幾丁質珠、聚氨基葡糖珠、這些珠的製造方法和這些珠製得的載體以及微孢子蟲孢子的制...的製作方法

2023-09-14 10:21:55

專利名稱：幾丁質珠、聚氨基葡糖珠、這些珠的製造方法和這些珠製得的載體以及微孢子蟲孢子的制 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及從主要細胞壁物質為幾丁質的微孢子蟲孢子製得的均勻微細粒徑的幾丁質珠、該幾丁質N-脫乙醯化所得的均勻微細粒徑的聚氨基葡糖珠、這些珠的製造方法和這些珠製得的載體以及微孢子蟲孢子的製造方法。
背景技術：
聚氨基葡糖因為具有良好的物理化學吸附性、生物體適應性和微生物分解性，作為醫藥·醫療用、香料用、化妝品用、粘合材料·塗料用和複印·記錄表示用的材料等，是能夠在廣泛產業範圍內應用的生物高分子。一方面，粒徑波動小的多孔性珠(beads)作為酶等的固定化用載體，廣泛地應用於化學、醫療、食品和工業過程等各種產業領域。所以，如果能夠提供聚氨基葡糖的具有均勻粒徑的多孔性珠，可望能在多方面進行應用。
以前，聚氨基葡糖珠例如按以下的複雜方法製造。首先，從形成甲殼類外骨骼的成分中除去無機物，得到聚氨基葡糖，將其充分溶於有機酸作成均勻的原液。將此原液滴入鹼性凝固液中或在其中放出，使之凝固，製造得到聚氨基葡糖珠(Knorr,D.,M.Daly聚氨基葡糖/藻酸多層凝聚層膠囊觀察到力學與擴散變化Mechanics and diffusional changes observedin multi-layer chitosan/alginate coacervate capsules，工藝生物化學Process Biochemistry,4,48-50(1988))。
發明的公開在上述以前的方法中，聚氨基葡糖珠的粒徑和多孔狀態會因脫溶劑的速度和凝固液向生成的珠中的滲透、擴散速度等的不同而發生大幅度變化。正因為如此，就不容易使珠的粒徑一致，要製造粒徑均勻的聚氨基葡糖珠，就必需有複雜的製備操作並有熟練的技術，從而使大量生產很困難。所以，人們希望開發出根據在收率、效率、經濟等方面優秀且處理容易的製造工藝進行的製造均勻微細粒徑聚氨基葡糖珠的方法。
在本發明中，利用了主要細胞壁物質為幾丁質構成的均勻微細粒徑的微孢子蟲類的孢子在昆蟲體內或培養細胞內能夠效率良好地生產得到這個特性，解決了上述問題。也就是說，本發明的目的在於，利用粒狀微孢子蟲孢子細胞壁物質的主要成分為幾丁質這一點，提供高效且經濟地製造均勻微細粒徑的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠和微孢子蟲孢子的方法，同時提供如此所得的均勻微細粒徑的珠和這些均勻粒徑的珠製成的載體。
本發明者們就昆蟲來源的生物高分子的新應用技術的開發進行了深入的研究。結果首先發現，微孢子蟲孢子能在昆蟲體內或培養細胞內高效地生產，而且微孢子蟲孢子呈均勻粒徑的球狀、橢球狀，因微孢子蟲孢子的主要細胞壁物質為幾丁質，如果在粒徑均勻的幾丁質珠或聚氨基葡糖珠上固定抗生素及生理活性物質，就可用作緩釋載體，從而完成了本發明。
如果在家蠶、野蠶或其它多種昆蟲或者培養細胞中接種微孢子蟲孢子，則主要細胞壁物質為幾丁質、數微米大小的微孢子蟲孢子大量增殖。本發明者們發現了精製、分離增殖的微孢子蟲孢子、得到一定粒徑的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠和微孢子蟲孢子的方法，以及將這些珠製成抗生素和生理活性物質等的固定化用載體的簡易方法。
