大環β－分泌酶抑制劑的製作方法

2023-09-14 13:56:15

專利名稱：大環β－分泌酶抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及取代的大環BACE-1抑制劑、包含所述化合物的藥用組合物，及其在治療阿爾茨海默氏病中的用途。
背景技術：
阿爾茨海默氏病(AD)為最終致命的漸進性神經退化性疾病。疾病進展與涉及記憶、推理、定位及判斷的認知功能的逐漸喪失相關。包括精神錯亂、抑鬱及攻擊行為的行為變化也表明疾病進展。相信認知及行為功能障礙由腦內的海馬及大腦皮層中神經元功能改變及神經元損傷引起。目前可用的AD治療為治標的，且儘管所述治療可改善認知及行為障礙，但其不能阻止疾病進展。因此，對可停止疾病進展的AD治療的醫藥需求仍未得到滿足。
AD的病理特徵為包含異常磷酸化τ蛋白質的細胞外β-澱粉狀蛋白(Aβ)斑塊及細胞內神經原纖維纏結的沉積。患有AD的個體在已知對記憶及認知十分重要的腦部呈現出典型的Aβ沉積。相信Aβ為神經元細胞損傷及功能障礙的基本病因，其與認知及行為衰退相關。澱粉狀蛋白斑塊主要由包含40-42個胺基酸殘基的Aβ肽組成，所述Aβ肽由澱粉狀前體蛋白質(APP)的處理得到。通過多樣不同的蛋白酶活性來處理APP。通過β-分泌酶在對應於Aβ的N端位置及通過γ-分泌酶活性在C端裂解APP產生Aβ肽。也通過α-分泌酶活性裂解APP，導致稱為可溶性APP的分泌性非澱粉狀片段。
稱為BACE-1的天冬氨醯蛋白酶已確定為導致APP在對應於Aβ肽N端位置上裂解的β-分泌酶活性。
積累的生物化學及遺傳證據證明了Aβ在AD病因學中的主要作用。例如，在活體外，且當注射入齧齒動物腦內時，Aβ顯示對神經元細胞有毒。此外已知初期發作AD的遺傳形式，其中存在明確的APP或早老蛋白突變。這些突變增強Aβ的產生並認為是引起AD的成因。
由於Aβ肽因β-分泌酶活性而形成，因而抑制BACE-1應抑制Aβ肽的形成。因此抑制BACE-1為治療AD及其它由Aβ斑塊沉積引起的認知及神經退化性疾病的治療方法。
WO 04/04396、WO 02/02505、WO 02/02506、WO 02/02512、WO02/02518及WO 02/02520中公開取代的胺BACE-1抑制劑。WO89/03842中公開包含(1-氨基-2-羥基-2-雜環)乙基部分的腎素抑制劑。WO 02/088101中公開功能上描述為包含4個疏水部分的BACE抑制劑和優選包含雜環或雜芳基部分的系列化合物。
WO 02/100856及WO 02/100399中公開用於治療阿爾茨海默氏病的大環化合物及製備大環化合物的方法。
發明概述本發明涉及具有結構式I的化合物 或其藥學上可接受的鹽，其中R1為
或 R2為-N(R5)C(O)R4-或亞雜環基環；R3為亞芳基、亞雜芳基、亞雜環基或亞環烷基；R4為亞芳基、亞雜芳基、亞雜環基或亞環烷基；R5為氫、烷基、芳基、雜芳基或環烷基；R6及R7獨立選自氫、-OH、烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、芳烷氧基、雜芳烷氧基和烷氧基，前提是當R6及R7為-OH、芳烷氧基、雜芳烷氧基和烷氧基時，R6和R7不與相鄰於環氮的環碳連接；R8為氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基、雜環基烷基、-C(O)R9、-C(O)OR12、-S(O)R9、-S(O2)R9或-CN；前提是當Y為＝O時，R8不能為-C(O)R9、-C(O)OR12、-S(O)R9、-S(O2)R9或-CN；R9為氫、烷基、環烷基、芳基、雜芳基、環烷基烷基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基、雜環基烷基、烯基、炔基或-N(R10)(R11)；R10和R11獨立選自氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、雜芳基、雜環基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基烷基、烯基和炔基；或R10和R11與它們所連接的氮-起形成3-7元雜環基環；R12為烷基、環烷基、芳基、雜芳基、環烷基烷基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基、雜環基烷基、烯基或炔基；X為O、S、C(R5)或NH；Y為＝O或(H，H)；m為1、2或3；n為0、1、2或3；且
o為0、1、2或3；其中各烷基任選被1至3個選自滷代、芳基、環烷基、氰基、羥基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(環烷基)、-N(烷基)2、羧基和-C(O)O-烷基的部分取代；且其中各亞芳基、亞雜芳基、雜環基、雜環基烷基、亞雜環基、亞環烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、雜芳基、雜環基、芳烷基、雜芳烷基、芳烷氧基或雜芳烷氧基任選被1至4個選自-CF3、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、烷基芳基、雜芳烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、烷基雜芳基、羥基、羥烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、醯基、芳醯基、滷代、硝基、氰基、羧基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、雜芳基磺醯基、烷硫基、芳硫基、雜芳基硫基、芳烷硫基、雜芳烷硫基、環烷基、雜環基、-C(＝N-CN)-NH2、-C(＝NH)-NH2、-C(＝NH)-NH(烷基)、Y1Y2N-、Y1Y2N-烷基-、Y1Y2NC(O)-、Y1Y2NSO2-及-SO2NY1Y2的部分取代，其中Y1和Y2可相同或不同，且獨立選自氫、烷基、芳基、環烷基和芳烷基，前提是亞環烷基和亞雜環基可由＝O取代。
式I表示的化合物為用於預防和治療阿爾茨海默氏病的β-分泌酶抑制劑。
在另一方面，本發明涉及一種藥用組合物，其包含至少一種式I的化合物及藥學上可接受的載體。
在另一方面，本發明包括抑制BACE-1的方法，該方法包括給予需要此種治療的患者至少一種式I的化合物。本發明也要求抑制β-澱粉狀蛋白斑塊於神經組織(例如腦)中，於神經組織上或於神經組織周圍形成或形成並沉積的方法，該方法包括給予需要此種治療的患者至少一種式I的化合物。
更具體地說，本發明包括治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括給予需要此種治療的患者至少一種式I的化合物。本發明還包括治療阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括給予需要此種治療的患者至少一種式I的化合物。
在另一方面，本發明包括治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括給予需要此種治療的患者至少一種式I的化合物與至少一種選自不同於式I化合物的β-分泌酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、非類固醇抗炎藥、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、膽鹼脂酶抑制劑和抗澱粉狀蛋白抗體的化合物的組合。
在最後一方面，本發明涉及一種藥劑盒，它包含分開的容器，各容器包含用於組合使用的單獨包裝的藥用組合物，其中一容器包含於藥學上可接受的載體中的至少一種式I的化合物，而第二個容器包含於藥學上可接受的載體中的至少一種不同於式I化合物的β-分泌酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、非類固醇抗炎藥、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、膽鹼脂酶抑制劑和/或抗澱粉狀蛋白抗體，組合的量為治療認知疾病或神經退化性疾病諸如阿爾茨海默氏病的有效量。
發明詳述參考上述式I，本發明的優選化合物為具有以下立體化學的那些化合物 在式I的優選化合物中，R1為
R2優選為-N(R5)C(O)R4-，其中R4優選為亞芳基，且R5優選為烷基。更優選R4為亞苯基且R5為丙基。在一優選實施方案中，R4為 或者，R2為亞雜環基，R2更優選為具有以下結構的由＝O取代的亞雜環基 R3優選為亞芳基，R3更優選為亞苯基或滷代取代的亞苯基。R3甚至更優選為 優選地，m為2且n為1。
R7優選為氫。
R8優選為芳烷基或-S(O2)R9，或R8更優選為 或 優選地，X為O且Y為O。
在式I化合物的優選實施方案中，R1為 R2為-N(R5)C(O)R4-或亞雜環基；R3為亞芳基；R4為亞芳基或亞雜環基；R5為烷基；R7為氫；R8為芳烷基或-S(O2)R9；m為2；n為1；X為O；且Y為O。
在上述優選實施方案中，R3優選為亞苯基或滷代取代的亞苯基。特別是，R3為 或 在上述優選實施方案中，R4優選為亞芳基，特別是，R4為 或者R2為亞雜環基，R2更優選為具有以下結構的由＝O取代的亞雜環基
在上述優選實施方案中，R8為 或 除非另有說明，否則下列定義應用於本說明書及權利要求書全文中。應用這些定義可無需考慮術語是單獨使用或與其它術語組合使用。因此，″烷基″的定義可應用於″烷基″以及應用於″烷氧基″、″環烷基″等的″烷基″部分。
除非另有說明，否則上述及整個說明書所用的下列術語應理解為具有下列含義″患者″包括人及動物。
″哺乳動物″意謂人及其它哺乳動物。
″烷基″意指脂族烴基，其為直鏈或支鏈且碳鏈中包含約1至約20個碳原子。烷基碳鏈中優選包含約1至約12個碳原子。烷基碳鏈中更優選包含約1至約6個碳原子。支鏈意指一或多個諸如甲基、乙基或丙基的低級烷基與線性烷基鏈連接。″低級烷基″意指碳鏈中具有約1至約6個碳原子的烷基，其可為直鏈或支鏈。
″亞烷基″意指自上述定義的烷基除去一氫原子所得的雙官能基。亞烷基的非限制性實例包括亞甲基和亞乙基。
″烯基″意指包含至少一個碳-碳雙鍵的脂族烴基，其可為直鏈或支鏈，且碳鏈中包含約2至約15個碳原子。優選的烯基的碳鏈中含有約2至約12個碳原子；且碳鏈中更優選含有約2至約6個碳原子。支鏈意指一或多個諸如甲基、乙基或丙基的低級烷基與線性烯基鏈連接。″低級烯基″意指碳鏈中含有約2至約6個碳原子，且可為直鏈或支鏈。術語 ″取代的烯基″意指該烯基可被一或多個相同或不同的取代基取代，各取代基獨立選自滷代、烷基、芳基、環烷基、氰基、烷氧基和-S(烷基)。適合的烯基的非限制性實例包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、辛烯基和癸烯基。
