量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法

2023-09-14 07:32:50 1

專利名稱：量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法
技術領域：
本發明涉及量子點的生物應用，更具體涉及一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法，該探針可用於檢測汙染物、毒物與酶的作用效應。
背景技術：
有機相合成的量子點不具備親水性，因此不能直接應用於生物體系，必須對其進行表面修飾，其操作過程複雜，條件要求高。水相合成法製備的量子點能夠直接用於生物探針， 對其研究愈來愈受到重視，有關這方面的研究進展很快。但由於水相合成的量子點所選用的配體多為簡單的巰基化合物，表面的活性基團比較少且表面積很小，難以與目標物質結合，因此水相量子點的直接應用存在局限性。因此，將量子點與生物大分子結合既增大了量子點的表面積，又增加了量子點表面活性基團，克服了水相量子點的應用局限性。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法， 該製備方法工藝快速簡單，工藝參數易控制。該探針水溶性和生物相容性好，檢測功能應用廣泛，性價比高，在保持了過氧化氫酶(CAT)—定活性的同時，修飾了量子點表面，使其具有較高的螢光強度。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施
其技術構思是一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針，它包括CdTe量子點(自製， 請見A E步驟)、過氧化氫酶(CAT，SIGMA-AL0RICH)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS，上海延長生化公司)、L-甘氨酸(Glycine，凌飛科技)，其餘為Tris緩衝溶液。所述的CdTe量子點中，氯化鎘(CdCl2*2. 5H20,國藥集團化學試劑有限公司)、碲氫化鉀(KTeH4,請見A步驟)、巰基乙酸(TGA, Japan)的摩爾比率分別為2. 5 1 :3，100°C條件下加熱l(T20min。所述的Tris緩衝溶液pH值為6. 8-7. 6。—種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法，其步驟如下
A、製備碲氫化鉀(KH4Te)溶液通過硼氫化鉀(KBH4，天津市天大化學試劑廠)還原碲粉(Te，國藥集團化學試劑有限公司)製備，反應方程式如下
4KBH4 + 2Te + 7H20 — 2KH4Te + K2B4O7 +IlH2
分別稱取0. 337g的硼氫化鉀(KBH4)和0. 319g的碲粉(Te)於具塞試管中。向硼氫化鉀 (KBH4)中加入5mL高純水，至白色粉末完全溶解，後與碲粉(Te)混合，塞上塞子，於3__5°C 下反應纊16h，得紫黑色液體，取上清部分Iml，用無氧高純水定容至IOOml，即為0. 005mol/ L的碲氫化鉀(KH4Te)溶液；
B、稱取0.228g氯化鎘(CdCl,2. 5H20)晶體，用高純水溶解定容至IOOmL, U 0. Olmol/ L的氯化鎘(CdCl2)溶液；
C、稱取0.092g巰基乙酸(TGA)，用高純水稀釋定容至IOOmL,得0. 01mol/L的巰基乙酸 (TGA)溶液。D、取無氧高純水250mL，在中速攪拌和不斷通入高純氮氣(N2)的條件下，依次分別加入50mL0. 01mol/L的氯化鎘(CdCl2)溶液、60mL0. 01mol/L的巰基乙酸(TGA)溶液，用 5mol/L的氫氧化鈉(NaOH)溶液調節pH值為10. 5^11. 5，後加入40mL碲氫化鉀(KH4Te)溶液,反應4-6min。Ε、將D步驟的混合液以每罐50ml分裝於聚四氟乙烯消解罐中，於100°C下微波加熱10-20min，即製得濃度為1 mmol/L (以Cd2+計)CdTe量子點。氯化鎘(CdCl2)、碲氫化鉀 (KH4Te)、巰基乙酸(TGA)的摩爾比率分別為2. 5 1 :3。F、取4mL製備好的濃度為1 mmol/L (以Cd2+計)CdTe量子點，加入0. 2mL0. 5g/L 的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)於37°C恆溫振蕩0. 5-lh，使偶聯劑N-羥基琥珀醯亞胺(NHS) 的羥胺基與CdTe量子點的羧酸基充分進行酯化反應，後加入0. 5mL4X10-10 mol/L的過氧化氫酶(CAT)溶液，於25 35°C下振蕩4(T60min後，加入0. 3mL、0. lmol/L的L-甘氨酸 (Glycine)終止交聯。製得量子點標記過氧化氫酶螢光探針，該探針在保持了一定酶活性的同時，使量子點的螢光強度得到較大提高(309Γ509Ο。所述的CdTe量子點如何製備的過程請見步驟A E。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果
