主動靶向型抗腫瘤藥物及其製備方法

2023-09-14 07:15:40 4

主動靶向型抗腫瘤藥物及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及主動靶向型抗腫瘤藥物及其製備方法。具體地，本發明公開了一種複合物，所述複合物包括：納米載體以及偶聯於納米載體表面的靶分子，所述靶分子選自：[D-Arg25]-NPY、[D-His26]-NPY、[D-Arg25,D-His26]-NPY等，並且所述納米載體的粒徑在200nm以下，且多分散指數（PDI）小於0.5。本發明還公開了一種組合物、藥物及其製備方法和用途。本發明的組合物及藥物對腫瘤細胞具有很強的靶向作用，並且能將抗腫瘤藥物靶向輸送至腫瘤細胞內，有效提高細胞內的藥物濃度，對腫瘤細胞具有很強的殺滅作用，同時對正常組織和細胞幾乎無毒副作用。
【專利說明】主動靶向型抗腫瘤藥物及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及製藥【技術領域】，具體地涉及一種主動靶向型抗腫瘤藥物及其製備方 法。

【背景技術】
[0002] 主動靶向藥物即通過在藥物或藥物載體表面修飾活性靶分子(如抗體或配體等） 後，與某些組織或細胞上特異性的抗原或受體結合，實現藥物對特定細胞和組織主動尋靶 的功能。由於抗原-抗體、受體-配體之間高特異性、高選擇性和高親和性的特點，主動靶 向較被動靶向具有更高的靶向效率，因而主動靶向釋藥系統的研究在國內外也都非常活 躍。
[0003] 基於抗原與抗體特異性結合的原理設計的主動靶向藥物存在諸多問題，例如，靶 點藥物有效濃度低、種族特異性強、免疫原性高和研發生產成本高等。
[0004] 然而基於配體和受體特異性結合原理所設計的主動靶向藥物，由於具有高選擇 性、無種族特異性、無免疫原性、高穩定性且低成本的特點，因此是目前腫瘤靶向遞藥系統 設計的重點和熱點。其中包括葉酸受體、轉鐵蛋白受體、整合素受體和多肽受體等介導的腫 瘤靶向藥物研究。近年來，多肽受體介導的腫瘤靶向藥物越來越受到人們的關注。
[0005] 但迄今為止，有關抗癌藥物靶向給藥系統的研究，大多以靶向至腫瘤組織為目 的，如何使更多的藥物到達腫瘤部位後進入腫瘤細胞，真正達到腫瘤細胞靶向給藥的目 的，是近幾年靶向給藥系統的研究重點。儘管很多藥物運載系統表現出了相當好的腫瘤靶 向性，可以將藥物遞送至腫瘤細胞表面，但由於載體與靶細胞結合後入胞能力較弱，相當 大一部分的藥物在細胞外釋放，藥物作用同時也激活腫瘤細胞膜多種基因，多種分子機制 協同參與耐藥表型的形成，構成耐藥性，進一步降低了藥物入胞效率，使胞內藥物濃度過 低，無法有效抑制腫瘤細胞的生長。
[0006] 神經肽Y (NPY)是一種廣泛存在於中樞和外周並維持內環境穩態的激素。已有6 種NPY受體被發現和鑑定，它們分別為NPY Yi、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6，這些受體廣泛存在於哺乳 動物的中樞神經系統和外周神經系統。NPY的功能與其受體密不可分，受體的多樣性引起功 能多樣性。研究表明，目前已知的針對神經肽受體的藥物多用於治療與生理紊亂相關的疾 病，包括：肥胖、心血管疾病、高血脂、癲癇、焦慮等疾病。然而以NPY受體為靶向的抗腫瘤治 療藥物卻不多見，特別是針對腎癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌的抗腫瘤治療藥物未見報導。
[0007] 目前基於NPY不同受體的激動劑和抑制劑即受體的配體分子，雖然已有廣泛的研 究，然而由於NPY受體的多樣性以及其存在的廣泛性，因此尋找某種合適配體來修飾藥物 載體，使該載體能高特異性地與腫瘤細胞的受體結合且不影響細胞內的其他受體的生物活 性，並且能夠將載體中的抗腫瘤藥物靶向輸送至這些細胞內，從而增加藥物在該腫瘤細胞 中的有效濃度，已成為主動靶向藥物設計與研發的關鍵。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的在於提供一種主動靶向型抗腫瘤藥物及其製備方法。
[0009] 本發明第一方面提供了一種複合物，所述複合物包括：
