用於感染早期檢測的C型肝炎抗原－抗體聯合測定的製作方法

2023-09-14 10:01:55 1

專利名稱：用於感染早期檢測的C型肝炎抗原－抗體聯合測定的製作方法
背景技術：
據估計，全世界有1700萬人已經感染了C型肝炎病毒(HCV)。在未來的幾年裡，美國由HCV導致的肝疾病和癌症的死亡人數將超過由獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)導致的死亡人數。
一般來說，HCV的傳染需要血液的接觸。攜帶一個單鏈核糖核酸(RNA)的HCV只含有編碼一個多蛋白的基因，該多蛋白能被剪切成至少10種功能蛋白。很明顯，檢測血液是否被HCV感染的能力是很重要的，而且，在HCV感染階段越早時被檢測出來越好。
因此，我們改進了一種用於檢測HCV感染的ELISA技術。這種新的檢測方法比現有的用於監測血液是否被HCV感染的方法能更早的檢測到HCV的感染。現有技術是以檢測被感染血液中的抗HCV抗體為基礎的，通過含有HCV蛋白序列的重組蛋白或多肽來捕獲這些抗體。
例如，用多抗原檢測早期血清轉化中的抗HVC抗體的Ortho HCV 3.0ELISA技術。但是，在病毒血症患者體內產生抗HCV抗體之前有一段較長的潛伏期，這段潛伏期能持續60天。在這期間內，即使患者已經被高度感染，用現有檢測技術也不能檢測出來。
本發明的另一個目的是提供特定去汙劑，該去汙劑是通過破壞殼蛋白和/或脂層從病毒釋放HCV核心抗原所必需的。發明的詳細描述本發明中，能夠在聯合測定中使病毒釋放核心抗原而對HCV重組蛋白捕獲抗HCV抗體的能力沒有負作用的去汙劑是優選的。在本發明的一個優選的實施方案中，聚氧乙烯醚類去汙劑被用於此目的。這類去汙劑一般包括BRIJ30，BRIJ 35，56，58，92，96，98，700和MYRJ52，59，53，45。這些去汙劑有助於從病毒中釋放HCV核心抗原，但這些去汙劑的存在對抗HCV的檢測不會產生不利影響。某些去汙劑能通過影響包被於固相的重組抗原或滅活樣品中的抗HCV抗體從而影響抗體的檢測。在Ortho HCV 3.0ELISA中的一些去汙劑，如N-十二烷基肌氨酸，在用於HCV核心抗原的檢測時就會破壞HCV重組蛋白c22-3，c200和NS5檢測抗HCV抗體的能力。
本發明所用的「樣品」，指的是任何含有目的分析物的物質。一種樣品可以是生物流體，比如全血或包含有紅細胞、白細胞、血小板、血清和血漿的全血組成成分、腹水、尿液、腦脊髓液及其他的含有目的分析物質的機體組成成分。
實施例1抗原—抗體聯合測定。
HCV抗原C200-3、NS-5和修飾過的抗原C22KSN 47、48或C22KSR47L與兩種抗核心單克隆抗體(如鼠單克隆Pep10、12)一起在加有磷酸緩衝液的微孔中包被。抗原的修飾是通過修飾編碼包含HCV1序列的重組蛋白C22-3的DNA克隆來實現的，此方法包含了合成寡核苷酸的定點突變(Sambrook、Fritsh、Maniatis，分子克隆實驗指南第二版，冷泉港出版社，第15章，1989)。隔夜培養後去除含有包被蛋白的磷酸緩衝液，用包含有去汙劑Tween 20的磷酸鹽緩衝液洗滌微孔，然後往抗原/抗體包被的微孔中加入BSA/蔗糖溶液以抑制微孔中的所有蛋白結合位點，2-24小時後去除BSA/蔗糖溶液，微孔在空氣中晾乾，在有乾燥劑的條件下保藏。
