一種重組人骨形態發生蛋白(rhOP－1)的生產方法

2023-09-14 18:20:00

專利名稱：一種重組人骨形態發生蛋白(rhOP－1)的生產方法
技術領域：
本發明涉及人骨形態發生蛋白(hOP-1)基因的釣取，尤其是在大腸桿菌系統中重組人骨形態發生蛋白(rhOP-1)的表達和純化，屬基因工程製藥技術領域。
hOP-1存在於正常人體，屬細胞因子中的一種，其主要生理作用是誘導骨細胞的形成，尤其適用於骨損傷和骨缺失部位的快速癒合。現有技術中，骨損傷和骨缺失的治療主要採用下述材料，但均存在明顯缺陷(1) 自體植骨自體植骨的優點是植骨後無免疫排斥反應，且新骨形成較快。
但存在病人要面對二次手術的痛苦，如出現大面積骨缺失，來源受到限制。(2) 高分子合成材料，包括PGA和PLA及二者的混合材料PLGA，這些材料對骨細胞的形成無任何促進作用，僅屬物理性衍接。(3) 無機植骨材料包括甲殼素、珊瑚製品、CPC等，在國內尚無任何廠家報批。(4) 異種或異體骨各種頑固性病毒包括狂牛症病毒的存在，人們不敢輕易使用該種材料。
因此，用基因重組技術製備大量的rhOP-1藥物及用其開發具有誘骨活性的複合材料，可以大大改善傳統的自體植骨、高分子合成材料、無機植骨材料及各種異種或異體骨等各種治療方法，給廣大骨損傷和骨缺失病人帶來福音。
人骨形態發生蛋白的發現起源於早期對骨組分的研究，1965年美國Urist[Urist MR.Science，150893-399(1965)]發現，牛骨中的基質明膠中存在誘骨生成的物質。經過三十多年的努力，現已從人的各種組織cDNA文庫中找到了十多個人骨形態發生蛋白基因，OP-1屬其中之一，分子量為14000道兒頓，其中含有鹼性胺基酸，如賴氨酸和精氨酸多個，為一鹼性蛋白。OP-1 cDNA encodes an osteogenicprotein in the TGF-β family//The EMBO Journal，1990；9；2085和Identification ofTGF-B family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone//Proc Natl Acad Sci USA，1990，879843分別公開了BMP-5、6、7的克隆化研究。其基本程序是從骨基質中提取骨形態發生蛋白，純化後用胰酶消化得到數個肽片段，進行胺基酸測序，以此為依據並參照胺基酸密碼寫出骨形態發生蛋白的核苷酸序列，分別合成數個寡核苷酸片段為探針，從基因庫和cDNA文庫進行陽性克隆的篩選。Process of producing osteogenic protein l using yeast//KR97043049公開了用酵母生產成骨蛋白的過程。成骨蛋白-1成熟蛋白編碼區cDNA克隆與序列分析//牙體牙髓牙周病學雜誌97，7(2)84-87公開了第四軍醫大口腔醫學院陳文等用一步酸酚法從健康人胎盤組織中提取總RNA，用Oligo(dt)作引物逆轉錄合成胎盤cDNA文庫，然後利用PCR技術，從cDNA文庫中擴增出編碼人OP-1成熟區的基因片段，將所得基因片段插入DGEM-3If(t)載體，轉化大腸桿菌後挑選陽性克隆。克隆到的OP-1的成熟蛋白基因均為人骨形態發生蛋白的結構基因。在國外hOP-1曾在真核細胞CHO中表達，但產量低，成本高。目前未見採用大腸桿菌系統表達人骨形態發生蛋白的產品及其生產方法的報導。
本發明的目的在於克服現有技術之不足，提供一種重組人骨形態發生蛋白的生產方法，從而獲得具有商業價值的藥用植骨材料。
實現上述目的，本發明採用下述方案實現在大腸桿菌系統中，重組人骨形態發生蛋白的表達和純化，包括利用RT-PCR方法從正常胎兒腎組織cDNA中，放大獲得人骨形態發生蛋白(hOP-1)的基因片段；通過DNA重組技術構建表達質粒，轉化大腸桿菌；在培養液不含誘導劑的條件下表達rhOP-1；通過離子交換柱層析，疏水柱層析和分子篩柱層析獲得高純度藥用rhOP-1蛋白。