[0010] 納米載體；以及
[0011] 靶分子，所述靶分子偶聯於所述納米載體表面；
[0012] 其中，所述靶分子選自：[D-Arg25]-NPY、[D-HiS26]-NPY、[D-Arg 25, D-HiS26]-NPY、 [Arg6, Pro34] pNPY> [Asn6, Pro34] pNPY> [Cys6, Pro34]pNPY> [Phe6, Pro34]pNPY> [Arg71Pro34] pNPY, [D-His26, Pro34JNPY, [Phe7, Pro34] pNPY, [Pro30, Nle31, Bpa32, Leu34] NPY (28-36), [Pro3。，Nal32, Leu34] NPY (28-36)、[Pro3。，Nle31，Nal32, Leu34] NPY (28-36)、BIB03304、 PD160170、LY366258、J-104870、LY357897、J-115814 ;
[0013] 並且所述納米載體的粒徑在200nm以下，且多分散指數（PDI)小於0. 5。
[0014] 在另一優選例中，按複合物總重量計，所述靶分子的含量為I. 11 一 22. 2wt%。
[0015] 在另一優選例中，按複合物總重量計，所述靶分子的含量為5. 60 - 11. lwt%。
[0016] 在另一優選例中，所述複合物具有以下一種或多種特徵：
[0017] (a)與乳腺癌、卵巢癌、腎癌或胃癌腫瘤細胞高特異性結合；
[0018] (b)納米載體的粒徑為10_2〇Onm。
[0019] 在另一優選例中，所述納米載體選自：蛋白類納米粒子、寡肽類納米粒子、磷脂類 納米脂質體、多糖類納米粒子、聚醚類納米粒子、聚酯類納米粒子、聚酯類聚合物膠束。
[0020] 在另一優選例中，所述蛋白類納米粒子選自：人血清白蛋白納米粒子、牛血清白蛋 白納米粒子。
[0021] 在另一優選例中，所述磷脂類納米脂質體選自：磷脂醯膽鹼納米脂質體、二棕櫚磷 脂醯膽鹼納米脂質體、二硬脂醯磷脂醯膽鹼納米脂質體、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺納米脂質 體、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺納米脂質體、二棕櫚醯磷脂醯甘油納米脂質體。
[0022] 在另一優選例中，所述聚酯類納米粒子選自：聚乙二醇-聚乳酸納米粒子、聚乙二 醇-聚丙交酯乙交酯納米粒子、聚乙二醇-聚己內酯納米粒子。
[0023] 在另一優選例中，所述多糖類納米粒子包括：殼聚糖類納米粒子。
[0024] 在另一優選例中，所述聚酯類聚合物膠束選自：聚乙二醇_聚乳酸膠束、聚乙二 醇-聚己內酯膠束、聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺膠束、聚乙二醇-聚乙烯亞胺膠束。
[0025] 本發明第二方面提供了一種組合物，所述組合物包括：
[0026] 第一方面所述的複合物；以及
[0027] 裝載於所述複合物納米載體中的抗腫瘤藥物。
[0028] 在另一優選例中，抗腫瘤藥物選自：阿黴素、紫杉醇、多西他賽、順鉬、米託蒽醌、柔 紅黴素、長春新鹼、全反式維甲酸、表阿黴素、勒託替康、伊立替康、2-甲氧雌二醇、吉西他 濱、長春瑞賓、5_氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、卡培他濱、洛莫司汀、依託泊苷或其組合。
[0029] 在另一優選例中，所述抗腫瘤藥物包埋於所述複合物納米載體中。
[0030] 在另一優選例中，所述組合物中，納米載體對抗腫瘤藥物的包封率為80%以上。 (較佳的為90%以上）。
[0031] 在另一優選例中，所述組合物中抗腫瘤藥物濃度為5-10 ii g/mL時，組合物對腫瘤 細胞的殺滅率為> 60%，較佳地為> 70%。
[0032] 在另一優選例中，所述腫瘤細胞包括乳腺癌、卵巢癌、腎癌或胃癌腫瘤細胞。
[0033] 在另一優選例中，按組合物的總重量計，所述抗腫瘤藥物的含量為I. 0 - 3. Owt%。 優選為 1. 5 - 2. 7wt%。