″炔基″意指包含至少一個碳-碳三鍵的脂族烴基，其可為直鏈或支鏈，且碳鏈中包含約2至約15個碳原子。優選的炔基的碳鏈中含有約2至約12個碳原子；且碳鏈中更優選含有約2至約4個碳原子。支鏈意指一或多個諸如甲基、乙基或丙基的低級烷基與線性炔基鏈連接。″低級炔基″意指碳鏈中含有約2至約6個碳原子，且可為直鏈或支鏈。適合的炔基的非限制性實例包括乙炔基、丙炔基、2-丁炔基和3-甲基丁炔基。術語″取代的炔基″意指該炔基可被一或多個相同或不同的取代基取代，各取代基獨立選自烷基、芳基和環烷基。
″芳基″意指包含約6至約14個碳原子，優選約6至約10個碳原子的芳族單環或多環系統。芳基可任選被一或多個如上所定義的相同或不同″環系取代基″取代。適合的芳基的非限制性實例包括苯基和萘基。
″亞芳基″意指自如上定義的芳基除去一氫原子所得的雙官能基。亞芳基的非限制性實例包括亞苯基和亞萘基。
″雜芳基″意指包含約5至約14個環原子，優選約5至約10個環原子的芳族單環或多環系統，其中一或多個環原子為單獨或組合的除碳元素以外的元素，如氮、氧或硫。優選的雜芳基包含約5至約6個環原子。″雜芳基″可任選被一或多個如本文所述的相同或不同″環系取代基″取代。雜芳基詞根名前的前綴氮雜、氧雜或硫雜意指分別存在至少一個氮、氧或硫原子作為環原子。雜芳基的氮原子可任選氧化為相應N-氧化物。適合的雜芳基的非限制性實例包括吡啶基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、吡啶酮(包括N-取代吡啶酮)、異唑基、異噻唑基、唑基、噻唑基、吡唑基、呋咱基、吡咯基、吡唑基、三唑基、1，2，4-噻二唑基、吡嗪基、噠嗪基、喹喔啉基、酞嗪基、羥吲哚基、咪唑並[1，2-a]吡啶基、咪唑並[2，1-b]噻唑基、苯並呋咱基、吲哚基、氮雜吲哚基、苯並咪唑基、苯並噻吩基、喹啉基、咪唑基、噻吩並吡啶基、喹唑啉基、噻吩並嘧啶基、吡咯並吡啶基、咪唑並吡啶基、異喹啉基、苯並氮雜吲哚基、1，2，4-三嗪基、苯並噻唑基等。術語″雜芳基″也指部分飽和雜芳基部分，諸如四氫異喹啉基、四氫喹啉基等。
″亞雜芳基″意指自上述定義的雜芳基除去一氫原子所得的雙官能基。亞雜芳基的非限制性實例包括亞吡啶基、亞吡嗪基、亞呋喃基、亞噻吩基和亞嘧啶基。
″芳烷基″或″芳基烷基″意指芳基-烷基-，其中芳基和烷基如前所述。優選的芳烷基包含低級烷基。適合的芳烷基的非限制性實例包括苄基、2-苯乙基和萘基甲基。通過烷基鍵結至母體部分。
″烷芳基″意指烷基-芳基-，其中烷基和芳基如前所述。優選的烷芳基包含低級烷基。適合的烷芳基的非限制性實例為甲苯基。通過芳基鍵結至母體部分。
″環烷基″意指包含約3至約10個碳原子，優選約5至約10個碳原子的非芳族單環或多環系統。優選的環烷基環包含約5至約7個環原子。環烷基可任選被一或多個如上定義的相同或不同″環系取代基″取代。適合的單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環戊基、環己基、環庚基等。適合的多環環烷基的非限制性實例包括1-十氫萘基、降冰片基、金剛烷基等，及諸如茚滿基、四氫萘基等的部分飽和物質。
″亞環烷基″意指自上述定義的環烷基除去一氫原子所得的雙官能基。亞環烷基的非限制性實例包括亞環丁基和亞環丙基。
″滷代″意指氟代、氯代、溴代或碘代。優選為氟代、氯代和溴代。
″環系取代基″意指連接至芳族或非芳族環系統的取代基，例如其取代環系統上的一個可利用的氫。環系取代基可相同或不同，各環系取代基獨立選自-CF3、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、烷芳基、雜芳烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、烷基雜芳基、羥基、羥烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、醯基、芳醯基、滷代、硝基、氰基、羧基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、雜芳基磺醯基、烷硫基、芳硫基、雜芳基硫基、芳烷硫基、雜芳烷硫基、環烷基、雜環基、＝O、-C(＝N-CN)-NH2、-C(＝NH)-NH2、-C(＝NH)-NH(烷基)、Y1Y2N-、Y1Y2N-烷基-、Y1Y2NC(O)-、Y1Y2NSO2-和-SO2NY1Y2，其中Y1和Y2可相同或不同，且獨立選自氫、烷基、芳基、環烷基和芳烷基。″環系取代基″也可意指同時取代環系統上兩相鄰碳原子上的兩個可利用的氫(各碳上的一個氫)的單獨部分。這樣的部分的實例為形成諸如下列部分的亞甲二氧基、亞乙二氧基、-C(CH3)2-等 和 ″雜環基″意指包含約3至約10個環原子，優選約4至約7個環原子的非芳族飽和單環或多環系統，其中環系統中一或多個原子為單獨或組合的除碳元素以外的元素，例如氮、氧或硫。環系統中不存在相鄰的氧和/或硫原子。優選的雜環基包含約5至約6個環原子。雜環基詞根名前的前綴氮雜、氧雜或硫雜意指分別存在至少一個氮、氧或硫原子作為環原子。雜環基中任一-NH可經保護作為如-N(Boc)、-N(CBz)、-N(Tos)基團等存在；也認為這樣的保護為本發明的部分。雜環基可任選被一或多個如本文所述的相同或不同″環系取代基″取代。雜環基的氮或硫原子可任選氧化成相應N-氧化物、S-氧化物或S，S-二氧化物。適合的單環雜環基的非限制性實例包括哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、噻唑烷基、1，4-二氧雜環己烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、內醯胺、內酯等。
″亞雜環基″意指自上述定義的雜環基除去一氫原子所得的雙官能基。亞雜環基的非限制性實例包括亞哌啶基、亞吡咯烷基、亞哌嗪基、亞嗎啉基、亞硫嗎啉基、亞噻唑烷基、1，4-亞二氧雜環己烷基、亞四氫呋喃基和亞四氫噻吩基。
應注意在本發明的含雜原子環系統中，碳原子上無羥基與N、O或S相鄰，碳原子上也無N或S基團與另一雜原子相鄰。因此，舉例而言，在如下所示的環中沒有-OH直接與標號為2和5的碳連接 也應注意諸如如下所示部分的互變異構形式在本發明的某些實施方案中是等價的 和 ″炔基烷基″意指炔基-烷基-，其中炔基和烷基如前所述。優選的炔基烷基包含低級炔基和低級烷基。通過烷基鍵結至母體部分。適合的炔基烷基的非限制性實例包括炔丙基甲基。
″雜芳烷基″意指雜芳基-烷基-，其中雜芳基和烷基如前所述。優選的雜芳烷基包含低級烷基。適合的雜芳烷基的非限制性實例包括吡啶基甲基和喹啉-3-基甲基。通過烷基鍵結至母體部分。
″雜芳烷硫基″意指雜芳烷基-S-，其中雜芳烷基如前所述。優選的雜芳烷硫基包含低級烷基。通過硫鍵結至母體部分。
″雜芳基烯基″意指雜芳基-烯基，其中雜芳基和烯基如前所述。優選的雜芳基烯基包含低級烯基。通過烯基鍵結至母體部分。
″雜芳基炔基″意指雜芳基-炔基，其中雜芳基和炔基如前所述。優選的雜芳基炔基包含低級炔基。通過炔基鍵結至母體部分。
″羥烷基″意指HO-烷基-基團，其中烷基如前所述。優選的羥烷基包含低級烷基。適合的羥烷基的非限制性實例包括羥甲基和2-羥乙基。
″醯基″意指H-C(O)-、烷基-C(O)-或環烷基-C(O)-，其中各基團如前所述。通過羰基鍵結至母體部分。優選的醯基包含低級烷基。適合的醯基的非限制性實例包括甲醯基、乙醯基和丙醯基。
″芳醯基″意指芳基-C(O)-基團，其中芳基如前所述。通過羰基鍵結至母體部分。適合的基團的非限制性實例包括苯甲醯基和1-萘醯基。
″烷氧基″意指烷基-O-基團，其中烷基如前所述。適合的烷氧基的非限制性實例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基和正丁氧基。通過醚氧鍵結至母體部分。
″烷氧基烷基″意指烷氧基-烷基-，其中烷氧基和烷基如前所述。適合的烷氧基烷基的非限制性實例包括乙氧基乙基、甲氧基甲基和乙氧基甲基。通過烷基鍵結至母體部分。
″芳氧基″意指芳基-O-基團，其中芳基如前所述。適合的芳氧基的非限制性實例包括苯氧基和萘氧基。通過醚氧鍵結至母體部分。
″芳烷氧基″意指芳烷基-O-，其中芳烷基如前所述。適合的芳烷氧基的非限制性實例包括苄氧基和1-或2-萘甲氧基。通過醚氧鍵結至母體部分。
″烷基雜芳基″意指烷基-雜芳基-，其中烷基和雜芳基如前所述。通過雜芳基鍵結至母體部分。
″烷硫基″意指烷基-S-，其中烷基如前所述。適合的烷硫基的非限制性實例包括甲硫基和乙硫基。通過硫鍵結至母體部分。
″芳硫基″意指芳基-S-基團，其中芳基如前所述。適合的芳硫基的非限制性實例包括苯硫基和萘硫基。通過硫鍵結至母體部分。
″芳烷硫基″意指芳烷基-S-基團，其中芳烷基如前所述。適合的芳烷硫基的非限制性實例為苄硫基。通過硫鍵結至母體部分。
″烷氧羰基″意指烷基-O-C(O)-基團，其中烷基如前所述。適合的烷氧羰基的非限制性實例包括甲氧羰基和乙氧羰基。通過羰基鍵結至母體部分。
″芳氧羰基″意指芳基-O-C(O)-基團，其中芳基如前所述。適合的芳氧羰基的非限制性實例包括苯氧羰基和萘氧羰基。通過羰基鍵結至母體部分。
″芳烷氧羰基″意指芳烷基-O-C(O)-基團，其中芳烷基如前所述。適合的芳烷氧羰基的非限制性實例包括苄氧羰基。通過羰基鍵結至母體部分。
″烷基磺醯基″意指烷基-S(O2)-基團，其中烷基如前所述。優選基團為其中烷基為低級烷基。通過磺醯基鍵結至母體部分。
″芳基磺醯基″意指芳基-S(O2)-基團，其中芳基如前所述。通過磺醯基鍵結至母體部分。
″環烷基烷基″意指環烷基-烷基-，其中環烷基和烷基如前所述。優選基團為其中烷基為低級烷基。通過烷基鍵結至母體部分。
″雜芳烷氧基″意指雜芳烷基-O-基團，其中雜芳烷基如前所述。通過醚氧鍵結至母體部分。
″雜芳基磺醯基″意指雜芳基-S(O2)-基團，其中雜芳基如前所述。通過磺醯基鍵結至母體部分。
″雜芳基硫基″意指雜芳基-S-基團，其中雜芳基如前所述。通過硫鍵結至母體部分。
″雜環基烷基″意指雜環基-烷基-，其中雜環基和烷基如前所述。通過烷基鍵結至母體部分。
術語″取代的″意指指定原子上的一或多個氫由指定一組基團中選出的基團取代，前提是在現有狀況下未超出指定原子的正常原子價且該取代將導致穩定化合物。僅當取代基和/或變量的組合導致穩定化合物時，這樣的組合才是允許的。″穩定化合物″或″穩定結構″意指可足夠穩固地自反應混合物分離至有用純度並調配入有效治療劑中的化合物。
術語″任選取代的″意指由指定基團、殘基或部分任選取代。
關於化合物中部分(如取代基、基團或環)的數量，除非另有定義，否則″一或多個″及″至少一個″意指多至化學上可允許的部分的數量，且本領域技術人員可判定這樣的部分的最大數量。關於包含使用″至少一種式I的化合物″的組合物及方法，可同時給予一至三種式I的化合物，優選為一種。
波浪線 作為鍵一般指可能異構體的混合物或可能異構體中的任一種，例如可能的異構體包含(R)-及(S)-立體化學。舉例而言， 意指包含 和 環系統內所畫的直線，例如 表明指示的直線(鍵)可與可取代的環碳原子中的任一個連接。