通過RT-PCR進行基因擴增，並改造獲得rhOP-1基因片段，其目標蛋白基因序列和相應的胺基酸序列為5′ ATG AGA GGA TCC ACG GGG AGC AAA CAG CGCMet Arg Gly Ser The Gly Ser Lys Gln ArgAGC CAG AAC CGC TCC AAG ACG CCC AAG AAC CAG GAA GCC CTG CGG ATGSer Gln Asn Arg Ser Lys The Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg MetGCC AAC GTG GCA GAG AAC AGC AGC AGC GAC CAG AGG CAG GCC TGT AAGAla Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys LysAAG CAC GAG CTG TAT GTC AGC TTC CGA GAC CTG GGC TGG CAG GAC TGGLys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp TrpATC ATC GCG CCT GAA GGC TAC GCC GCC TAC TAC TGT GAG GGG GAG TGTIle Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu CysGCC TTC CCT CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCC ACC AAC CAC GCC ATC GTGAla Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala The Asn His Ala Ile ValCAG ACG CTG GTC CAC TTC ATC AAC CCG GAA ACG GTG CCC AAG CCC TGCGln The Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu The Val Pro Lys Pro CysTGT GCG CCC ACG CAG CTC AAT GCC ATC TCC GTC CTC TAC TTC GAT GACCys Ala Pro The Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp AspAGC TCC AAC GTC ATC CTG AAG AAA TAC AGA AAC ATG GTG GTC CGG GCCSer Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg AlaTGT GGC TGC CAC TAG 3′Cys Gly Cys His其中離子交換柱填料為DEAE、Q、QAE、SP或CM類型的陰離子交換劑；疏水柱填料為butyl-、phenyl-或octyl-基的疏水介質；分子篩填料為Sepha·ryl系列、Superdex系列或Sepharose系列的介質。
其中離子交換層析流動相I為20-50mM咪唑鹽酸巴比妥鹽、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩衝液、pH的範圍在6.0-9.0；流動相II為上述相應流動相I中加入0.01-0.5M NaCl梯度洗脫。
其中疏水柱層析流動相I為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩衝液，pH的範圍在6.0-9.0，其中加入0.1-1.0M(NH4)2SO4或0.1-1.0M NaCl，流動相II分別以20-50mM pH範圍在7.0-9.0的磷酸緩衝液、Tris鹽酸緩衝液或咪唑緩衝液及水順序洗脫。
本發明在無誘導劑存在下表達rhOP-1，並通過層析精製純化獲得高純度藥用rhOP-1。這種rhOP-1不僅具有誘骨形成能力，且與膠原蛋白或珊瑚粉類材料複合，對骨損傷和骨缺失具有明顯的療效作用。本發明涉及的是用原核細胞對hOP-1進行表達，同真核細胞和酵母系統相比，具有表達量高、生產成本低、生產工藝簡單等優點。該方法的特點是(1)通過大量載體和宿主的篩選，確保載體、目的基因和宿主之間達到高度的協調，使所轉化的大腸桿菌把rhOP-1蛋白視為自身的內源性物質，以至於可以在無誘導劑的存在下高產量表達生產出rhOP-1，表達量可達30％以上。
(2)純化過程利用了陰離子交換樹脂。其原理是將目標蛋白通過靜電相互作用，結合於填料表面，經洗脫去除非結合非特異性組分後，用高鹽濃度將rhOP-1洗脫下來。
(3)為精製rhOP-1使其濃度達到醫用目的，經過陰離子交換樹脂純化後的粗品rhOP-1，再通過疏水柱層析和分子篩進行純化，所得到的目標蛋白純度大於98％，可以直接用於製劑的配製。
(4)精製純化獲得的rhOP-1與膠原蛋白或珊瑚粉等混合後，進行透析，經冷凍乾燥即可獲得具有商業價值的植骨材料。