[0034] 在另一優選例中，按組合物的總重量計，所述靶分子的含量為I. 11 一 22. 2wt%。優 選為 5. 60 - 11. lwt%。
[0035] 本發明第三方面提供了一種第二方面所述組合物的製備方法，包括以下步驟：
[0036] (1)提供一納米載體，所述納米載體中裝載有抗腫瘤藥物；
[0037] (2)將步驟（1)的納米載體與靶分子進行偶聯反應，得到所述組合物。
[0038] 在另一優選例中，所述納米載體的粒徑在200nm以下，較佳的為10-200nm。
[0039] 在另一優選例中，所述納米載體的製備方法包括以下步驟：
[0040] (a)分別提供一水溶液和有機溶液，所述水溶液包含抗腫瘤藥物和親水性膜材，所 述有機溶液包含乳化劑；
[0041] (b)將步驟（a)的水溶液與有機溶液混合，得到乳液；
[0042] (C)將步驟（b)的乳液固化，得到所述納米載體。
[0043] 或包括以下步驟：
[0044] (a)分別提供一水溶液和有機溶液，所述水溶液包含乳化劑，所述有機溶液包含抗 腫瘤藥物和疏水性膜材；
[0045] (b)將步驟（a)的水溶液與有機溶液混合，得到乳液；
[0046] (C)將步驟（b)的乳液固化，得到所述藥納米載體。
[0047] 或包括以下步驟：
[0048] (a)分別提供一水溶液和有機溶液，所述水溶液包含抗腫瘤藥物，所述有機溶液包 含疏水性膜材和乳化劑；
[0049] (b)將步驟（a)的水溶液與有機溶液混合，得到第一乳液；
[0050] (C)將步驟（b)的第一乳液與溶有乳化劑的水溶液混合，得到第二乳液；
[0051] (d)將步驟（C)的第二乳液固化，得到所述納米載體。
[0052] 或包括以下步驟：
[0053] (a)分別提供一懸濁液，所述懸濁液包含抗腫瘤藥物、納米載體和有機溶劑；
[0054] (b)將步驟（a)的懸濁液固化，得到所述納米載體；
[0055] 在另一優選例中，所述親水性膜材選自：聚乙二醇（PEG)、聚氧乙烯（PE0)、聚乙烯 吡咯烷酮（PVP)或聚乙烯醇（PVA)。
[0056] 在另一優選例中，所述疏水性膜材選自：聚氧丙烯（PP0)、聚苯乙烯（PS)、聚氨基 酸、聚乳酸（PLA )、精胺或短鏈磷脂。
[0057] 在另一優選例中，所述乳化劑選自：Pluronic F68、Dextran70或膽酸鈉。
[0058] 在另一優選例中，所述偶聯反應選自：
[0059] (1)羧基與氨基的縮合反應；
[0060] (2)巰基與馬來醯亞胺的加成反應；或 [0061] (3)親和素與生物素的非共價結合。
[0062] 本發明第四方面提供了一種第一方面所述複合物的用途，用於製備治療癌症的藥 物。
[0063] 在另一優選例中，所述癌症包括：乳腺癌、卵巢癌、腎癌和胃癌。更佳地，所述癌症 包括腎癌和胃癌。
[0064] 本發明第五方面提供了一種第二方面所述組合物的用途，其特徵在於，所述組合 物用於製備治療癌症的藥物。
[0065] 本發明第六方面提供了一種藥物，所述藥物包括：
[0066] 第一方面所述的複合物；
[0067] 裝載於所述複合物納米載體中的抗腫瘤藥物；以及
[0068] 藥學上可接受的載體。
[0069] 在另一優選例中，所述藥物的劑型選自：固體製劑、液體製劑或注射劑。
[0070] 在另一優選例中，所述藥物的施用對象為哺乳動物，優選人類。
[0071] 在另一優選例中，所述藥物的劑型為注射劑。
[0072] 在另一優選例中，所述注射劑的給藥方式包括：靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，腔 內注射。
[0073] 本發明第七方面提供了一種治療癌症的方法，所述方法包括步驟：給予需要的對 象施用安全有效量的第二方面所述的組合物或第六方面所述的藥物。
[0074] 在另一優選例中，所述癌症包括：乳腺癌、卵巢癌、腎癌和胃癌。更佳地，所述癌症 包括腎癌和胃癌。
[0075] 應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0076] 圖1為組合物[D-Arg25] -NPY-ANP-TXT的透射電鏡圖和DLS粒徑分布圖。
[0077] 圖2為組合物[D-Arg25] -NPY-ANP-TXT在NaCl水溶液、PBS水溶液和血清（serum) 中1-15天的粒徑變化圖。