本發明者們首先揭示了往昆蟲或培養細胞中接種微孢子蟲孢子的時間、接種量、接種方法和在昆蟲體內等增殖後的微孢子蟲孢子的精製、分離方法，以及高效生產微孢子蟲孢子所需的最適條件。
對於微孢子蟲孢子往昆蟲或培養細胞中的接種，現有例如有①往昆蟲飼料中加入目的的微孢子蟲孢子的經口接種方法、②對飼養過程中的昆蟲經皮直接接種微孢子蟲孢子的方法等。
微孢子蟲孢子的形狀很多樣，但各個種類會有一定的形狀，其主要的細胞壁物質為幾丁質和蛋白質的複合物。所以孢子可以①作為增殖後的微孢子蟲孢子的幾丁質珠，還有②作為微孢子蟲孢子的幾丁質N-脫乙醯化的聚氨基葡糖珠來使用。此外，將微孢子蟲孢子表面的幾丁質進行N-脫乙醯化處理，可以製造出微粒子表面為聚氨基葡糖的聚氨基葡糖珠。還有，活化細胞內物質，使其從孢子的細胞壁中出來，也可以製造出微孢子蟲孢子細胞壁上有小孔的中空珠。
如上所述，本發明的幾丁質珠是由在昆蟲或培養細胞內增殖的微孢子蟲孢子製成的、以幾丁質為主要細胞壁物質的均勻微細粒徑的珠；此外，聚氨基葡糖珠為該細胞壁物質幾丁質N-脫乙醯化的產物。此幾丁質珠和聚氨基葡糖珠也可以是除去蛋白質的非抗原性物質。蛋白質的除去可按通常的水解處理進行。此外，根據需要，上述增殖的微孢子蟲孢子也可以是細胞壁上有孔的，上述幾丁質珠和聚氨基葡糖珠可以是中空的。這些孔可以通過過氧化氫處理或鹼處理得到。
本發明的載體從如上述的增殖的微孢子蟲孢子製得，它是以幾丁質為主要細胞壁物質得到的均勻微細粒徑的幾丁質珠或該細胞壁物質幾丁質N-脫乙醯化的聚氨基葡糖珠製成的。此幾丁質珠和聚氨基葡糖珠也可以是除去蛋白質的非抗原性物質。蛋白質的除去可按通常的水解處理進行。如上所述，根據需要，這些增殖的微孢子蟲孢子可以是細胞壁上有孔的，這些幾丁質珠和聚氨基葡糖珠也可以是中空的。這些孔可以通過過氧化氫處理或鹼處理得到。
本發明的載體是用於固定或引入生理活性物質、抗生素、生物體細胞、細菌等微生物、無色和有色的染料、藥物、農藥、香料、飼料原料及食品原料等的物質。
還有，本發明的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠包埋入人等的體內時，希望具有非抗原性。
本發明的均勻微細粒子(幾丁質珠和聚氨基葡糖珠)的製造方法如下所述，以5×102～5×108個/毫升、優選5×102～5×107個/毫升的濃度經口或經皮往昆蟲體內接種微孢子蟲孢子，增殖以後，取出在生育昆蟲體內增殖的孢子，精製得到均勻微細粒子(幾丁質珠)，接著按照要求將幾丁質珠的幾丁質N-脫乙醯化，得到均勻微細粒子的聚氨基葡糖珠。孢子濃度不足5×102個/毫升時，對昆蟲的感染效率低，或因感染率產生變動而無效；此外，不足濃度超過5×108時，在昆蟲體內完全形成孢子前昆蟲就要死亡對經濟方面不利。微孢子蟲的接種時間優選該昆蟲為2齡起蠶的時候，孢子的採集優選從昆蟲的5齡期開始。該昆蟲優選家蠶的幼蟲。
本發明的微孢子蟲孢子的製造方法優選如下述過程進行，往以細胞培養培養基重量為基準，含家蠶幼蟲體液的上清5～50％重量、優選10～40％重量的細胞培養基中加入昆蟲來源的培養細胞，再往其中接種微孢子蟲孢子使之增殖後，從增殖的細胞中取出微孢子蟲孢子。在家蠶幼蟲體液的上清的添加量不足5％重量和超過50％重量的情況時，孢子都不能增殖。此外，在優選範圍內孢子能更高效地增殖。
圖的簡單說明

圖1表示下述實施例2所得的乾燥粉末(幾丁質珠)和標準樣品的幾丁質相比較的紅外吸收光譜。