1.該探針主要原料大部分來源豐富，價格低廉；過氧化氫酶雖價格較貴，但添加量少， 對總體價格影響不大。2.該探針製備工藝快速簡單，工藝參數易控制。3.該探針水溶性和生物相容性好，檢測功能應用廣泛，性價比高。
具體實施例方式下面通過實施例，進一步闡明本發明的突出特點，僅在於說明本發明而決不限制本發明。實施例1
一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針，它包括CdTe量子點、過氧化氫酶(CAT， SIGMA-AL0RICH)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS，上海延長生化公司)、L-甘氨酸(Glycine，凌飛科技)，其餘為Tris緩衝溶液。所述的CdTe量子點中，氯化鎘(CdCl2*2. 5H20,國藥集團化學試劑有限公司)、碲氫化鉀(KTeH4,)、巰基乙酸(TGA，Japan)的摩爾比率分別為2. 5 1 :3，100°C條件下加熱 10 20min。所述的Tris緩衝溶液pH值為6. 8-7. 6。一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法，其步驟如下
A、製備碲氫化鉀(KH4Te)溶液通過硼氫化鉀(KBH4)還原碲粉(Te)製備，反應方程式如下
4KBH4 + 2Te + 7H20 — 2KH4Te + K2B4O7 +IlH2 分別稱取0. 337g的硼氫化鉀(KBH4)和0. 319g的碲粉(Te)於具塞試管中。向硼氫化鉀(KBH4)中加入5mL高純水，至白色粉末完全溶解，後與碲粉(Te)混合，塞上塞子，於3°C、 或 1°C、或-1°C、或-2°C、或-3°C、或-4°C、或-5°C下反應 8 h、或 10 h、或 12 h、或 14 h、或 16h，得紫黑色液體，取上清部分1ml，用無氧高純水定容至100ml，即為0. 005mol/L的碲氫化鉀(KH4Te)溶液；B、稱取0.228g氯化鎘(CdCl,2. 5H20)晶體，用高純水溶解定容至IOOmL,得0. Olmol/ L的氯化鎘(CdCl2)溶液；
C、稱取0.092g巰基乙酸(TGA)，用高純水稀釋定容至IOOmL,得0. Olmol/L的巰基乙酸 (TGA)溶液。D、取無氧水250mL，在中速攪拌和不斷通入高純氮氣( )的條件下，依次分別加入 50mL0. 01mol/L 的氯化鎘(CdCl2)溶液、60mL0. 01mol/L 的巰基乙酸(TGA)，用 5mol/L 的氫氧化鈉溶液(NaOH)調節pH值為10. 5、或11、或11. 3、或11. 5，後加入40mL碲氫化鉀(KH4Te) 溶液，反應5min。Ε、將D步驟的混合液以每罐50ml分裝於聚四氟乙烯消解罐中，於100°C下微波加熱10或12或14或16或18或20min，即製得濃度為1 mmol/L (以Cd2+計)CdTe量子點。 氯化鎘(CdCl2)、碲氫化鉀(KH4Te)、巰基乙酸(TGA)的摩爾比率分別為2.5 1 :3。F、取4mL製備好的濃度為1 mmol/L (以Cd2+計)CdTe量子點，加入0. 2mL0. 5g/L的 N-羥基琥珀醯亞胺(MB)於37°C恆溫振蕩0. ，使偶聯劑N-羥基琥珀醯亞胺(MB)的羥胺基與CdTe量子點的羧酸基充分進行酯化反應，後加入0. 5mL4X ΙΟ, mol/L的過氧化氫酶(CAT)溶液，於 25 °C、或 27 °C、或四 °C、或 31 °C、或 33 °C、或；35 °C 下振蕩 40min、或 45min、 或 50min、或 56min、或 60min 後，加入 0. 3mL、0. lmol/L 的 L-甘氨酸(Glycine)終止交聯。 所製得的螢光探針具有一定酶活性，且螢光強度得到較大提高(309Γ509Ο。實施例2
一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針，它包括CdTe量子點(自製)、過氧化氫酶 (CAT, )、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS, )、L-甘氨酸(Glycine，)，其餘為Tris緩衝溶液。所述的CcTTe量子點中，氯化鎘(CdCl2*2. 5H20,)、碲氫化鉀(OeH4，自製)、巰基乙酸(TGA，)的摩爾比率分別為2. 5 1 3,100°C條件下加熱10 20min。所述的Tris緩衝溶液pH值為7. 2。取氯化鎘(CdCl2)、碲氫化鉀(KH4Te)、巰基乙酸(TGA)的摩爾比率分別為2. 