[0078] 圖3為腫瘤細胞MCF-7和HEC-1B-Y5對組合物[D-Arg25] -NPY-ANP-TXT的攝取作 用比較圖。

【具體實施方式】
[0079] 發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現將某些特定靶分子偶聯於裝載有抗腫 瘤藥物的納米載體表面所製得的組合物能高特異性地與特定腫瘤細胞上的神經肽受體結 合，並且可將抗腫瘤藥物靶向輸送至這些細胞內，增加藥物在該腫瘤細胞中的有效濃度，對 正常組織和細胞的幾乎無毒副作用。本發明的組合物對腫瘤細胞特別是對乳腺癌、卵巢癌、 腎癌和胃癌細胞具有較強的殺滅作用，因此可用於製備治療上述腫瘤的藥物。在此基礎上 完成了本發明。
[0080] 如本文所用，術語"生物素"即指維生素H，或稱為維生素B7或輔酶R (Coenzyme R)，分子量為244. 31Da。
[0081] 如本文所用，術語"親和素"是一種糖蛋白，分子量約為60kDa。主要包括：卵白親 和素(也稱天然親和素、卵清親和素或抗生物素)、鏈黴親和素、卵黃親和素及類親和素等。
[0082] 靶分子
[0083] 本發明的靶分子是指可特異高效地與神經肽受體相結合，從而引起各種 生物活性的多肽類激動劑分子或非肽類拮抗劑分子，其中多肽類激動劑分子包括： [D-Arg25J-NPY, [D-His26J-NPY, [D-Arg25,D-His26]-NPY, [Arg6, Pro34] pNPY, [Asn61Pro34] pNPY, [Cys6,Pro34]pNPY, [Phe6, Pro34]pNPY, [Arg7, Pro34]pNPY, [D-His26, Pro34]NPY, [Phe7, Pro34] pNPY、[Pro3。，Nle31，Bpa32, Leu34]NPY (28-36)、[Pro3。，Nal32, Leu34]NPY (28-36)、 [Pro3。, Nle31，Nal32, Leu34]NPY (28-36)，非肽類拮抗劑分子包括：BIB03304、PD160170、 LY366258、J-104870、LY357897、J-115814。
[0084] 發明人經過研究意外發現，本發明的上述靶分子可與乳腺癌、卵巢癌、腎癌和胃癌 細胞高特異性地結合，但不與腦瘤、子宮內膜瘤細胞特異性地結合。
[0085] 其中所述的高特異性結合是指，在相同條件下，本發明的複合物分別與腫瘤細胞 和非腫瘤細胞(即正常細胞)結合後，對複合物的攝取率比值滿足如下條件> 2. 5,較 佳地1/?彡3,更佳地B1/^彡4 ;式中，B1表示每10000個腫瘤細胞中，腫瘤細胞對所述復 合物的攝取率；Btl表示每10000個正常細胞中，正常細胞對所述複合物的攝取率。
[0086] 複合物及其製備方法
[0087] 本發明的複合物是由可生物降解的納米載體和靶分子組成的二元複合物，其中， 靶分子偶聯於納米載體的表面。由於靶分子過量會造成複合納米粒子沉澱或團聚，進而 使複合納米粒子的粒徑增加（>200nm)。本發明中，按複合物的總重量計，靶分子的含量為 I. 11 一 22. 2% (wt%)，優選為5. 60 - 11. 1% (wt%)，餘量為可生物降解的納米載體。本發明 的複合物在NaCl水溶液、PBS水溶液或血清中分散性與穩定性良好，無沉澱或團聚現象發 生。
[0088] 在本發明中，納米載體可選自：寡肽類納米粒子、磷脂類納米脂質體、多糖類納米 粒子、聚醚類納米粒子、聚酯類納米粒子、聚酯類聚合物膠束或其組合。其中優選為白蛋白 類納米粒子、磷脂類納米粒子和多糖類納米粒子。
[0089] 一類優選的蛋白類納米粒子包括：人血清白蛋白納米粒子（HSA)、牛血清白蛋白 納米粒子（BSA)或其組合。
[0090] 一類優選的磷脂類納米脂質體包括：磷脂醯膽鹼（PC)納米脂質體、二棕櫚磷脂醯 膽鹼（DPPC)納米脂質體、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC)納米脂質體、二棕櫚醯磷脂醯乙醇 胺（DPPE)納米脂質體、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（DSPE)納米脂質體、二棕櫚醯磷脂醯甘油 (DPPG)納米脂質體或其組合。