實施發明的最佳形式作為本發明中所用的微孢子蟲，沒有特殊的限定，只要是具有形狀能保持一定的珠形狀而且主要的細胞壁物質為幾丁質的孢子的微孢子蟲就可以。例如可以使用家蠶微粒子蟲(Nosema bombycis)、家蠶微粒子蟲(No.402)、家蠶微粒子蟲(No.408)、家蠶微粒子蟲(No.520)、家蠶微粒子蟲(No.611)、微粒子蟲屬(M 11)和微粒子蟲屬(M 14)等的微粒子蟲屬微孢子蟲，多形孢蟲屬(Vairimorpha)(M12)，擬微孢子蟲屬(Plestophola)(M25)，擬微孢子蟲屬(M27)和消泡微孢子蟲屬(Thelophania)等。
在本發明中，可以利用家蠶、大菜粉蝶Pieris brassicae、美國白蛾Hyphantria cunea、絹粉蝶Aporia crataegi、人紋汙燈蛾Spilosomasubcarnea Walker、蓖麻蠶Philosamia cynthia arrinda和樗蠶Philosamiacynthia等廣大範圍的昆蟲作為微孢子蟲孢子的宿主。在昆蟲當中，特別符合要求的是已確立了飼養方法、飼養技術的，在遺傳、育種、生理、生態等方面已進行了全方位研究的家蠶。採用家蠶的幼蟲可以生產出大量的微孢子蟲孢子。以家蠶為對象製造微孢子蟲孢子時，以每隻家蠶5×102～5×107個/毫升微孢子蟲孢子的接種量對2齡起的蠶進行經口或經皮接種，在5齡期時可望精製、分離大量增殖的微孢子蟲孢子。如果將微孢子蟲孢子經口接種入1齡起的蠶，則在微孢子蟲孢子形成前蠶就病死了。將家蠶微粒子蟲的原蟲給予家蠶時，優選每隻2齡起的蠶大約接種5×102～3×103個孢子，在幼蟲開始死亡的接種的第12天採集幼蟲體內的孢子能最高效地得到微孢子蟲孢子。
在本發明中，如上所述，能在昆蟲體內或培養細胞內得到大量的目的物微孢子蟲孢子，所以除了可以使用家蠶等昆蟲外，還可以使用哺乳動物和廣大脊椎動物、無脊椎動物來源的培養細胞。接種後的昆蟲可以在15～32℃下按通常方法進行飼養，優選的飼養溫度為25～28℃。另一方面，接種後的培養細胞可以在20～30℃下，優選25～28℃下進行培養。
作為本發明所用的培養細胞，可如下述例子所示。
作為家蠶來源的培養細胞，例如有家蠶(Bombyx mori)S.P.C.Bm36、家蠶Bm N-4、家蠶SES-BoMo-15A等；作為柞蠶來源的培養細胞，例如有中國柞蠶(Antheraea pernyi)NIS ES-AnPe-428；作為長角天蠶來源的培養細胞，例如有蓖麻蠶(Philosamia cynthiapernyi)NIS ES-SaCy-12。此外，作為桑斑汙燈蛾來源的，例如有桑斑汙燈蛾(Spilosoma imparilis)FRI-SpIm-1229；作為甘藍夜蛾來源的培養細胞，例如有甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)SES-MaBr-4。
在上述培養細胞中，對中國柞蠶(Antheraea pernyi)NIS ES～AnPe-428來說，如果使用含家蠶幼蟲體液的上清5～50％的Grace培養液時，在培養溫度為20～30℃、優選25～28℃下，微孢子蟲孢子能夠在培養細胞內高效地增殖。對於中國柞蠶(Antheraea pernyi)NIS ES-AnPe-428以外的培養細胞，可以使用通常一般所用的培養液進行培養(橫田等，九州蠶絲，34(1995))。
用培養細胞進行培養時，往培養基中加入一定濃度的家蠶體液上清可使微孢子蟲孢子在培養細胞內容易增殖，形成大量的孢子。為了經濟、高效地生產微孢子蟲孢子，家蠶體液上清的添加量優選培養液的10～40％重量。培養條件可以和未添加上清時一樣。對於體液的調製，用剪刀把5齡家蠶幼蟲的足剪斷，用冰冷卻的玻璃制試管收集體液的方法既簡便又有效。將這樣收集的體液在水浴60℃下加熱15分鐘，沉澱體液中所含的蛋白質，以傾潷的方法除去它，就可以使用這樣所得的體液上清。