如本領域所熟知的，除非另有說明，否則自一具體原子畫出且其中在鍵末端未描繪出部分的鍵表明甲基經該鍵鍵結至該原子。例如 表示 對一化合物而言，術語″分離″或″以分離的形式″意指自合成方法或天然來源或其組合分離後的該化合物物理狀態。對一化合物而言，術語″純化″或″以純化的形式″意指自純化方法或本文所述的方法或本領域技術人員所熟知的方法得到後可通過本文所述或本領域技術人員所熟知的標準分析進行特徵鑑定的足夠純度的該化合物的物理狀態。
應注意假定任一在本文的正文、流程、實施例及表格中具有未滿足價位的雜原子具有滿足其價位的氫原子。
當稱化合物中的官能基為″保護的″時，此意指當該化合物進行反應時，該基團以修飾的形式防止在受保護處的不需要的副反應。本領域普通技術人員了解適合的保護基團，且可參考標準教程，例如T.W.Greene等人的Protective Groups in organic Synthesis(1991)，Wiley，New York。
當在任一組成或式I中出現一次以上的任何變量(例如芳基、雜環、R2等)時，每次出現的定義均與其它每次出現的定義無關。
本文所用的術語″組合物″用以包括一包含指定量的指定成份的產物，及由指定量的指定成份的組合直接或間接產生的任一產物。
本文也涵蓋本發明的化合物的前藥及溶劑合物。本文所用的術語″前藥″表示一化合物，其為在給予受治療者後，通過新陳代謝或化學過程經化學轉化產生式I的化合物或其鹽和/或其溶劑合物的藥物前體。T.Higuchi與V.Stella的Pro-drugs as Novel Delivery Systems(1987)14 of the A.C.S.Symposium Series及Bioreversible Carriers in DrugDesign，(1987)Edward B.Roche編，American PharmaceuticalAssociation and Pergamon Press中已討論了所述前藥，且此兩者通過引用結合到本文中。
″溶劑合物″意指本發明的化合物與一或多個溶劑分子物理性締合。該物理性締合涉及各種程度的離子鍵及共價鍵，包括氫鍵。在某些實例中，例如當一或多個溶劑分子摻入結晶固體的晶格中時，溶劑合物可分離。″溶劑合物″包含溶液相及可分離溶劑合物。適合的溶劑合物的非限制性實施例包括乙醇化物、甲醇化物等。″水合物″為溶劑分子為H2O的溶劑合物。
式I的化合物可形成也處於本發明的範圍內的鹽類。除非另有說明，否則本文中式I的化合物應理解為包括其鹽。本文所用的術語″鹽″表示與無機和/或有機酸形成的酸性鹽，及與無機和/或有機鹼形成的鹼性鹽。此外，當式I的化合物包含諸如(但不限於)吡啶或咪唑的鹼性部分及諸如(但不限於)羧酸的酸性部分時，可形成兩性離子(″內鹽″)且該兩性離子包含於本文所用的術語″鹽″中。儘管其它鹽也適用，但藥學上可接受(意即無毒、生理學上可接受)的鹽為優選。例如，可通過將式I的化合物與一定量(諸如等當量)的酸或鹼於諸如其中鹽可沉澱的介質或水性介質中反應，隨後冷凍乾燥形成式I化合物的鹽。
例示性酸加成鹽類包括醋酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、延胡索酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、磷酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽等。此外，例如在P.Stahl等人Camille G.(編輯)的Handbook ofPharmaceutical Salts.Properties，Selection and Use.(2002)ZurichWiley-VCH；S.Berge等人的Journal of Pharmaceutical Sciences(1977)66(1)1-19；P.Gould，International J.of Pharmaceutics(1986)33 201-217；Anderson等人的The Practice of Medicinal Chemistry(1996)，Academic Press，New York及The Orange Book(Food DrugAdministration，Washington，D.C.在其網站上)中已討論一般認為可適合於自鹼性藥用化合物形成藥學上可用的鹽的酸。這些公開通過引用結合到本文中。
例示性鹼性鹽類包括銨鹽、諸如鈉、鋰及鉀鹽的鹼金屬鹽、諸如鈣及鎂鹽的鹼土金屬鹽、諸如二環己基胺類、叔丁基胺類的有機鹼(例如有機胺類)的鹽及以諸如精氨酸、賴氨酸等的胺基酸形成的鹽。鹼性含氮基團可用諸如低級烷基滷化物(如甲基、乙基和丁基的氯化物、溴化物及碘化物)、硫酸二烷酯(如硫酸二甲酯、二乙酯及二丁酯)、長鏈滷化物(如癸基、月桂基和硬脂醯基的氯化物、溴化物及碘化物)、芳烷基滷化物(如苄基和苯乙基的溴化物)及其它的試劑進行季胺化。
所有此類酸性鹽及鹼性鹽為本發明範圍內的藥學上可接受的鹽，且認為所有酸性及鹼性鹽相當於本發明相應化合物的游離形式。
式I的化合物及鹽，及其溶劑合物及前藥可以互變異構形式(例如作為醯胺或亞氨基醚)存在。所有此類互變異構形式作為本發明的部分涵蓋於本文中。
本發明化合物(包括所述化合物的鹽、溶劑合物及前藥以及所述前藥的鹽及溶劑合物)的所有立體異構體(例如幾何異構體、光學異構體等)，諸如那些因不同取代基上的不對稱碳而存在的立體異構體，包括對映體形式(其甚至在無不對稱碳時也存在)、幾何異構形式、阻轉異構體及非對映形式，如位置異構體(例如4-吡啶基和3-吡啶基)，皆涵蓋於本發明的範圍內。例如，本發明化合物的各立體異構體可大體上不含其它異構體，或例如可作為外消旋體的混合物或與所有其它立體異構體或其它經選擇的立體異構體的混合物存在。如IUPAC1974標準所定義，本發明的手性中心可具有S或R構型。使用術語″鹽″、″溶劑合物″、″前藥″等意欲同等地應用於本發明化合物的對映體、立體異構體、旋轉異構體、互變異構體、位置異構體、外消旋體或前藥的鹽、溶劑合物及前藥。
用式I表示的化合物為用於預防和治療阿爾茨海默氏病的β-分泌酶抑制劑。
本發明的一方面為通過給予哺乳動物治療有效量的至少一種式I化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物來治療患有由BACE-1(天冬氨醯蛋白酶)介導或加重的疾病或病症的哺乳動物(如人)的方法。
″有效量″或″治療有效量″用以描述有效抑制BACE-1並因此對適合的患者產生所要的治療效果的本發明化合物或組合物的量。
優選劑量為每天每kg體重約0.001至1000mg的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物。尤其優選的劑量為每天每口感體重約0.01至30mg的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物。
本發明的另一方面為治療認知或神經退化性疾病諸如阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括給予需要這樣的治療的哺乳動物治療有效量的至少一種式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物。
本發明的另一方面為治療認知或神經退化性疾病諸如阿爾茨海默氏病的方法，該方法包括給予哺乳動物治療有效量的至少一種式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物。
本發明也涉及藥用組合物，其包含至少一種式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物及至少一種藥學上可接受的載體。
本發明也涉及用於治療諸如阿爾茨海默氏病的神經退化性疾病的藥用組合物，其包含治療有效量的至少一種式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物及至少一種藥學上可接受的載體。
對於組合方面，也構思使用不同於式I化合物的任一β-分泌酶抑制劑。可通過下述程序測定β-分泌酶抑制活性。適用的β-分泌酶抑制劑公開於(但不限於)WO 02/02505、WO 02/02506、WO 02/02512、WO02/02518、WO 02/02520及WO 02/088101中。
本發明的又一方面為式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物與如下所述其它化合物的組合。
因此，本發明包括治療諸如阿爾茨海默氏病的神經退化性疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物(如女人或男人)a.一定量的第一化合物，該第一化合物為式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物；及b.一定量的第二化合物，該第二化合物為膽鹼脂酶抑制劑。
組合使用的膽鹼脂酶抑制劑包括乙醯基-和/或丁醯基膽鹼脂酶抑制劑。膽鹼脂酶抑制劑的實例包括他克林、多奈哌齊、利伐斯的明、加蘭他敏(galantamine)、吡啶斯的明(pyridostigmine)及新斯的明(neostigmine)。
因此，本發明包括治療諸如阿爾茨海默氏病的神經退化性疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物(如女人或男人)a.一定量的第一化合物，該第一化合物為式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物；及b.一定量的第二化合物，該第二化合物為抗澱粉狀蛋白抗體。例如，在Hock等人的Nature Medicine，8(2002)，第1270-1275頁中已描述抗澱粉狀蛋白抗體。
因此，本發明包括治療諸如阿爾茨海默氏病的神經退化性疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物(如女人或男人)a.一定量的第一化合物，該第一化合物為式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物；及b.一定量的第二化合物，該第二化合物為抗炎化合物。抗炎化合物的實例包括(但不限於)非類固醇抗炎藥，諸如雙氯芬酸(Voltaren、Cataflam)、二氟尼柳(diflunisal)(Dolobid)、依託度酸(Lodine)、氟比洛芬(flurbiprofen)(Ansaid)、布洛芬(Motrin、Advil)、吲哚美辛(Indocin)、酮洛芬(Orudis、Oruvail)、酮咯酸(Toradol)、萘丁美酮(nabumetone)(Relafen)、萘普生(Naprosyn、Alleve)、丙嗪(Daypro)、吡羅昔康(piroxicam)(Feldene)、舒林酸(Clinoril)、託美丁(tolmetin)(Tolectin)、塞來考昔(Celebrex)及羅非考昔(Vioxx)。
