24小時後，收集細胞，通過實時定量PCR檢測黃芩苷對細胞間粘附分 子-l(ICAM-1)，血管內皮細胞間粘附分子-1 (VCAM-1)和IL-17 mRNA表達的影響， 並以18SrRNA作為內參。結果如圖8所示，說明黃芩苷能夠抑制IL-17誘導的粘附 分子mRNA的表達。
黃芩苷抑制IL-17誘導的T細胞對人臍靜脈血管內皮細胞的粘附人臍靜脈血 管內皮細胞培養在12孔板中，待細胞至80%融合時，加入50 ng/ml IL-17和20MM 黃芩苷，並繼續培養24小時後；然後以5:1的比例加入人白血病淋巴細胞(Jurkat)， 繼續培養24小時。培養結束後以生理鹽水洗去未粘附的淋巴細胞，顯微鏡下觀察粘 附細胞。如圖9所示，說明黃芩苷能夠抑制IL-17誘導的T細胞內皮細胞的粘附。
本發明以調控T細胞轉化為靶點，發現黃芩苷調控T細胞轉化在治療自身免疫性 疾病中的應用，其具體優點如下1、 本發明對已知化合物黃芩苷發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。
2、 黃芩苷促進T細胞向抗炎作用的Treg細胞的轉化和抑制T細胞向促炎作用 的Thl7轉化的轉化；
3、 黃芪苷可以進一步抑制由Thl7細胞誘導的血管炎；
4、 黃芩苷的免疫調節作用可以應用在廣泛的自身免疫性疾病上。


圖1為小鼠T細胞流式細胞儀檢測圖2為小鼠T細胞中Foxp3 mRNA表達的實時定量聚合酶聯反應檢測圖； 圖3為小鼠24小時尿蛋白定量檢測圖； 圖4為小鼠腎臟蘇木素一伊紅和Masson三色染色圖； 圖5為小鼠脾臟CD4+Foxp3+細胞流式細胞儀檢測圖； 圖6為小鼠關節組織蘇木素一伊紅染色圖； 圖7為小鼠關節組織IL-17mRNA表達的聚合酶聯反應檢測圖； 圖8為黃芩苷抑制血管內皮細胞粘附分子mRNA表達的聚合酶聯反應檢測圖； 圖9為黃芩苷抑制T細胞對血管內皮細胞的粘附圖。
具體實施例方式
下面通過實施例具體說明本發明。
實施例1:黃芩苷的提取
採用唇形科黃芩屬植物黃芩2.5kg，用95voP/。的乙醇在65'C提取兩次，每次兩 小時，提取液在7(TC減壓濃縮，得到的濃縮液冷卻到室溫，離心，過濾，濾液在70 'C減壓濃縮，得到的濃縮液加入乙醇至85voP/。進行醇沉，醇沉液靜置過濾，取上清 液，，過濾去掉雜質，在7(TC減壓濃縮，噴霧乾燥，紫外滅菌，得到黃芩苷。
實施例2:膠囊的製備
將實施例1得到的黃芩苷300g，加入300g聚乙二醇(PEG-400)， 30g三乙醇胺， 20g羥丙基-(3-環糊精20g和甘油40g，混合溶解製成溶液，採用壓膜法製備軟膠囊， 軟膠囊經冷風固化、乾燥，用適當的溶劑洗丸、終幹，即得。
本發明還可以通過常規方法製備其他劑型，如軟膠囊、腸溶膠囊、微囊、粉劑、 顆粒劑、糖漿、注射劑、栓劑、丸劑、凝膠劑、貼劑、乳劑、懸浮液、溶液等。本 發明中的製劑可以是包衣或未包衣的形式，視需要而定。本發明中的藥用輔料包括 用於固體製劑的賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩定劑、發泡劑、包衣劑等，或用於半固體製劑、液體製劑的溶液、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩衝劑、潤膚劑、 乳化劑等，此外，也可以根據需要使用其它藥ffl添加劑如防腐劑、抗氧化劑、著色 劑、甜味劑和調味劑等。
權利要求
1.黃芩苷在製備治療或預防紅斑狼瘡腎炎的藥物中的應用。
2. 黃芩苷在製備治療或預防類風溼性關節炎的藥物中的應用。
3. 黃芩苷在製備治療或預防Thl7細胞介導的血管炎中的應用。
全文摘要
本發明涉及黃芩苷在製藥中的應用。黃芩苷通過上調Foxp3的表達，促進T細胞向具有免疫抑制作用的Treg的轉化；同時黃芩苷抑制具有促炎作用的Th17，抑制Th17介導的血管炎。其抑制Th17的主要機制是通過抑制IL-6介導的Th17的擴增。同時我們進一步的實驗證明黃芩苷作為一種新的免疫調節劑，在治療紅斑狼瘡腎炎和類風溼性關節炎中發揮很好的療效。
文檔編號A61K31/7048GK101491533SQ20081020729
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月18日 優先權日2008年12月18日
發明者明 李, 驥 楊 申請人:復旦大學附屬中山醫院