使用昆蟲來源的培養細胞時，不受昆蟲的飼養、採集等、昆蟲的得到的制約，能夠以箱式培養簡單而高效地生產微孢子蟲孢子。
對野蠶來源的培養細胞桉大蠶蛾Antheraea eucalypti細胞給予微孢子蟲孢子時，可以往家蠶幼蟲體液的上清最大加到40％的市售細胞培養液(例如Grace培養液，Gibco公司製造)中的細胞直接接種微孢子蟲孢子從而在培養細胞中高效地生產微孢子蟲孢子。
因為往昆蟲或昆蟲來源的培養細胞中接種微孢子蟲孢子而生產的孢子對家蠶具有強大的傳染性，從防止對家蠶的汙染的角度出發，所取出的孢子應該進行福馬林、醇處理或熱處理等，使之無毒化。無毒化後的微孢子蟲孢子如果就這樣使用可以作為不溶於水的幾丁質微粒(幾丁質珠)應用。
製造本發明的均勻微細粒徑的幾丁質珠時的增殖微孢子蟲孢子的精製按以下步驟進行。即，例如將體內增殖了微孢子蟲孢子的昆蟲幼蟲在0.85％氯化鈉水溶液中磨碎後，用脫脂棉濾過，收集孢子，用離心分離器進行2次離心操作。接著，移至Percoll層(商品名，瑞典法瑪西亞公司製造)上，以3000rpm進行30分鐘的離心分離，可以精製微孢子蟲孢子。
將幾丁質轉換成聚氨基葡糖的N-脫乙醯化處理可按通常的方法進行，例如將微孢子蟲孢子的幾丁質珠在30～50％氫氧化鈉溶液中、80～120℃下處理數小時，使細胞壁物質幾丁質N-脫乙醯化，變成聚氨基葡糖珠。還有，作為N-脫乙醯化所用的藥品、pH等操作條件已知的方法可以適用(Brine等，比較生物化學與生理學Comp.Biochem.Physiol.69B、283(1983))。
本發明的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠的細胞壁物質是由無抗原性的幾丁質、聚氨基葡糖及葡聚糖和抗原性的蛋白質構成的。蛋白質可以經酸和/或鹼水解處理溶出除去，此時珠的形態沒有變化。這種水解，使用0.1～3N、優選0.5～2N、更優選0.9～1.3N的氫氧化鈉、鹽酸，在溫度5～35℃下進行1～25小時，優選在20～25℃下進行8～15小時，更優選在室溫下進行10～12小時，由此得到無抗原性的珠。水解處理可以開始時在酸性水溶液中、而隨後的過程在鹼性水溶液中進行，也可以開始時在鹼性水溶液中、而隨後的過程在酸性水溶液中進行。酸處理和鹼處理合起來為1個循環，重複此操作，應該合計處理5個循環以上。最後用水洗淨後，為了進行殺菌、脫水，用95％以上的乙醇按預定時間進行清洗處理。這樣，就可以完全除去為微孢子蟲孢子細胞壁物質的蛋白質。
在微孢子蟲孢子中把抗生素、細菌、生理活性物質、藥物和生物體細胞，或固定，或引入其內部時，在微孢子蟲孢子的細胞壁上打開微細的小孔是較為有效的。作為在微孢子蟲孢子上開微細小孔的方法，沒有特殊的限定，例如優選下述兩種方法。
①1～6％重量H2O2和孢子懸浮液等量混合的方法。
②將微孢子蟲孢子用25℃的0.2N KOH進行30分鐘的浸漬處理後，分批少量加入pH7.2的磷酸緩衝液，調節浸漬溶液pH至中性的方法。
將微孢子蟲孢子用鹼性水溶液處理後，孢子內的細胞物質被活性化，根據孢子大小的不同，細胞物質在細胞壁上打開例如約0.1～0.3μm的微細小孔，釋放出孢子外，所以可以利用此時生成的微孢子蟲孢子壁的微細小孔。具體地說，先用0.2N的氫氧化鉀水溶液在15～20℃下處理微孢子蟲孢子30分鐘，在這之後，進一步用pH7.2的磷酸緩衝液進行中和處理，活性化孢子內的細胞物質，往培養昆蟲細胞用培養基中放出孢子內細胞物質時形成了微細小孔。