因此，本發明包括治療諸如阿爾茨海默氏病的神經退化性疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物(如女人或男人)a.一定量的第一化合物，該第一化合物為式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物；及b.一定量的第二化合物，該第二化合物為γ-分泌酶抑制劑。可通過本領域已知的程序測定用於本發明組合的γ-分泌酶抑制劑。典型的γ-分泌酶抑制劑包括(但不限於)WO 03/013527、US 6,683,091、WO03/066592、2003年9月16日申請的USSN 10/663,042、WO 00/247671、WO 00/050391、WO 00/007995及WO 03/018543中所述的γ-分泌酶抑制劑。
因此，本發明包括治療諸如阿爾茨海默氏病的神經退化性疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物(如女人或男人)a.一定量的第一化合物，該第一化合物為式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物；及
b.一定量的第二化合物，該第二化合物為HMG-CoA還原酶抑制劑化合物。與式I的化合物組合使用的HMG-CoA還原酶抑制劑包括″他汀類″，例如阿託伐他汀、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)及羅蘇伐他汀。
因此，本發明包括治療諸如阿爾茨海默氏病的神經退化性疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物(如女人或男人)a.一定量的第一化合物，該第一化合物為式I的化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物；及b.一定量的第二化合物，該第二化合物為N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑。例如，適合的N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑為美盧君。
藥物製劑優選為單位劑型。在該劑型中，製劑細分成包含適當量活性組分的適當分級的單位劑量，例如為達到所要的目的的有效量。
根據具體應用，製劑單位劑量中活性化合物的量可自約1mg至約1000mg之間變化或調整，優選為約1mg至約50mg，更優選為約1mg至約25mg。
使用的實際劑量可視患者要求及所治療病症的嚴重程度而變化。通過本領域的技術可確定針對具體情況的適當給藥方案。為方便起見，需要時，可在給藥期間將總日劑量分開並分次給予。
鑑於諸如患者年齡、病症及體重以及所治療症狀的嚴重程度的因素，根據主治臨床醫師的判斷可調整本發明化合物和/或其藥學上可接受的鹽的給藥量及給藥頻率。典型的口服給藥的推薦日劑量方案可為每日約1mg至約300mg，優選為每日1mg至50mg，分二至四次給藥。
鑑於諸如患者年齡、病症及體重以及治療症狀的嚴重程度的因素，根據主治臨床醫師的判斷可調整組合(不同於式I化合物的β-分泌酶抑制劑、NSAIDS、他汀類(statin)藥物、膽鹼脂酶抑制劑等)的化合物及或其藥學上可接受的鹽類的給藥量及給藥頻率。
為自本發明所述的化合物製備藥用組合物，惰性的、藥學上可接受的載體可為固體或液體。固體形式製劑包括散劑、片劑、可分散顆粒、膠囊、扁囊劑及栓劑。散劑和片劑可包含約5至約95％的活性成份。適合的固體載體為本領域已知，例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖或乳糖。片劑、散劑、扁囊劑及膠囊可用作適合於口服給藥的固體劑型。可於A.Gennaro編的Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania中發現藥學上可接受的載體的實例及製備各種組合物的方法。
為製備栓劑，首先將諸如硬脂肪酸甘油酯類或可可油的混合物的低熔點蠟熔融，通過攪拌將活性成份均勻分散於其中。然後將熔融均勻混合物注入適當大小的模具中，冷卻並因此固化。
液體形式製劑包括溶液、懸浮液及乳液。液體形式製劑的實例可為用於非經腸注射的水或水-丙二醇溶液。液體形式製劑也可包括用於鼻內給藥的溶液。
適用於吸入的氣溶膠製劑可包括溶液或粉末形式的固體，其可與諸如惰性壓縮氣體的藥學上可接受的載體組合。
也包括用於口服或非經腸給藥的可在使用前立刻轉變成液體形式製劑的固體形式製劑。此類液體形式包括溶液、懸浮液及乳液。
本發明的化合物也可經皮傳遞。經皮組合物可為乳膏、洗液、氣溶膠和/或乳液形式，且為達此目的其可如本領域所熟知的包含於基質型或貯庫型經皮貼片中。
優選經口給予該化合物。
藥物製劑優選為單位劑型。在該劑型中，製劑細分成包含適當量活性組分的單位劑量，例如為達成所要的目的的有效量。
當式I的化合物與不同於式I化合物的β-分泌酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、非類固醇抗炎藥、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、膽鹼脂酶抑制劑或抗澱粉狀蛋白抗體組合以治療認知病症或神經退化性病症時，可同時或順序共同給予所述活性組分，或可給予包含式I的化合物及其它在藥學上可接受的載體中的其它藥物之一的單一藥用組合物。可以諸如膠囊、片劑、散劑、扁囊劑、懸浮液、溶液、栓劑、經鼻噴霧等的任一常規的經口或非經腸形式單獨或一起給予所述組合的組分。可由公開材料確定不同於式I化合物的β-分泌酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、非類固醇抗炎藥、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、膽鹼脂酶抑制劑或抗澱粉狀蛋白抗體的劑量，且該劑量為每kg體重0.001至100mg之間。
當給予式I的化合物與不同於式I化合物的β-分泌酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、非類固醇抗炎藥、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、膽鹼脂酶抑制劑或抗澱粉狀蛋白抗體的各個分開的藥用組合物時，可將其於藥劑盒的形式提供，該藥劑盒包含於一單獨的包裝中，一個容器包含在藥學上可接受的載體中的式I化合物，而另外的分開的容器含有於藥學上可接受的載體中的其它藥物，其中式I化合物及其它藥物以使該組合在治療學上有效的量存在。例如，當必須以不同時間間隔給予組分時或當組分為不同劑型時，藥劑盒有利於聯合給予。
本發明也包括多藥物組合物、藥劑盒及治療方法，例如式I的化合物可與HMG-CoA還原酶抑制劑和非類固醇抗炎藥聯合給藥。
在下列製備及實施例中，通過本領域技術人員已知的方法，如下列反應流程所示使用溶液相或固體相合成法可製備式I的化合物，但本領域技術人員將認識到其它程序也適用。
在下列流程及實施例中，使用下列縮寫甲基Me；乙基Et；丙基Pr；丁基Bu；苄基Bn乙酸乙酯EtOAc苄氧羰基CbzN，N-二甲基甲醯胺DMF1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC或EDCI
室溫RT小時h分鐘min保留時間tR三氟乙酸TFA四氫呋喃THF1-羥基苯並三唑HOBt甲醇MeOH乙醇EtOH乙酸AcOH二甲亞碸DMSO二異丙基氨化鋰LDA叔-二甲基甲矽烷基氯TBSCI叔-二甲基矽烷基TBS三苯基膦PPh3偶氮二甲酸二異丙酯DIAD溴化銅(I)-二甲基硫CuBr-Me2S叔丁氧羰基Boc四(三苯基膦)鈀Pd(PPh3)4三苯基膦PPh3四丁基氟化銨TBAF三乙胺Et3N、NEt3或TEA硼氫化鋰LiBH4苄基溴BnBr二碳酸二叔丁酯(Boc)2O4-二甲氨基吡啶DMAP丁基鋰BuLi苄基氯BnCl
乙二醯氯(COCl)2製備型薄層層析PTLC薄層層析TLC核磁共振NMR液相層析質譜法LCMS二異丙胺DIPA二甲基乙醯胺DMA新戊醯氯PivCl。
一般流程
製備實施例1 步驟1 將丙胺(150ml，1.82mol)添加至在冰水浴中的4-氯-1-丁醇(49.5g，0.456mmol)中。使混合物緩慢升溫至RT並攪拌64h。然後將混合物回流5h並在減壓下蒸發。使殘餘物在乙醚(3×250ml)與40％NaOH水溶液(400ml)之間分配。合併的有機層用MgSO4乾燥、經濃縮並蒸餾得到產物(14.87g，25％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝3.56(m，4H)，2.59(m，4H)，1.4-1.8(m，6H)，0.93(m，3H)。
步驟2 將步驟1的產物(8.655g，66.07mmol)、TBSCI(20.12g，133.5mmol)、咪唑(13.50g，198.3mmol)及催化量的DMAP的無水CH2Cl2(180ml)溶液於RT下攪拌16h。用0.5N NaOH(100ml)洗滌混合物，乾燥(Na2SO4)，濃縮並溶解於DMF(20ml)中。將HOBt(10.73g，79.45mmol)、EDCl(15.38g，80.25mmol)、三乙胺(Et3N、NEt3或TEA)(29.0ml，208mmol)及間苯二甲酸單甲酯(10.23g，56.78mmol)添加至所得溶液中。將混合物於RT下攪拌3天並蒸發至乾燥。使殘餘物在CH2Cl2(200ml)與0.5N NaOH(200ml)之間分配。有機層用NH4Cl水溶液(100ml)洗滌，用MgSO4乾燥並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-3％)純化得到產物(8.829g，38％)。MS m/e 408(M+H)+。
步驟3 將步驟2的產物(8.829g，21.69mmol)與LiOH-H2O(1.021g，24.33mmol)於MeOH(75ml)及水(25ml)中的混合物於RT下攪拌16h。混合物經蒸發至乾燥，使殘留物溶解於DMF(80ml)中。將三乙胺(3.0ml，21mmol)、EDCl(4.233g，22.08mmol)、HOBt(2.974g，22.01mmol)及L-酪氨酸甲酯(4.235g，21.69mmol)添加至所得溶液中。將混合物於RT下攪拌16h並濃縮。使殘留物在CH2Cl2(250ml)與NH4Cl水溶液(50ml)之間分配。有機層用5％碳酸氫鈉(100ml)洗滌，用MgSO4乾燥並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-3.5％)純化得到產物(7.84g，63％)。MSm/e571(M+H)+。