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳述。


圖1是表達載體SWP-1的組成與特性圖。
圖2是離子交換層析圖譜。
圖3是疏水層析圖譜。
圖4是分子篩層析圖譜。
圖5是重組工程菌的SDS-PAGE電泳圖。
圖6是rhOP-1凍乾產品樣品照片。
參見附圖，本發明提供一種在大腸桿菌系統中，重組人骨形態發生蛋白的表達和純化方法。利用RT-PCR技術釣取得到hOP-1基因，經DNA重組技術，獲得可以轉化大腸桿菌且具有rhOP-1高效表達功能的質粒SWP-1，見
圖1。在培養液不含誘導劑的條件下表達rhOP-1，通過離子交換柱析、疏水柱層析和分子篩柱層析獲高純度藥用rhOP-1蛋白。
具體實施例方式
如下1、rhOP-1工程菌的構建從醫院取華人胎兒的腎細胞，直接用異硫氰酸胍/酚氯仿抽提出總RNA。以總RNA為模板，合成的反義3』端寡核苷酸為引物進行反轉錄，在反轉錄液中加入合成的5』端和反義鏈3』端寡核苷酸引物，用聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)合成rhOP-1結構基因。經2％瓊脂糖凝膠電泳分離開合成引物，切取λHind III分子標準564bp處的DNA條帶。用第二次RT-PCR後的反應液，經純化後以粘性末端方法和質粒載體pUC19直接重組連接，並轉化到E.coli DH5 α宿主菌中得到轉化體，按單菌落擴大培養，抽提重組質粒DNA，作DNA測序，確證含有hOP-1的結構基因，其DNA序列與Genbank Accession No.115078中的結構基因完全一致。
本方法所用的5』端和3』端DNA寡聚核苷酸引物分別為N端引物5』ATC CGG TCC ACGG3』C端引物5』GAG GAG CTA GTG GCA3』本方法所用的RT-PCR條件為第一次反應37℃2min℃→72℃2min→90℃1min循環5次再42℃2min→72℃2min→90℃1min循環30次再72℃保溫5min第二次反應55℃1min→72℃2min℃→90℃1min→循環30次72℃保溫5min本方法所用的表達型重組質粒的構建，是利用引物寡核苷酸引入結構基因兩端的pst I和EcoR I酶切位點，酶切回收OP-1基因，插入連接到以pUC為基礎，T7噬菌體啟動子啟動轉錄的質粒載體SWP-1上，轉化進行入宿主菌E.coli DH5α，然後篩選獲得rhOP-1的無誘導高表達重組體。
2、rhOP-1在無誘導劑存在下的表達以平板上挑選出來的高表達單菌落為發酵種子，在500ml三角瓶中加入100mlLB液體培養基，接入5-10％的對數生長期的種子，於37℃恆溫條件下，150rpm搖瓶發酵24h。rhOP-1的表達量可達菌體總蛋白的30％以上，如圖5所示。
3、藥用rhOP-1的精製和純化用pH7.0-9.0的20mMTris-HCl平衡CM-Sephadex C-50柱，以100cm/h上樣，用離子交換流動相I加0.01-0.5M NaCl進行梯度洗脫，收集A峰，如圖2所示。
在離子交換目標峰收集液中加入0.1-1.0(NH4)2SO4，上Octyl-SepharoseFF柱，用20-50mM硼砂-硼酸緩衝液，在pH7.0-9.0洗脫，再用pH7.0-9.0的20mMTris-HCl洗脫，收集洗脫峰B，如圖3所示。在疏水層析目標峰收集液中加入(NH4)2SO4，4℃透析過夜，低溫下10000rpm離心10min收集沉澱，用pH4.0的5-50mMNaAc-Hac溶解沉澱，上Sephacyl S-100柱，洗脫，收集目標峰流出液，如圖4所示。
將分子篩層析洗脫目標峰流出液，經超濾濃縮，填充、冷凍乾燥得到如圖6所示的樣品。
權利要求
1.一種重組人骨形態發生蛋白(rhOP-1)的生產方法，其特徵在於利用RT-PCR方法從正常胎兒腎組織cDNA中，放大獲得人骨形態發生蛋白(rhOP-1)的基因片段；通過DNA重組技術構建表達質粒，轉化大腸桿菌；在培養液不含誘導劑的條件下表達rhOP-1；通過離子交換柱層析，疏水柱層析和分子篩柱層析獲得高純度藥用rhOP-1蛋白。