增殖後的微孢子蟲孢子本身為抗原，當如上述用酸、鹼進行水解除去細胞壁物質的蛋白質後的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠就不是抗原了。
如上所述，根據本發明，應用昆蟲或培養細胞中極大量增殖的微孢子蟲孢子，可以得到呈球形或橢球形的、數微米大小的且均勻微細粒徑的幾丁質珠；此外，將幾丁質珠N-脫乙醯化能得到聚氨基葡糖珠。根據本發明，能夠製造以前的製造方法極難得到的均勻微細粒徑的珠，特別是粒徑約1～6微米的無粒徑不均的珠，此外，也能製造中空的聚氨基葡糖珠。按此方法製造的均勻微細粒徑的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠可以作為藥物釋放系統的載體、以及化妝品粉底原料來使用。對於根據本發明的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠，因微孢子蟲的種類不同，可以生產出各種大小的珠。此外，在聚氨基葡糖珠上吸附、固定酶或生物體細胞，就可作為生物反應器用於食品工業及其它廣泛的產業之中。
本發明的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠具有富於反應性的化學組成成分，其表面能夠與酶或免疫抗體形成化學或物理的結合。例如，將免疫球蛋白等抗原、抗體在粒子表面和/或內部固定化可以作為免疫載體使用。此外，幾丁質用化學反應改造成乙二醇幾丁質和羧甲基幾丁質等的改性幾丁質具有優良的保溫性，可以作為化妝品材料使用。還有，將微孢子蟲孢子或幾丁質珠用乙烯化合物進行接枝加工後，在其上固定α-澱粉酶等酶，不僅能提高酶活性的穩定性，又因為有效表面積增大，更能高效地發揮酶的功能。
將昆蟲來源的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠水解後得到的細胞壁物質為如上所述的幾丁質、聚氨基葡糖和葡聚糖等構成，它們中的任一個都是不容易成為抗原的物質。所以，將幾丁質珠和聚氨基葡糖珠作為緩釋載體包埋於人等動物體內時也不發生抗原抗體反應。除去蛋白質的微孢子蟲孢子的細胞壁物質的抗原性已經消失。此外，因為幾丁質珠和聚氨基葡糖珠在一定的時間後能被體內的酶完全分解，所以可以作為能在生物體內分解的安全材料使用。
本發明的幾丁質和聚氨基葡糖的任一個都可以是內部具有空隙的中空珠，它在細胞壁組織上打開了微細的小孔。所以在負壓環境下能夠將生物體細胞、細菌、抗生素、生理活性物質等引入微細的空隙。因為將細菌等微生物封入該珠時，被封入的微生物不容易受外界紫外線等的蛋白質變性因素影響，所以該珠可以作為天敵微生物保護材料使用。
本發明的幾丁質和聚氨基葡糖例如可以作為親和層析用載體、細胞培養用載體和醫藥輔助材料使用，作為藥物、生理活性物質、激素和疫苗等的微囊化基質也能發揮優良的特性。將農藥或肥料等封入微孢子蟲孢子、幾丁質珠或聚氨基葡糖珠中膠囊化的物質可以作為土壤改造材料使用；此外，將微量的有效飼料成分和食品材料封入幾丁質珠或聚氨基葡糖珠中膠囊化的物質可以作為家畜飼料和養魚飼料使用。還有，封入、固定化了細菌的微孢子蟲孢子、幾丁質和聚氨基葡糖對紫外線照射具有保護作用，可以作為生物防護材料用的原料使用。特別地，如果使幾丁質珠和聚氨基葡糖珠的粒徑一致，則能夠在精細化工等領域有特殊的應用。此外，將以根據本發明的幾丁質、聚氨基葡糖為成分的微囊作為壓敏複印紙使用時，可以提高塗抹過程時的乾燥性，此外還可大幅度改善顯色列印性。