步驟4 將1M TBAF的THF(9.2ml)溶液添加至步驟3產物(3.50g，6.14mmol)的THF(100ml)溶液中，將混合物於RT下攪拌4.5h。混合物經濃縮並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-4％)純化得到產物(2.40g，86％)。MSm/e 457(M+H)+。
步驟5
將步驟4的產物(1.22g，2.68mmol)、三丁基膦(995μl，4.01mmol)及1，1′-(偶氮二羰基)二哌啶(1.01g，4.01mmol)於苯(150ml)及THF(19ml)中的混合物於RT下攪拌22h。混合物經濃縮，使殘留物溶解於EtOAc(200ml)中並用1N HCl(100ml)洗滌。有機層用飽和碳酸氫鈉及鹽水萃取，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-2％)純化得到產物(0.583g，50％)。MSm/e 439(M+H)+。
步驟6 將2M硼氫化鋰的THF(3.3ml)溶液添加至在冰水浴中的步驟5產物(580mg，1.32mmol)的無水EtOH(20ml)溶液中。將混合物在冰水浴中攪拌10min，然後於RT下攪拌4h。用水(1ml)及5％檸檬酸(5ml)猝滅反應。混合物經濃縮並用EtOAc(3×50ml)萃取。合併的有機層用飽和碳酸氫鈉(20ml)及鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-5％)純化得到產物(502mg，93％)。MSm/e 411(M+H)+。
步驟7 將(Boc)2O(22.9g，105mmol)緩慢添加至在冰水浴中的哌嗪酮(10.0g，100mmol)、三乙胺(20.2g，200mmol)及DMAP(50mg)的CH2Cl2(250ml)溶液中。將混合物在冰水浴中攪拌1h並於RT下攪拌4.5h。混合物用CH2Cl2(250ml)稀釋，用水(250ml)、5％檸檬酸(200ml)、1N HCl(200ml)、飽和碳酸氫鈉(20ml)及鹽水洗滌。有機層用MgSO4乾燥並經濃縮得到產物(18.0g，90％)。MSm/e 201(M+H)+。
步驟8 在冰水浴中將氫化鈉(2.40g，60.0mmol)及苄基氯(6.60g，52.5mmol)添加至步驟7產物(10.0g，50.0mmol)的無水DMF(250ml)溶液中。將混合物於RT下攪拌4.5h。用水(10ml)猝滅反應，用CH2Cl2(500ml)稀釋，並用水(2×250ml)洗滌。有機層用飽和NH4Cl(200ml)萃取，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-5％)純化得到產物(10.7g，74％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.2-7.3(m，5H)，4.57(s，2H)，4.10(s，2H)，3.53(m，2H)，3.19(m，2H)，1.41(s，9H)。
步驟9 將步驟6的產物(123mg，0.300mmol)及Dess-Martin periodinane(256mg，0.602mmol)於CH2Cl2(15ml)中的混合物於RT下攪拌30min。混合物用CH2Cl2(50ml)稀釋，用1N Na2S2O3(20ml)及飽和NaHCO3洗滌，用MgSO4乾燥並經濃縮得到粗品醛。
將2M LDA(0.45ml)添加至在乾冰丙酮浴中的步驟8產物(261mg，0.900mmol)的無水THF(5ml)溶液中，將混合物攪拌1h。添加上述醛的THF(5ml)溶液，將混合物在乾冰丙酮浴中攪拌2h。用飽和NH4Cl(4ml)猝滅反應，用CH2Cl2(50ml)稀釋，並用水(30ml)洗滌。有機層用飽和NH4Cl及鹽水萃取，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(100mg，48％)。MSm/e 699(M+H)+。
步驟10 將步驟9產物(100mg，0.143mmol)的15％TFA/ CH2Cl2(10ml)溶液於RT下攪拌75min。混合物經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到流分A(15mg，18％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝6.4-7.8(m，13H)，5.83(m，1H)，3.9-5.0(m，6H)，2.7-3.8(m，11H)，1.5-2.0(m，5H)，1.2-1.5(m，3H)，0.4-1.0(m，3H)。MSm/e 599(M+H)+。
流分B(18mg，21％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.0-7.6(m，10H)，6.6-7.0(m，3H)，5.7-6.3(m，1H)，3.8-4.8(m，6H)，2.6-3.7(m，12H)，1.2-2.0(m，7H)，0.98(m，1H)，0.62(m，2H)。MSm/e 599(M+H)+。
製備實施例2 步驟1
將正溴丙烷(24.6g，0.200mol)添加至在冰水浴中的烯丙胺(45.7g，0.800mol)中，將混合物於RT下攪拌3天。混合物經蒸餾得到固體，將5g該固體溶解於DMF(50ml)中。將間苯二甲酸單甲酯(1.86g，10.0mmol)、HOBt(2.70g，20.0mmol)及EDCl(3.83g，20.0mmol)添加至該溶液中。將混合物於RT下攪拌16h並用EtOAc(300ml)及1NNaOH(100ml)稀釋。有機層用1N HCl(100ml)、水(100ml)、飽和碳酸氫鈉(100ml)及鹽水(100ml)洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮得到產物(2.20g，84％)。MSm/e 262(M+H)+。
步驟2 將步驟1的產物(2.20g，8.42mmol)於MeOH(25ml)及1N HCl(18ml)中的混合物於RT下攪拌18h。混合物經濃縮，殘留物在1N HCl(20ml)與乙醚(2×100ml)之間分配。合併的有機層用Na2SO4乾燥並經濃縮得到產物(2.10g，100％)。MS m/e 248(M+H)+。
步驟3 將咪唑(9.26g，136mmol)及TBSCl(7.56g，50.16mmol)添加至N-Boc-D-絲氨酸甲酯(10.0g，45.6mmol)的DMF(150ml)冰冷溶液中。將混合物於RT下攪拌20h並經濃縮。殘餘物用EtOAc(300ml)溶解並用飽和NH4Cl及碳酸氫鈉萃取。有機層用MgSO4乾燥並經濃縮得到產物(16.5g，100％)。MSm/e 356(M+Na)+。
步驟4
將2M硼氫化鋰THF(37.1ml)溶液緩慢添加至步驟3產物(16.5g，45.6mmol)的THF(150ml)溶液中。將混合物於RT下攪拌2.5h。用飽和NH4Cl猝滅反應並用EtOAc(2×250ml)萃取。合併的有機層用飽和NH4Cl(100ml)、飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌，經乾燥並濃縮得到產物(14.5g，100％)。MS m/e 306(M+H)+。
步驟5 將DIAD(10.76g，53.21mmol)添加至三苯基膦(13.95g，53.19mmol)的THF(400ml)及CH3CN(50ml)冰冷溶液中。將混合物攪拌15min，且經15min添加步驟4的產物(8.20g，26.2mmol)的THF(100ml)溶液。添加完成後，移除冰水浴，將混合物於RT下攪拌2天。混合物經濃縮並通過柱層析(梯度EtOAc/己烷0-5％)純化得到產物(3.75g，50％)。MSm/e 288(M+H)+。
步驟6 將烯丙醇(8.90g，0.154mol)緩慢添加至60％NaH(6.40g，0.160mol)的無水DMA(400ml)懸浮液中。將混合物於RT下攪拌1h。添加3，5-二氟溴苯(30.0g，0.155mol)，將混合物於RT下攪拌24h。用水(1.51)猝滅反應並用乙醚(4×300ml)萃取。合併的有機層用鹽水(500ml)洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(己烷)純化得到產物(14.3g，40％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝6.81(m，2H)，6.53(m，1H)，5.96(m，1H)，5.34(m，2H)，4.46(m，2H)。
步驟7
將鎂屑(292mg，12.0mmol)添加至火焰乾燥燒瓶中，隨後添加三分之一的步驟6的產物(2.31g，10.0mmol)的THF(16ml)溶液。用二溴乙烷(50μl)啟動反應，然後緩慢添加剩餘的步驟6的產物溶液。將混合物於RT下攪拌30min，並於-40℃下將其添加至CuBr-Me2S(310mg，1.51mmol)的THF(30ml)懸浮液中。將混合物於4℃下攪拌30min，添加步驟5的產物(1.20g，4.17mmol)的無水乙醚(15ml)溶液。將所得混合物於4℃下攪拌1h，然後於RT下攪拌3天。用飽和NH4Cl(100ml)猝滅反應並用EtOAc(2×150ml)萃取。合併的有機層用飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度EtOAc/己烷0-5％)純化得到產物(1.00g，55％)。MS m/e440(M+H)+。
步驟8 將步驟7的產物(500mg，1.14mmol)的CH2Cl2(12ml)及4N HCl/二氧雜環己烷(6ml)溶液於RT下攪拌20h。混合物經濃縮，使殘餘物在CH2Cl2(50ml)與5N NH4OH(20ml)之間分配。有機層用K2CO3乾燥並經濃縮得到產物(345mg，100％)。MS m/e 226(M+H)+。
步驟9
將步驟8的產物(445mg，1.98mmol)、步驟2的產物(539mg，2.18mmol)、HOBt(442mg，3.27mmol)及EDCl(627mg，3.27mmol)於DMF(20ml)中的混合物於RT下攪拌3天。混合物經濃縮，且殘留物在CH2Cl2(200ml)與1N NaOH之間分配。有機層用5％檸檬酸及鹽水洗滌，用MgSO4乾燥並經濃縮。殘餘物於MeOH(20ml)及1N NaOH(10ml)中的溶液於RT下攪拌4h。混合物經濃縮，使殘留物在EtOAc(150ml)與飽和NaHCO3之間分配。有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-2.5％)純化得到產物(405mg，45％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.63(m，2H)，7.37(m，1H)，7.28(m，1H)，7.07(m，1H)，6.56(m，2H)，6.43(m，1H)，5.95(m，1H)，5.5-5.9(m，1H)，5.33(m，1H)，5.0-5.25(m，3H)，4.42(m，2H)，4.23(m，1H)，4.07(m，1H)，3.5-3.8(m，3H)，3.36(m，2H)，3.06(m，1H)，2.86(m，2H)，1.3-1.7(m，2H)，0.6-1.0(m，3H)。