[0091] 一類優選的聚酯類納米粒子包括：聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA)納米粒子、聚乙二 醇-聚丙交酯乙交酯（PEG-PLGA)納米粒子、聚乙二醇-聚己內酯（PEG-PCL)納米粒子或其 組合。
[0092] -類優選的多糖類納米粒子包括：殼聚糖類納米粒子。
[0093] -類優選的聚酯類聚合物膠束包括：聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA)膠束、聚乙二 醇-聚己內酯（PEG-PCL)膠束、聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE)膠束、聚乙 二醇-聚乙烯亞胺（PEG-cl-PEI)膠束或其組合。
[0094] 本發明複合物的製備方法主要包括步驟：（1)納米載體的製備和（2)納米載體與 靶分子反應。其中，納米載體的製備方法可採用本領域技術人員所熟知的方法進行製備，納 米載體與靶分子之間可採用化學偶聯的方法進行反應。
[0095] -類優選的偶聯方法具體如下：
[0096] 當納米載體含有羧基時(如聚穀氨酸、聚天門冬氨酸、含有穀氨酸和天門冬氨酸的 多肽和蛋白質、以及含有羧基的多糖類物質)，可以選擇含有氨基的靶分子，然後用EDAC和 NHS (N-羥基丁二醯亞胺）活化納米載體表面的羧基，再滴加帶有末端氨基的靶分子溶液， 使活化的羧基與靶分子的氨基共價反應形成穩定的醯胺鍵；當納米載體含有氨基時(如聚 賴氨酸、組氨酸、聚精氨酸、含有賴氨酸、精氨酸和組氨酸的多肽和蛋白質、以及含有氨基的 多糖類物質)，可以選擇含有羧基的靶分子，然後採取以上方法活化靶分子的羧基後使之嫁 接於納米載體表面上；對於既不含有羧基、又不含有氨基的可生物降解的納米載體(如聚醚 類和聚酯類高分子)，可以採用共聚法使之帶有氨基或者羧基，製作成納米載體之後採用以 上相同方法可使靶分子嫁接於納米載體表面上。
[0097] 另一類優選的偶聯方法具體如下：
[0098] 在靶分子上引入巰基，並在載藥系統表面引入馬來醯亞胺基團，然後在中性或如 鹼性的水性環境中（如磷酸鹽緩衝溶液）室溫下進行加成反應。
[0099] 靶分子的巰基化主要是藉助巰基化試劑(如2-IT、STOP、SATP和SSDD等）與靶分 子上的氨基反應生成巰基化產物；
[0100] 在載藥系統引入馬來醯亞胺時，可將脂質分子和馬來醯亞胺（MAL)修飾的聚合物 材料（如 MAL-PEG-PLA、MAL-PEG-PLGA、MAL-PEG-PCL、MAL-PEG-DSPE)混合溶解於有機溶媒 中，通過成膜水化、高壓乳勻處理後，便可製得疏水端(如PLA、PLGA、PCL和DSPE)鑲嵌在脂 質雙分子層內、PEG-馬來醯亞胺端處於脂質膜表面的馬來醯亞胺化脂質體。
[0101] 此外，也可在載藥系統表面直接引入馬來醯亞胺。如採用可形成馬來醯亞胺的雙 功能連接劑(如雙功能丙酸連接劑，其分子中的活潑酯與氨基反應可生成馬來醯亞胺基團） 在納米載體上引入馬來醯亞胺基團。
[0102] 另一類優選的偶聯方法具體如下：
[0103] 將生物素（biotin)分別引入至靶分子和載藥系統上，再利用親和素（avidin)作 為橋連劑實現靶向遞藥系統的構建。即先將親和素與生物素化的載藥系統混合，尚未結合 的位點再與生物素化靶分子結合。
[0104] 如生物素化PEG-PLGA的製備，可將PLGA-C00H(分子量20kDa)溶解於二氯甲烷 中，室溫下攪拌後加入8倍量的NHS和EDC活化。生成的活潑酯與NH2-PEG-biotin (分子 量為3400Da)混合溶解在三氯甲烷中，加入適量N，N-二異丙基乙胺，反應過夜。用甲醇 洗去未反應的PEG分子，乙醚沉澱並真空乾燥，得PLGA-PEG-biotin。然後將一定比例的 PLGA-PEG-C00H與PLGA-PEG-biotin混合溶解在丙酮中，緩慢滴加至去離子水中，室溫條件 下旋轉蒸發除去丙酮，超濾濃縮除去有機溶劑，即得生物素化PEG-PLGA納米粒。將生物素 化PEG-PLGA納米粒與親和素溶液室溫孵育一定時間，離心洗滌除去游離的親和素。將一 定量生物素化靶分子與其室溫攪拌，再離心除去游離的生物素化靶分子，即得靶分子化的 PEG-PLGA納米粒靶向遞藥系統。