如上所述，幾丁質、聚氨基葡糖微粒子能夠有效地應用於農藥、工業、醫學、食品等廣泛的領域。
如前述，微孢子蟲孢子、幾丁質珠或聚氨基葡糖珠中封入細菌等的微生物或生理活性物質等形成的物質在紫外線照射的情況下，因為細胞壁物質幾丁質、聚氨基葡糖吸收了紫外線，阻斷了紫外線的能量，所以能夠長期保持微孢子蟲孢子、幾丁質珠和聚氨基葡糖珠中封入的細菌等微生物和生理活性物質等的生物和生理活性。這樣，微孢子蟲孢子、幾丁質珠和聚氨基葡糖珠能夠有效地防止封入的生理活性物質、細菌等微生物的活性降低。
本發明中除去蛋白質的幾丁質和聚氨基葡糖如上所述即使進入生物體內也難於成為抗原，對生物體沒有不良的影響，所以它固定化具有生理作用的藥物後，即使將其包埋入人等的體內也不引起基於抗原抗體反應的問題。因此，特別地，封入具有抗癌作用的藥物的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠能夠作為用於治療特定患部的靶向載體應用在尖端的醫療領域。
此外，根據水解處理程度的不同，或者在活性化了微孢子蟲孢子的細胞物質、放出內容物的微孢子蟲孢子上打開微細小孔的程度的不同，能夠簡單地控制被負載或封入的藥物、生理活性物質、抗生素等的緩釋速度、緩釋量甚至生物分解性的程度。
實施例接著就實施例和比較例對本發明進行更詳細的說明，但本發明並不僅限於此這些例子。還有，微孢子蟲有很多種類，如果沒有特別限定就使用家蠶幼蟲來源的家蠶微粒子蟲。
實施例中細菌活性和抗原性的評價按下述方法進行。A．細菌活性的評價加熱溶解後，將15毫升保持在55℃的半合成脅本培養基或King B培養基和2毫升檢定菌的孢子液(濃度109-10個/毫升)混合，將此混合物倒入培養皿中固定成平板狀。往此菌液混合平板培養基上滴入10微升被檢樣品，在20～25℃下保持2天後，按下述判定標準分四級評價被檢樣品下的培養基的細菌增殖抑制程度。
+++強(細菌幾乎不增殖，培養基透明度高如透明的玻璃)++較強+弱(細菌稍微增殖，培養基透明度處於透明玻璃和半透明玻璃之間)±輕微(細菌的增殖有1/5的程度，培養基透明度為半透明玻璃程度)-細菌增殖良好，培養基不透明B．對放線菌(黴菌)的抗菌活性的評價方法加熱溶解後，將保持在55℃的PSA培養基和2毫升檢定菌的孢子液(濃度105-6個/毫升)混合，將此混合物倒入培養皿中固定成平板狀，按上述細菌活性的評價進行同樣的處理、觀察。C．抗原性的評價微孢子蟲孢子的抗血清按以下方法調製。將家蠶幼蟲傳代的孢子以Percoll密度梯度管法進行精製，以2000rpm進行10分鐘的離心分離，將沉澱的孢子懸浮於0.85％NaCl溶液中，如此所得的孢子懸浮液(2×108個/毫升)作為抗原，將它和弗氏完全佐劑(Freund’s Complete adjuvant)等量混合，用2毫升所得的混合物對兔子進行1次肌肉注射。在這之後，每次用1毫升孢子懸浮液每隔1周靜脈注射4次，從最後的注射起7天後採血。血清在56℃下去活化30分鐘，然後在-20℃下保存。
對於凝集反應用的抗原，將精製的微孢子蟲孢子用1％的甲醛溶液處理後，以蒸餾水離心洗淨，再將此孢子用0.85％NaCl溶液懸浮(4×107個/毫升)調製而成。
將上述抗血清用0.85％NaCl溶液以2倍分級稀釋後，在載玻片上與孢子懸浮液等量混合，在37℃下反應1小時後，用倒置顯微鏡觀察，評價凝集反應(效價，滴度)。抗體(抗血清)的稀釋倍數分別為16、32、64、128、256、512、1024、2040，按下述判定標準分2級進行評價。