步驟10 將步驟9的產物(400mg，0.880mmol)及第二代Grubb催化劑(37mg，0.044mmol)於CH2Cl2(200ml)中的混合物於50℃下加熱2.5h，然後於RT下加熱16h。混合物經濃縮並通過柱層析(梯度MeOH/CH2Cl20-2.5％)純化得到產物(340mg，91％)。MS m/e 427(M+H)+。
步驟11 將步驟10的產物(340mg，0.797mmol)、甲酸銨(50mg，0.79mmol)及10％Pd/C(50mg)的混合物在H2(1atm)下攪拌18h。混合物經過濾、濃縮，且未經進一步純化即使用。將該物質(129mg，0.301mmol)與Dess-Martin periodinane(510mg，1.20mmol)於CH2Cl2(25ml)中的混合物於RT下攪拌2h。用1N Na2S2O3猝滅反應，且在飽和NaHCO3與CH2Cl2(100ml)之間分配。有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥並經濃縮得到粗品醛。
將2M LDA(0.45ml)添加至在乾冰丙酮浴中的製備實施例1中步驟8的產物(261mg，0.900mmol)的無水THF(5ml)溶液中，將混合物攪拌1h。添加上述醛的THF(5ml)溶液，混合物在乾冰丙酮浴中攪拌1h。用飽和NH4Cl(5ml)猝滅反應並用CH2Cl2(50ml)稀釋。有機層用水及鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(120mg，56％)。MS m/e 717(M+H)+。
步驟12
將步驟11的產物(120mg，0.167mmol)及TFA(2ml)於CH2Cl2(8ml)中的混合物於RT下攪拌1.5h。混合物經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到餾份A(22mg，21％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.05-7.8(m，9H)，6.7-7.0(m，1H)，6.50(m，2H)，6.36(m，1H)，4.4-5.0(m，3H)，3.9-4.3(m，2H)，3.4-3.9(m，3H)，2.7-3.4(m，9H)，1.2-2.1(m，8H)，0.94(m，2H)，0.59(m，1H)。MS m/e 617(M+H)+。
餾份B(17mg，16％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.45-7.65(m，2H)，7.1-7.3(m，8H)，6.95(m，1H)，6.56(m，1H)，6.37(m，1H)，4.68(m，2H)，3.9-4.4(m，3H)，2.7-3.9(m，13H)，1.2-2.2(m，7H)，1.04(m，2H)，0.58(m，1H)。MS m/e 617(M+H)+。
餾份C(12mg，12％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.2-7.8(m，8H)，6.75-7.0(m，1H)，6.5-6.7(m，2H)，6.2-6.4(m，2H)，4.4-4.8(m，3H)，3.6-4.2(m，3H)，2.7-3.4(m，10H)，1.2-2.2(m，8H)，0.95(m，2H)，0.61(m，1H)。MS m/e 617(M+H)+。
製備實施例3 步驟1
將衣康酸(13.0g，100.0mmol)及烯丙胺(5.71g，100mmol)於無水甲苯(100ml)中的混合物在密閉管中於125℃下加熱16h。混合物冷卻至RT後，添加1N NaOH水溶液(400ml)，且水層用乙醚(2×200ml)萃取。水層用濃HCl酸化至pH1，並用乙醚(10×300ml)萃取。合併的有機部分經濃縮，且殘餘物用CH2Cl2(200ml)溶解並用鹽水洗滌。有機層用MgSO4乾燥，經濃縮並冷凍乾燥得到淡黃色固體(9.60g，57％)。MS m/e 170(M+H)+。
步驟2 將新戊醯氯(6.45g，53.5mmol)添加至於-45℃下步驟1的產物(8.60g，50.9mmol)及三乙胺(15.4g、153mmol)的無水THF(200ml)溶液中。將混合物於-45℃下攪拌1h，然後將其添加至氯化鋰(4.75g，112mmol)及(S)-4-苄基-2-唑烷酮(9.02g，50.9mmol)的THF(100ml)懸浮液中。將所得混合物於RT下攪拌16h並過濾。濾液經濃縮，使其溶解於EtOAc(700ml)中，並用1N HCl(200ml)、飽和碳酸氫鈉(200ml)及鹽水洗滌。有機層用MgSO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度0-75％EtOAc/己烷)純化得到產物(7.20g，43％)。MS m/e 329(M+H)+。
步驟3 將30％過氧化氫(4ml)及氫氧化鋰(0.672g，16.0mmol)添加至在冰水浴中的步驟2的產物(2.63g，8.01mmol)的THF(30ml)及水(8ml)溶液中。將混合物於0℃下攪拌7h。添加10％亞硫酸氫鈉水溶液(40ml)，將混合物於RT下攪拌16h。混合物經濃縮，使殘餘物在1NNaOH(8ml)與CH2Cl2(2×100ml)之間分配。將水層於0℃酸化至pH2，並用乙醚(5×100ml)萃取。合併的有機部分經MgSO4乾燥並濃縮得到產物(1.00g，74％)。MS m/e 170(M+H)+。
步驟4 將製備實施例2、步驟8的產物(3.10g，13.0mmol)及碳酸鉀(5.39g，39.0mmol)的EtOH(30ml)及水(90ml)溶液於70℃下加熱。添加苄基溴(3.42ml，28.6mmol)，混合物於70℃下攪拌2.5h。除去EtOH，且殘餘物用乙醚(2×200ml)萃取。有機層用鹽水洗滌，用K2CO3乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度0-10％EtOAc/己烷)純化得到產物(4.40g，83％)。MS m/e 406(M+H)+。
步驟5 將DMSO(938mg，12.0mmol)添加至在乾冰丙酮浴中的乙二醯氯(762mg，6.00mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液中。5min後，添加步驟4的產物(2.03g，5.01mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液，將混合物攪拌1h。添加三乙胺(2.42g，23.9mmol)，2min後移除冷卻浴。將混合物攪拌30min並用水(50ml)稀釋。添加CH2Cl2(100ml)，水層用CH2Cl2(2×100ml)萃取。合併的有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥並經濃縮得到未進一步純化的醇。
將1.6M丁基鋰的己烷(4.13ml，6.61mmol)溶液添加至在乾冰丙酮浴中的二異丙胺(667mg，6.59mmol)的THF(5ml)溶液中。5min後將混合物置於冰水浴中並攪拌20min。將溶液再一次在乾冰丙酮浴中冷卻，並添加製備實施例1中步驟8的產物(1.74g，5.99mmol)的THF(20ml)溶液。將混合物攪拌1h。添加上述醛的THF(30ml)溶液，允許混合物緩慢升溫至RT並攪拌16h。用飽和NH4Cl(20ml)猝滅反應並用乙醚(3×100ml)萃取。合併的有機層用5％檸檬酸、飽和NaHCO3及鹽水洗滌，用Na2SO4乾燥，經濃縮並通過柱層析(梯度EtOAc/己烷0-40％)純化得到產物(1.20g，35％)。MS m/e 694(M+H)+。
步驟6 將步驟5的產物(1.00g，1.44mmol)的MeOH(15ml)溶液用N2脫氣。添加無水碳酸鉀(594mg，4.30mmol)及Pd(PPh3)4(324mg，0.280mmol)，將混合物於RT下攪拌5h。混合物經過濾並濃縮。殘留物溶解於CH2Cl2(150ml)中並用5％檸檬酸、飽和NaHCO3及鹽水洗滌。有機層用MgSO4乾燥並經濃縮得到產物(980 mg，100％)。MS m/e 654(M+H)+。
步驟7
將步驟6的產物(980mg，1.44mmol)、20％Pd(OH)2/C(980mg)及AcOH(1ml)於EtOH(50ml)中的混合物在H2(1atm)下攪拌12h。混合物經過濾並濃縮得到產物(682mg，100％)。MS m/e 474(M+H)+。
步驟8 將步驟7的產物(66mg，0.14mmol)、步驟3的產物(28mg，0.17mmol)、HOBt(38mg，0.28mmol)、EDCI(53mg，0.28mmol)及三乙胺(40μl，0.28mmol)於CH2Cl2(5ml)中的混合物於RT下攪拌22h。添加1N NaOH(10ml)，將混合物攪拌30min。混合物用CH2Cl2(50ml)稀釋，用5％檸檬酸、水及鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(66mg，76％)。MS m/e 625(M+H)+。
步驟9 將步驟8的產物(66mg，0.11mmol)、碳酸鉀(146mg，1.06mmol)及烯丙基溴(14mg，0.12mmol)於丙酮(4ml)中的混合物於RT下攪拌18h。使混合物在5％檸檬酸與CH2Cl2(50ml)之間分配。有機層用飽和NaHCO3及鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(40 mg，57％)。MS m/e 665(M+H)+。
步驟10 將第二代Grubb催化劑(5mg，0.006mmol)添加至步驟9的產物(40mg，0.060mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液中。混合物用N2脫氣5min，然後加熱至50℃，歷時2小時。混合物經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(30mg，79％)。MS m/e 637(M+H)+。