[0105] 組合物及其製備方法和用途
[0106] 本發明的組合物包含本發明的複合物以及裝載於複合物納米載體的抗腫瘤藥物。 按組合物的總重量計，抗腫瘤藥物的含量為1. 5 - 3. Owt%。優選為2. 0 - 3. Owt%。靶分子 的含量為 I. 11 一 22. 2wt%。優選為 5. 60 - 11. lwt%。
[0107] 為了更好地實現對抗腫瘤藥物的緩釋、控釋作用，並且為了防止體內調理作用的 發生，本發明組合物中，複合物中的納米載體的粒徑較佳地為200nm以下，較佳的為10 - 200nm〇
[0108] 一類優選的抗腫瘤藥物包括但不限於：阿黴素、紫杉醇、多西他賽、順鉬、米託蒽 醌、柔紅黴素、長春新鹼、全反式維甲酸、表阿黴素、勒託替康、伊立替康、2-甲氧雌二醇、吉 西他濱、長春瑞賓、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、卡培他濱、洛莫司汀、依託泊苷或其組合。較佳地 為阿黴素、紫杉醇、多西他賽、米託蒽醌、柔紅黴素、伊立替康、吉西他濱、長春瑞賓、卡培他 濱、依託泊苷。
[0109] 本發明的組合物的製備方法主要包括步驟：
[0110] (1)提供一納米載體，納米載體中裝載有抗腫瘤藥物；
[0111] (2)將步驟（1)的納米載體與靶分子進行反應，得到所述組合物。
[0112] 其中，所述納米載體的製備可以採用超聲乳化法製作。較佳地，所述納米載體可採 取以下三種方法製備：
[0113] (1)用溶解了親水性抗腫瘤藥物和親水性膜材(如聚乙二醇）的水溶液作為水相， 用溶解了油溶性乳化劑(如膽酸鈉）的有機溶劑(如二氯甲烷）作為油相，將水相與油相混合 攪拌進行粗分散後，再用超聲波細胞破碎機進行乳化，獲得油包水型納米乳液，再在磁力攪 拌下向所得納米乳液中加入交聯劑(如戊二醛）進行交聯固化，除去過量的交聯劑和乳化劑 即可獲得包埋有抗腫瘤藥物的可生物降解的納米載體。
[0114] (2)用溶解了疏水性抗腫瘤藥物和疏水性膜材(如PACA)的有機溶劑(如二氯甲烷） 作為油相，用溶解了水溶性乳化劑(如Pluronic F68、Dextran70)的水溶液作為水相，將油 相與水相混合攪拌進行粗分散後，再用超聲波細胞破碎機進行乳化，獲得水包油型納米乳 液，再在磁力攪拌下向所得納米乳液中加入交聯劑(如戊二醛）進行交聯固化，除去過量的 交聯劑和乳化劑即可獲得包埋有抗腫瘤藥物的可生物降解的納米載體。
[0115] (3)用溶解了親水性抗腫瘤藥物的水溶液作為水相，用溶解了疏水性膜材(如 PEG-PLA)和油溶性乳化劑(如膽酸鈉）的有機溶劑作為油相，將水相與油相混合攪拌進行粗 分散後，再用超聲波細胞破碎機進行乳化，獲得油包水型納米乳液，再將所得油包水型納米 乳液加入溶有水溶性乳化劑的水相中進行超聲乳化，從而獲得W/0/W型納米乳液，再在磁 力攪拌下向所得W/0/W型納米乳液中加入交聯劑(如戊二醛）進行交聯固化，除去過量的交 聯劑和乳化劑即可獲得包埋有抗腫瘤藥物的可生物降解的納米載體。
[0116] 本發明的上述納米載體也可以採用脫溶劑法製作，一類優選的方法包括：將水溶 性抗腫瘤藥物和納米載體寡肽或蛋白質溶於NaCl水溶液中，然後滴加乙醇，滴加過程持續 磁力攪拌，當溶液變成乳白色懸濁液後加入戊二醛交聯固化納米載體，除去過量的交聯劑 即可獲得包埋有抗癌藥物的可生物降解納米粒子。
[0117] 上述步驟（2)中的反應方法同本發明複合物中納米載體與靶分子的反應方法。
[0118] 應理解，上述組合物也可通過將抗腫瘤藥物包入已製備好的本發明的複合物中來 製備。
[0119] 本發明的組合物可用於製備抗腫瘤藥物，特別是用於製備治療乳腺癌、卵巢癌、腎 癌和胃癌的藥物。
[0120] 藥物、組合物及施用方法
[0121] 本發明所述的藥物含有有效量的本發明的組合物，藥學上可接受的載體或賦性 劑。