5 1 3的混合溶液，調節溶液pH值為11.0，以每罐50ml分裝於聚氟乙烯消解罐中，於100°C 下微波加熱20min製得CdTe量子點。取4mL製備好的濃度為1 mmol/L (以Cd2+計)CdTe 量子點，加入0. 2mL0. 5g/L的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)於37°C下恆溫振蕩0. 5h，後加入 0. 5mL4X 10_10 mol/L的過氧化氫酶CAT溶液，於35°C恆溫振蕩60min後，再加入0. 3mL、 0. lmol/L的L-甘氨酸(Glycine)終止交聯，製得CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針，所製得的螢光探針具有一定酶活性，且螢光強度得到較大提高(40%)。其它實施步驟與實施例1相同。實施例3
取氯化鎘(CdCl2)、碲氫化鉀(KH4Te)、巰基乙酸(TGA)的摩爾比分別為2. 5 1 3的混合溶液，調節溶液PH值為11. 4，以每罐50ml分裝於聚四氟乙烯消解罐中，於100°C下微波加熱15min製得CdTe量子點。取4mL製備好的濃度為1 mmol/L (以Cd2+計)CdTe量子點， 加入0. 2mL0. 5g/L的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)於30°C恆溫振蕩0. 5h，後加入0. 5mL4X10"10 mol/L的過氧化氫酶(CAT)溶液，於30°C下恆溫振蕩45min後，再加入0. 3mL、0. lmol/L的 L-甘氨酸(Glycine)終止交聯，製得CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針，所製得的螢光探針具有一定酶活性，且螢光強度得到較大提高(50%)。
其它實施步驟與實施例1相同。
權利要求
1. 一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法，其步驟如下製備碲氫化鉀溶液通過硼氫化鉀還原碲粉製備，反應方程式如下 4KBH4 + 2Te + 7H20 — 2KH4Te + K2B4O7 +IlH2 分別稱取0. 337g的硼氫化鉀和0. 319g的碲粉於具塞試管中，向硼氫化鉀中加入5mL 高純水，至白色粉末完全溶解，後與碲粉混合，塞上塞子，於3-5°C下反應纊16h，得紫黑色液體，取上清1ml，用無氧高純水定容至100ml，為0. 005mol/L的碲氫化鉀溶液；B、稱取0.228g氯化鎘晶體，用高純水溶解定容至IOOmL,得0. 01mol/L的氯化鎘溶液；C、稱取0.092g巰基乙酸，用高純水稀釋定容至IOOmL,得0. 01mol/L的巰基乙酸溶液；D、取無氧高純水250mL，在攪拌和不斷通入高純氮氣的條件下，依次分別加入 50mL0. 01mol/L的氯化鎘溶液、60mL0. 01mol/L的巰基乙酸溶液，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調節PH值為10. 5 11. 5，後加入40mL碲氫化鉀溶液，反應4-6min ；Ejf(D)步驟的混合液以每罐50ml分裝於聚四氟乙烯消解罐中，於100°C下微波加熱 10-20min,即製得濃度為1 mmol/L CdTe量子點，氯化鎘、碲氫化鉀、巰基乙酸的摩爾比率分別為 2. 5 1 3 ；F、取4mL製備好的濃度為1 mmol/L CdTe量子點，加入0. 2mL0. 5g/L的N-羥基琥珀醯亞胺於37°C恆溫振蕩0. 5-lh，使偶聯劑N-羥基琥珀醯亞胺的羥胺基與CdTe量子點的羧酸基進行酯化反應，後加入0. 5mL4X 10, mol/L的過氧化氫酶溶液，於25 35°C下振蕩 4(T60min後，加入0. 3mL、0. lmol/L的L-甘氨酸終止交聯，製得量子點標記過氧化氫酶螢光探針。
全文摘要
本發明公開了一種CdTe量子點標記過氧化氫酶螢光探針的製備方法，其步驟A、製備碲氫化鉀溶液通過硼氫化鉀還原碲粉製備；B、稱取氯化鎘晶體，用高純水溶解定容，得氯化鎘溶液；C、稱取巰基乙酸，用高純水稀釋定容，得巰基乙酸溶液；D、取無氧高純水，在攪拌和不斷通入高純氮氣，分別加入氯化鎘溶液、巰基乙酸溶液，用氫氧化鈉溶液調節pH值，加入碲氫化鉀溶液；E、將混合液分裝於聚四氟乙烯消解罐中，氯化鎘、碲氫化鉀、巰基乙酸的摩爾比率；F、取CdTe量子點，加入N-羥基琥珀醯亞胺於恆溫振蕩，得量子點標記過氧化氫酶螢光探針。工藝簡單，工藝參數易控制；具有很好的生物相容性；具有雙重檢測性能，同時可進行螢光檢測與酶活性檢測。
文檔編號G01N21/64GK102169090SQ20111000668
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月13日 優先權日2011年1月13日
發明者何振宇, 史廣宇, 周培疆, 陳馳 申請人:武漢大學