步驟11 將步驟10的產物(30mg，0.047mmol)及10％Pd/C(30mg)於EtOH(5ml)中的混合物在H2(1atm)下攪拌75min。混合物經過濾並濃縮得到產物(30 mg，100％)。MS m/e 639(M+H)+。
步驟12
將步驟11的產物(30mg，0.047mmol)及TFA(1ml)的CH2Cl2(4ml)溶液於RT下攪拌1.5h。混合物經濃縮並通過PTLC(5％2MNH3/MeOH-95％CH2Cl2)純化得到產物(20mg，79％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.25-7.35(m，5H)，6.53(m，1H)，6.42(m，2H)，4.67(d，1H，J＝14.4Hz)，4.44(d，1H，J＝14.4Hz)，4.36(m，1H)，3.8-4.2(m，4H)，3.60(m，1H)，2.8-3.4(m，9H)，2.69(m，1H)，2.54(m，2H)，1.84(m，2H)，1.66(m，1H)，1.47(m，2H)。LCMS tR＝2.88 min m/e 539(M+H)+。
製備實施例4 步驟1 於室溫下將2.0mL 2M硼烷-二甲硫的THF溶液添加至製備實施例3中步驟7的產物(236mg，0.5mmol，前面步驟的粗產物)的無水THF(20mL)溶液中。將該混合物於60-70℃加熱過夜。添加MeOH(30mL)後，混合物於70℃另外加熱2h。使混合物冷卻至RT並於旋轉蒸發儀中濃縮至乾燥。添加另外的MeOH(30mL)並濃縮至乾燥。產物未經純化，直接用於下一步驟。MSm/e 460(M+H)+。
步驟2 將製備實施例3中步驟3的產物(102mg，0.60mmol)、HOBt(162mg，1.2mmol)及EDCI(230mg，1.2mmol)的CH2Cl2(6ml)溶液於RT下攪拌1.5h。然後添加步驟1產物(粗產物，約0.5mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液，隨後添加三乙胺(240mg，2.4mmol)。將混合物於RT下攪拌22h。添加1N NaOH(20ml)，將混合物攪拌45min。混合物用CH2Cl2(150ml)稀釋，用H2O、5％檸檬酸及鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過ISCO(用CH2Cl2洗脫10min，0-2.5％MeOH/CH2Cl2洗脫35min)純化得到產物(90mg，三步29％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.22-7.32(m，5H)，6.58(d，1H，J＝8.8Hz)，6.39(m，2H)，6.25(m，1H)，3.79-3.93(m，5H)，3.27-3.58(m，7H)，3.06(d，1H，J＝10Hz)，2.96(m，1H)，2.77(d，1H，J＝10.8Hz)，2.50-2.56(m，2H)，2.05-2.32(m，4H)，1.38(s，9H)。MS m/e 611(M+H)+。
步驟3
將步驟3的產物(40mg，0.066mmol)、碳酸鉀(91mg，0.66mmol)及烯丙基溴(18mg，0.15mmol)於丙酮(5ml)中的混合物於60-70℃下攪拌18小時。使混合物冷卻至RT，經過濾並濃縮。使殘餘物溶解於CH2Cl2(50ml)中。有機層用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(27mg，63％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.22-7.30(m，5H)，6.41(m，3H)，5.96(m，1H)，5.84(d，1H，J＝8.9Hz)，5.62(m，1H)，5.37(dd，1H，J＝1.6 Hz)，5.33(dd，1H，J＝1.6Hz)，5.23(dd，1H，J＝1.2 Hz，J＝10Hz)，5.09-5.14(m，2H)，4.43(dt，2H，J＝6.4Hz，J＝1.5Hz)，3.69-3.95(m，5H)，3.26-3.58(m，7H)，3.08(d，1H，J＝10Hz)，2.92(m，1H)，2.77(d，1H，Hz)，2.63(m，1H)，2.42(m，2H)，2.22(d，1H，J＝9Hz)，2.06(m，1H)，1.37(s，9H)。MS m/e 651(M+H)+。
步驟4 將第二代Grubb催化劑(7.8mg，0.0092mmol)添加至步驟3產物(60mg，0.092mmol)的CH2Cl2(40ml)溶液中。混合物用N2脫氣5min，然後加熱至40-50℃ 1h。混合物經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(52mg，91％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.22-7.32(m，5H)，6.51(d，1H，J＝8.8Hz)，6.40(d，1H，J＝10Hz)，6.32(s，1H)，6.26(d，1H，J＝8.8Hz)，5.65(m，2H)，4.60(s，2H)，4.56(d，1H，J＝3.2 Hz)，4.00(s，1H)，3.85(d，2H，J＝10 Hz)，3.17-3.51(m，6H)，2.62-2.97(m，6H)，2.47(t，1H，J＝12 Hz)，2.05-2.15(m，2H)，1.78-1.88(m，2H)，1.41(s，9H)。MS m/e 623(M+H)+。
步驟5 將步驟4的產物(52mg，0.084mmol)及20％ Pd(OH)2/C(52mg)於EtOH(5ml)及乙酸(0.4mL)中的混合物於H2(1atm)下攪拌90min。混合物經過濾並濃縮。使殘餘物溶解於CH2Cl2(50ml)中並用飽和NaHCO3及鹽水洗滌，然後用K2CO3乾燥並經濃縮得到產物(33mg，74％)。MS m/e 535(M+H)+。
步驟6 將三乙胺(20mg)添加至步驟5的產物(33mg，0.062mmol)的無水CH2Cl2(6ml)冰冷溶液中，隨後添加間甲苯磺醯氯(13mg，0.068mmol)的CH2Cl2溶液。將該混合物於0℃下攪拌1h。然後用CH2Cl2(50ml)稀釋，用5％檸檬酸、飽和NaHCO3及鹽水洗滌並用MgSO4乾燥。溶液經濃縮並通過PTLC(5％MeOH/CH2Cl2)純化得到產物(27mg，63％)。MSm/e 689(M+H)+。
步驟7 將步驟6的產物(27mg，0.039mmol)及TFA(1ml)的CH2Cl2(4ml)溶液於RT下攪拌1h。混合物經濃縮並通過PTLC(5％ 2M NH3/MeOH-95％CH2Cl2)純化得到產物(23mg，94％)。1H-NMR(CDCl3)δ＝7.49(m，2H)，7.38(m，2H)，6.53(d，1H，J＝8Hz)，6.45(s，1H)，6.39(m，1H)，4.01-4.17(m，3H)，3.82-3.85(m，2H)，3.64(m，1H)，3.23-3.43(m，3H)，2.85-3.10(m，7H)，2.66-2.70(m，2H)，2.50-2.57(m，2H)，2.40(s，3H)，1.88(s，寬，1H)，1.65(m，1H)，1.39-1.47(m，2H)。LCMS tR＝2.99min m/e589(M+H)+。
BACE-1克隆、蛋白質表達及純化BACE1(sBACE1，對應於胺基酸1-454)的預定可溶形式可通過PCR使用advantage-GC cDNA PCR藥劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)自全長BACE1 cDNA(pCDNA4/mycHisA構造中的全長人類BACE1cDNA；多倫多大學(University of Toronto))生產。pCDNA4-sBACE1myc/His的HindIII/PmeI片段使用Klenow來鈍端並亞克隆入pFASTBACI(A)(Invitrogen)的Stu I位點。通過DH10Bac細胞(GIBCO/BRL)轉移產生sBACE1 mycHis重組bacmid。隨後使用CellFectin(Invitrogen，San Diego，CA)將sBACE1 mycHis bacmid構造轉染至sf9細胞中，從而產生重組杆狀病毒。使Sf9細胞於用3％熱滅活FBS及0.5 X青黴素/鏈黴素溶液(Invitrogen)補充的SF 900-II培養基(Invitrogen)中生長。5毫升高滴度斑塊純化的sBACEmyc/His病毒用於感染1L對數生長的sf9細胞72小時。通過以3000xg離心15分鐘沉澱完整細胞。收集包含分泌性sBACE1的上澄液並用100 mM HEPES(pH8.0)50％v/v稀釋。將稀釋的培養基裝載於Q-瓊脂糖凝膠柱上。Q-瓊脂糖凝膠柱用緩衝液A(20mM HEPES，pH8.0，50mM NaCl)洗滌。
用緩衝液B(20mM HEPES，pH8.0，500mM NaCl)自Q-瓊脂糖凝膠柱洗脫蛋白質。合併自Q-瓊脂糖凝膠柱的蛋白質峰並將其裝載於Ni-NTA瓊脂糖柱上。然後用緩衝液C(20mM HEPES，pH8.0，500mM NaCl)洗滌Ni-NTA柱。然後用緩衝液D(緩衝液C+250mM咪唑)洗脫結合的蛋白質。使用Centricon 30濃縮器(Millipore)濃縮通過Bradford分析法(Biorad，CA)測定峰蛋白質流份。通過SDS-PAGE及Commassie Blue染色(Commassie Blue staining)評估的sBACE1純度為約90％。N-端測序表明大於90％的純化sBACE1包含前結構域；因此該蛋白質稱為sproBACE1。
肽水解分析於30℃下將抑制劑、25nM EuK-生物素標記的APPsw底物(EuK-KTEEISEVNLDAEFRHDKC-生物素；CIS-Bio International，法國)、5nM未標記APPsw肽(KTEEISEVNLDAEFRHDK；American PeptideCompany，Sunnyvale，CA)、7nM sproBACE1、20mM PIPES pH5.0，0.1％Brij-35(蛋白質級，Calbiochem，San Diego，CA)及10％甘油預培養30分鐘。通過於5μl等分試樣中添加底物引發反應，從而導致總體積為25μl。於30℃下反應3hr後，通過添加包含50mM Tris-HCl pH8.0、0.5M KF、0.001％Brij-35、20μg/ml SA-XL665(偶合至鏈黴抗生物素的別藻藍蛋白(allophycocyanin)蛋白質；CIS-Bio Interntional，法國)(0.5μg/well)的等體積2x中止緩衝液猝滅反應。溫育前，短暫振蕩平板並以1200xg旋轉10秒以將所有液體沉澱至平板底部。在PackardDiscoveryHTRF平板讀數器上使用337nm雷射光激發樣品進行HTRF測量，隨後延遲50μs並同時測量620nm及665nm發射400μs。