[0122] 如本文所用，術語"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由……構成"、和 "由……構成"。如本文所用，術語"藥學上可接受的"的成分是適用於人和/或動物而無過 度不良副反應（如毒性、刺激和變態反應）的，即有合理的效益/風險比的物質。如本文所 用，術語"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的 量。
[0123] 如本文所用，術語"藥學上可接受的載體"指用於治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身並不是必要的活性成分，且施用 後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》 (Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到關於藥學上 可接受的賦形劑的充分討論。
[0124] 本發明的藥物劑型包括：固體製劑、液體製劑或注射劑。較佳地為注射劑。
[0125] 本發明藥物的施用對象為哺乳動物，優選人類。
[0126] 在本發明的另一個優選例中，每天一次或多次施用本發明的藥物或組合物，例如 1、2、3、4、5或6次。其中給藥途徑包括但並不限於：口服給藥，注射給藥，腔內給藥，透皮給 藥；優選的注射給藥包括：靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，腔內注射。在施用本發明的藥物 或組合物時，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是在熟練醫師技能 範圍之內的。本發明組合物的安全有效量通常至少約85毫克/千克體重/天，而且在大多 數情況下不超過約115毫克/千克體重/天。較佳地的劑量是約100毫克/千克體重/天。
[0127] 與現有技術相比，本發明具有以下主要優點：
[0128] (1)本發明的複合物及組合物在NaCl水溶液、PBS水溶液或血清中具有良好的分 散性與穩定性，無沉澱或團聚現象發生。
[0129] (2)本發明的複合物和組合物能與乳腺癌、卵巢癌、腎癌和胃癌細胞高特異性地結 合，對腫瘤組織具有很強的靶向作用。
[0130] (3)本發明的組合物和藥物能夠將抗腫瘤藥物靶向輸送至腫瘤細胞內，有效提高 細胞內的藥物濃度，對腫瘤細胞具有很強的殺滅作用，同時對正常組織和細胞幾乎無毒副 作用。
[0131] 本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所揭示 的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以任何被提供相同、 均等或相似目的的替代性特徵取代。因此除有特別說明，所揭示的特徵僅為均等或相似特 徵的一般性例子。
[0132] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0133] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
[0134] 實施例 1 組合物[D-Arg25]-NPY-ANP-TXT 的製備
[0135] (1)包埋TXT的BSA納米載體（ANP)的製備
[0136] 配製pH10. 8的IOmM NaCl水溶液，再用該溶液配製濃度為20mg/mL的BSA水溶液， 然後向2. OmLBSA水溶液中加入2. OmL無水乙醇，磁力攪拌IOmin後以2. OmL/min的滴加速 率添加4. OmL乙醇(總乙醇添加量與納米載體水溶液的體積比為3. 0)，滴加過程持續磁力 攪拌，乙醇滴加結束後立即加入8%的戊二醛水溶液(戊二醛-BSA質量比為0. 24)交聯固化 24h，然後加入I. OmL甘氨酸（40mg/mL)來中和過量的戊二醛，反應2. Oh後，對樣品進行離 心（20, OOOXg，20min)，所得樣品用IOmM NaCl水溶液洗滌兩次，最後冷凍乾燥48h即可獲 得BSA納米載體。將TXT的溶液分散至20mg/mL的BSA納米載體水溶液中，採用上述同樣 方法即可製得包埋有抗腫瘤藥物的納米載體ANP-TXT。
[0137] (2)納米載體表面偶聯靶分子[D-Arg25]-NPY