2.如權利要求1所述的生產方法，其特徵在於通過RT-PCR進行基因擴增，並改造獲得rhOP-1基因片段，其目標蛋白基因序列和相應的胺基酸序列為5′ ATG AGA GGA TCC ACG GGG AGC AAA CAG CGCMet Arg Gly Ser The Gly Ser Lys Gln ArgAGC CAG AAC CGC TCC AAG ACG CCC AAG AAC CAG GAA GCC CTG CGG ATGSer Gln Asn Arg Ser Lys The Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg MetGCC AAC GTG GCA GAG AAC AGC AGC AGC GAC CAG AGG CAG GCC TGT AAGAla Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys LysAAG CAC GAG CTG TAT GTC AGC TTC CGA GAC CTG GGC TGG CAG GAC TGGLys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp TrpATC ATC GCG CCT GAA GGC TAC GCC GCC TAC TAC TGT GAG GGG GAG TGTIle Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu CysGCC TTC CCT CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCC ACC AAC CAC GCC ATC GTGAla Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala The Asn His Ala Ile ValCAG ACG CTG GTC CAC TTC ATC AAC CCG GAA ACG GTG CCC AAG CCC TGCGln The Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu The Val Pro Lys Pro CysTGT GCG CCC ACG CAG CTC AAT GCC ATC TCC GTC CTC TAC TTC GAT GACCys Ala Pro The Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp AspAGC TCC AAC GTC ATC CTG AAG AAA TAC AGA AAC ATG GTG GTC CGG GCCSer Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg AlaTGT GGC TGC CAC TAG 3′Cys Gly Cys His
3.如權利要求1所述的生產方法，其中離子交換柱填料為DEAE、Q、QAE、SP或CM類型的陰離子交換劑；疏水柱填料為butyl-、phenyl-或octyl-基的疏水介質；分子篩填料為Sepharyl系列、Superdex系列或Sepharose系列的介質。
4.如權利要求1所述的生產方法，其中離子交換層析流動相1為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩衝液、pH的範圍在6.0-9.0；流動相II為上述相應流動相I中加入0.01-0.5MNaCl梯度洗脫。
5.如權利要求1所述的生產方法，其中疏水柱層析流動相I為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂的硼酸或磷酸緩衝液，pH的範圍在6.0-9.0，其中加入0.1-1.0M(NH4)2SO4或0 1-1.0M NaCl，流動相II分別以20-50mM pH範圍在7.0-9.0的磷酸緩衝液、Tris鹽酸緩衝液或咪唑緩衝液及水順序洗脫。
全文摘要
本發明涉及在大腸桿菌系統中重組人骨形態發生蛋白的表達和純化方法,屬基因工程製藥技術領域。本發明利用RT－PCR方法從正常胎兒腎組織cDNA中,放大獲得人骨形態發生蛋白(rhOP－1)的基因片段,通過DNA重組技術構建表達質粒,轉化大腸桿菌在培養液不含誘導劑的條件下表達rhOP－1;通過離子交換柱層析,疏水柱層析和分子篩層析獲得高純度藥用rhOP－1蛋白。這種rhOP－1不僅具有誘骨形成形力,且與膠原蛋白或珊瑚粉類材料複合,對骨損傷和骨缺失具有明顯的療效作用。
文檔編號C12N15/63GK1273976SQ0011287
公開日2000年11月22日 申請日期2000年4月21日 優先權日2000年4月21日
發明者崔太安, 劉紅, 尹葆康, 潘紅春, 張濤, 譚滿秋, 李定祥, 楊紅濤, 李天泉 申請人:西南藥業股份有限公司