在存在不同濃度的抑制劑(I)及固定濃度的酵素及基質下，通過量測665nm處相對螢光除以620nm處相對螢光的百分數變化(665/620比率)測定抑制劑I的IC50。使用GraphPad Prism 3.0軟體，選擇允許可變斜率的四參數logistic方程進行此數據的非線性回歸分析。Y＝底+(頂-底)/(1+10^((LogEC50-X)*斜率))；X為I濃度的對數，Y為比率變化百分數，且Y自底開始以S形延伸至頂。
本發明的化合物具有約100至約10,000nM範圍的IC50，優選為約100至約1000nM，更優選為約100至約500nM。優選立體化學的化合物具有約2至約500nM範圍的IC50值，優選約2至約100nM。下式的化合物

具有4nM的IC50。
下表說明下列化合物的IC50分類。
具有2至1000nM IC50的化合物為A類化合物。
具有1000至10000nM IC50的化合物為B類化合物。
具有超過10000nM IC50的化合物為C類化合物。


儘管本發明已結合上述具體實施方案加以描述，但其許多替代、修改及變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的。所有這樣的替代、修改及變化均落入本發明的精神及範圍內。
權利要求
1.一種具有以下結構式的化合物 或其藥學上可接受的鹽，其中R1為 R2為-N(R5)C(O)R4-或亞雜環基環；R3為亞芳基、亞雜芳基、亞雜環基或亞環烷基；R4為亞芳基、亞雜芳基、亞雜環基或亞環烷基；R5為氫、烷基、芳基、雜芳基或環烷基；R6及R7獨立選自氫、-OH、烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、芳烷氧基、雜芳烷氧基和烷氧基，前提是當R6及R7為-OH、芳烷氧基、雜芳烷氧基和烷氧基時，R6和R7不與相鄰於環氮的環碳連接；R8為氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基、雜環基烷基、-C(O)R9、-C(O)OR12、-S(O)R9、-S(O2)R9或-CN；前提是當Y為＝O時，R8不能為-C(O)R9、-C(O)OR12、-S(O)R9、-S(O2)R9或-CN；R9為氫、烷基、環烷基、芳基、雜芳基、環烷基烷基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基、雜環基烷基、烯基、炔基或-N(R10)(R11)；R10和R11獨立選自氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、雜芳基、雜環基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基烷基、烯基和炔基；或R10和R11與它們所連接的氮一起形成3-7元雜環基環；R12為烷基、環烷基、芳基、雜芳基、環烷基烷基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基、雜環基烷基、烯基或炔基；X為O、S、C(R5)或NH；Y為＝O或(H，H)；m為1、2或3；n為0、1、2或3；且o為0、1、2或3；其中各烷基任選被1至3個選自滷代、芳基、環烷基、氰基、羥基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(環烷基)、-N(烷基)2、羧基和-C(O)O-烷基的部分取代；且其中各亞芳基、亞雜芳基、雜環基、雜環基烷基、亞雜環基、亞環烷基、環烷基、環烷基烷基、芳基、雜芳基、雜環基、芳烷基、雜芳烷基、芳烷氧基或雜芳烷氧基任選被1至4個選自-CF3、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、烷基芳基、雜芳烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、烷基雜芳基、羥基、羥烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、醯基、芳醯基、滷代、硝基、氰基、羧基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、雜芳基磺醯基、烷硫基、芳硫基、雜芳基硫基、芳烷硫基、雜芳烷硫基、環烷基、雜環基、-C(＝N-CN)-NH2、-C(＝NH)-NH2、-C(＝NH)-NH(烷基)、Y1Y2N-、Y1Y2N-烷基-、Y1Y2NC(O)-、Y1Y2NSO2-及-SO2NY1Y2的部分取代，其中Y1和Y2可相同或不同，且獨立選自氫、烷基、芳基、環烷基和芳烷基，前提是亞環烷基和亞雜環基可由＝O取代。
2.權利要求1的化合物，其中R1為
3.權利要求1的化合物，其中R2為-N(R5)C(O)R4-。
4.權利要求1的化合物，其中R3為亞芳基。
5.權利要求4的化合物，其中R3為亞苯基或滷代-取代的亞苯基。
6.權利要求4的化合物，其中R3為
7.權利要求4的化合物，其中R3為
8.權利要求1的化合物，其中R4為亞芳基。
9.權利要求1的化合物，其中R4為亞苯基。
10.權利要求1的化合物，其中R4為
11.權利要求1的化合物，其中R2為亞雜環基。
12.權利要求11的化合物，其中R2為由＝O取代的亞雜環基。
13.權利要求12的化合物，其中R2為
14.權利要求3的化合物，其中R5為烷基。
15.權利要求14的化合物，其中R5為丙基。
16.權利要求1的化合物，其中m為2且n為1。
17.權利要求1的化合物，其中R7為氫。
18.權利要求1的化合物，其中X為O。
19.權利要求1的化合物，其中Y為O。
20.權利要求1的化合物，其中R8為芳烷基或-S(O2)R9。
21.權利要求1的化合物，其中R8為
22.權利要求1的化合物，其中R1為 R2為-N(R5)C(O)R4-或亞雜環基；R3為亞芳基；R4為亞芳基或亞雜環基；R5為烷基；R7為氫；R8為芳烷基或-S(O2)R9；m為2n為1；X為O；且Y為O。
23.權利要求22的化合物，其中R3為亞苯基或滷代取代的亞苯基。
24.權利要求23的化合物，其中R3為
25.權利要求24的化合物，其中R3為
26.權利要求22的化合物，其中R4為亞芳基。
27.權利要求22的化合物，其中R4為
28.權利要求22的化合物，其中R2為亞雜環基或由＝O取代的亞雜環基。
29.權利要求28的化合物，其中R2為
30.權利要求13的化合物，其中R5為丙基。
31.權利要求22的化合物，其中R8為
32.權利要求1的化合物，它具有下面的立體化學結構
33.權利要求1的化合物，它選自下列化合物 及
34.權利要求1的化合物，它為純化的形式。
35.權利要求1的化合物，它為分離的形式。
36.一種藥學上可接受的組合物，它包含有效量的權利要求1的化合物及藥學上有效的載體。
37.一種抑制β-澱粉狀蛋白斑塊在神經組織中，神經組織上或神經組織周圍形成或形成並沉積的方法，該方法包括給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物。
38.一種治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物。
39.權利要求38的方法，其中治療的疾病為阿爾茨海默氏病。
40.一種藥用組合物，它包含在藥學上有效的載體中的有效量的權利要求1的化合物及有效量的膽鹼脂酶抑制劑。
41.一種治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括聯合給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物和有效量的膽鹼脂酶抑制劑。
42.權利要求41的方法，其中所述膽鹼脂酶抑制劑為乙醯基膽鹼脂酶或丁醯基膽鹼脂酶。
43.權利要求41的方法，其中所述膽鹼脂酶抑制劑選自他克林、多奈哌齊、利伐斯的明、加蘭他敏、吡啶斯的明及新斯的明。
44.一種治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括聯合給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物和有效量的抗炎化合物。
45.權利要求44的方法，其中所述抗炎化合物為非類固醇抗炎藥。
46.權利要求45的方法，其中所述非類固醇抗炎藥為雙氯芬酸、二氟尼柳、依託度酸、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮洛酸、萘丁美酮、萘普生、丙嗪、吡羅昔康、舒林酸、託美丁、塞來考昔或羅非考昔。
47.一種治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括聯合給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物和有效量的γ-分泌酶抑制劑。
48.一種治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括聯合給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物和有效量的HMG-CoA還原酶抑制劑。
49.權利要求48的方法，其中所述HMG-CoA還原酶抑制劑化合物為阿託伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀或羅蘇伐他汀。
50.一種治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括聯合給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物和有效量的N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑。
51.權利要求50的方法，其中所述N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑為美金剛。
52.一種治療認知或神經退化性疾病的方法，該方法包括聯合給予需要這種治療的患者有效量的權利要求1的化合物和有效量的抗澱粉狀蛋白抗體。
全文摘要
本發明公開式(I)的新化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中R
文檔編號A61P25/28GK101027297SQ200580032394
公開日2007年8月29日 申請日期2005年7月26日 優先權日2004年7月28日
發明者A·W·史丹佛, 黃穎, 李國青, C·O·史崔藍, J·H·佛特 申請人:先靈公司