[0138] 在EDAC (1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺）的催化下，利用靶分子 [D-Arg25]-NPY的氨基與納米載體ANP表面的羧基之間的化學反應，在納米載體表面偶聯靶 分子[D-Arg25]-NPY。具體製備方法如下：用磷酸緩衝液（PBS)作溶劑配製500 ii g/mL的靶 分子[D-Arg25] -NPY溶液，將50mg EDAC溶於IOmL靶分子溶液(冰浴)，然後加入90mL溶於 PBS的ANP-TXT懸濁液（5. Omg/mL)，將混合液置於室溫下磁力攪拌，反應4-24h，對樣品進行 離心（20, OOOX g，20min)，所得樣品用PBS洗滌兩次，最後冷凍乾燥48h即可獲得表面偶聯 有靶分子，且內部包埋有抗腫瘤藥物納米載體的組合物[D-Arg25]-NPY-ANP-TXT。
[0139] 組合物[D-Arg25] -NPY-ANP-TXT分別在NaCl水溶液、PBS水溶液和血清（serum)中 1-15天的粒徑變化如表1和圖2所示。
[0140] 表 1

【權利要求】
1. 一種複合物，其特徵在於，所述複合物包括： 納米載體；以及 靶分子，所述靶分子偶聯於所述納米載體表面； 其中，所述靶分子選自：[D-Arg25]-NPY、[D-His26]-NPY、[D-Arg 25，D-His26]-NPY、 [Arg6, Pro34] pNPY> [Asn6, Pro34] pNPY> [Cys6, Pro34]pNPY> [Phe6, Pro34]pNPY> [Arg7, Pro34] pNPY、[D-His26，Pro34]NPY、[Phe7，Pro 34]pNPY、[Pro3。，Nle31，Bpa32，Leu 34]NPY (28-36)、 [Pro3。，Nal32, Leu34] NPY (28-36)、[Pro3。，Nle31，Nal32, Leu34] NPY (28-36)、BIB03304、 PD160170、LY366258、J-104870、LY357897、J-115814 或其組合； 並且所述納米載體的粒徑在200nm以下，且多分散指數（PDI)小於0. 5。
2. 如權利要求1所述的複合物，其特徵在於，按複合物總重量計，所述靶分子的含量為 1.11 一 22. 2wt%〇
3. 如權利要求1所述的複合物，其特徵在於，所述複合物具有以下一個或多個特徵： (a) 與乳腺癌、卵巢癌、腎癌或胃癌腫瘤細胞高特異性結合； (b) 納米載體的粒徑在10_200nm。
4. 如權利要求1所述的複合物，其特徵在於，所述納米載體選自：蛋白類納米粒子、寡 肽類納米粒子、磷脂類納米脂質體、多糖類納米粒子、聚醚類納米粒子、聚酯類納米粒子、聚 酯類聚合物膠束。
5. -種組合物，其特徵在於，所述組合物包括： 權利要求1所述的複合物；以及 裝載於所述複合物納米載體中的抗腫瘤藥物。
6. -種權利要求5所述組合物的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 提供一納米載體，所述納米載體中裝載有抗腫瘤藥物； (2) 將步驟（1)的納米載體與靶分子進行偶聯反應，得到所述組合物。
7. 如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述偶聯反應選自： (1) 羧基與氨基的縮合反應； (2) 巰基與馬來醯亞胺的加成反應；或 (3) 親和素與生物素的非共價結合。
8. -種如權利要求1所述複合物的用途，其特徵在於，所述複合物用於製備治療癌症 的藥物。
9. 一種如權利要求5所述組合物的用途，其特徵在於，所述組合物用於製備治療癌症 的藥物。
10. -種藥物，其特徵在於，所述藥物包括： 權利要求1所述的複合物； 裝載於所述複合物納米載體中的抗腫瘤藥物；以及 藥學上可接受的載體。
【文檔編號】A61K47/34GK104415338SQ201310407938
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月9日 優先權日:2013年9月9日
【發明者】李娟 , 吳愛國 申請人:中國科學院寧波材料技術與工程研究所