實施例2加入100mL PBS溶液以稀釋100mL待測樣品，該PBS溶液含有牛血清蛋白、過氧化物歧化酶、酵母抽提液、和1％的Brij58或Brij35或兩者的混合物。用微量管把稀釋過的樣品移入HCV抗原/抗體包被的微孔中(見實施例1)，這些微孔在37℃培養90分鐘，然後用含有0.5％Tween20的PBS溶液洗滌5次。往微孔中加入200ml辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠源抗人IgG和HRP標記的抗HCV核心單克隆抗體(Anti Pep 4)，培養30分鐘後用含有Tween20的PBS溶液洗滌5次。再往微孔中加入鄰苯二胺和過氧化氫，在黑暗環境中培養30分鐘，最後加入50μl 4N硫磺酸終止反應。在495nM的光下檢測微孔板，任何一個微孔中顯現橙色光就表明被測試樣品被HCV感染。
實施例3聚氧乙烯醚對HCV抗原或抗體檢測的影響不同聚氧乙烯醚對HCV3.0抗HCV檢測或HCV核心抗原的ELISA檢測的不同影響如下表1A和1B所示。在HCV核心抗原ELISA檢測中，用於商業HCV核心抗原的N-十二烷基肌氨酸被第一欄不同濃度的去汙劑所替代。在HCV3.0抗HCV的檢測中，用於檢測的稀釋樣品中加入了去汙劑。
表1A
表1B
實施例4HCV核心抗體和/或抗HCV抗體的檢測檢測平板上的HCV核心抗原或抗HCV抗體，該平板已被抗核心單克隆抗體C11-3、C11-7和HCV抗原C200-3、NS5及修飾過的核心抗原(含有帶aa47和48缺失的核心序列aa10-99的SOD融合蛋白(C22KS(Δ47-48))包被。所用樣品是獲自商業血清轉化板的4個連續血樣。核心抗原用帶有HRP標記的C11-4單克隆抗體來檢測，抗HCV抗體用帶有HRP標記人抗IgG來檢測，兩種抗體作用，積累產生可檢測信號，顯示於表2的被標記為COMBO的欄中。
表2
*表示HCV陰性樣品檢測到的信號實施例5HCV核心抗體和/或抗HCV抗體的檢測檢測平板上的HCV核心抗原或抗HCV抗體，該平板已被抗核心單克隆抗體C11-3、C11-7和HCV抗原C200-3、NS5及修飾過的核心抗原(含有第47位點處的精氨酸殘基被亮氨酸殘基取代的核心序列aa10-99的SOD融合蛋白(C22KS(R47L)))包被。用於檢測的樣品是獲自商業血清轉化板的4個連續血樣，核心抗原用帶有HRP標記的C11-4單克隆抗體來檢測，抗HCV抗體用帶有HRP標記抗人IgG來檢測。在聯合檢測中，兩種檢測到的抗體、帶有HRP標記的抗核心單克隆抗體和人抗IgG單克隆抗體作為一種混合物用於檢測。
表3
實施例6抗IgG對照血清轉化板微孔用兩種不同的HCV核心蛋白包被，比較這兩種微孔中的抗HCV的活性，結果見表4表4
實施例7血清轉化板微孔用兩種不同的HCV核心抗原包被，比較這兩種平板微孔中的核心抗原檢測情況，結果見表5表5抗HCV核心抗原比較
實施例8血清轉化板微孔用兩種不同的HCV核心抗原包被，比較這兩種平板微孔中聯合反應的活性，結果見表6。
表6HCV結合物的比較
權利要求
1.一種檢測樣品中是否存在HCV的方法，該方法包括將樣品與固定在固相上的HCV抗原和抗HCV核心抗體接觸，然後向樣品中加入聚氧乙烯醚，通過加入被標記過的抗人IgG和被標記過的抗HCV核心抗體來檢測被捕獲的抗原和抗體，檢測作為HCV的存在表徵的放射信號。
全文摘要
公開了一種檢測樣品中是否存在HCV的方法,該方法包括:將樣品與固定在固相上的HCV抗原和抗HCV核心抗體接觸,然後向樣品中加入聚氧乙烯醚,通過加入被標記過的抗人IgG和被標記過的抗HCV核心抗體來檢測被捕獲的抗原和抗體,檢測作為HCV的存在表徵的放射信號。
文檔編號G01N33/53GK1378085SQ0211921
公開日2002年11月6日 申請日期2002年3月28日 優先權日2001年3月28日
發明者C·巴爾, P·C·尼文, A·J·薩姆森, D·M·馬德約爾 申請人:奧索臨床診斷有限公司