+確認有抗原抗體反應-完全不能確認有抗原抗體反應實施例1將各種微孢子蟲孢子接種於家蠶幼蟲，進行培養，考查能夠從家蠶幼蟲中分離出的各種微孢子蟲孢子的種名、孢子的大小和抗原性。作為微孢子蟲，如表1所示，有家蠶微粒子蟲*(Nosema bombycis)(作為比較其它微孢子蟲特性的標準種Nosema bombycis Nageli)、家蠶微粒子蟲(No.402)、家蠶微粒子蟲(No.408)、家蠶微粒子蟲(No.520)、家蠶微粒子蟲(No.611)、微粒子蟲屬(M 11)、多形孢蟲屬(Vairimorpha)(M 12)、微粒子蟲屬(M 14)、擬微孢子蟲屬(Plestophola)(M 25)、擬微孢子蟲屬(M 27)、和消泡微孢子蟲屬(Thelophania)等。研究結果如表1所示。
所用的微孢子蟲孢子的形狀大致為橢球形，長徑和短徑分別為3～5微米和1～3微米，其形狀和大小對一定種類的微孢子蟲來說是一定的。也就是說，使用一定種類的微孢子蟲，能夠自由地製造均勻形狀的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠。各種微孢子蟲孢子的長徑最大為5微米，可以將符合所望用途的微孢子蟲作為對象使用。還有，它們對蠶的寄生部位如表1所示。
表

>注)*標準種上述家蠶微粒子蟲*(作為標準種的Nosema bombycis Nageli)、微粒子蟲屬(M 11)和Vairimorpha(M 12)已在農林水產省蠶絲·昆蟲農業技術研究所中分別以登記號第860001、860004和860005號保藏，在本申請的優先權日的時間，是本領域技術人員能夠得到的菌種。此外，這些微孢子蟲，基於布達佩斯條約，在美利堅合眾國、馬裡蘭州20852、羅克維爾、Parklawn大道12301號的美國典型培養物保藏中心(ATCC)中，於1998年3月23日交付國際保藏，其保藏編號分別為ATCC第209694、209693和209692號。這些保藏於ATCC的微孢子蟲按ATCC的規定可從第三方獲得。實施例2使用上述表1記載的家蠶微粒子蟲*、微粒子蟲屬(M 11)和擬微孢子蟲屬(M 27)的微孢子蟲原蟲，對2齡起蠶的家蠶幼蟲(日135號×支135號)按每隻3×103個的量分別經口接種入各種微孢子蟲孢子，微孢子蟲孢子在蠶體內增殖後，取出所得的孢子，首先將其在-30℃下冷凍乾燥，接著用東西通商株式會社製造的冷凍乾燥機進行乾燥，得到乾燥粉末。為了簡單地定性孢子溶液得到的乾燥粉末的化學成分，將乾燥樣品粉末和溴化鋰混合，製片，用日本分光工業公司製造的紅外分光光度計測定900～1200cm-1波數範圍的紅外吸收光譜。還有，作為標準樣品，使用和光純藥工業株式會社製造的市售標準樣品的幾丁質。其結果如圖1所示。在圖1中，紅外吸收光譜曲線a表示市售的幾丁質，此外，曲線b、c和d分別表示家蠶微粒子蟲、微粒子蟲屬和擬微孢子蟲屬的結果。所得的標準樣品幾丁質的紅外吸收光譜在985、1025、1065、1100、1145cm-1處出現吸收。即使微孢子蟲孢子的種類不同，也和標準幾丁質樣品的紅外吸收光譜大致在同一波數範圍(1000～1200cm-1)內有相同的吸收，因此可以確定構成各種微孢子蟲孢子細胞壁的主要成分為幾丁質。
此外，以經皮接種代替經口接種時，得到與上述相同的結果。
此外，大菜粉蝶用Pieris brassicae、美國白蛾Hyphantria cunea、絹粉蝶Aporia crataegi、人紋汙燈蛾Spilosoma subcarnea Walker、蓖麻蠶Philosamia cynthis arrinda和樗蠶Philosamia cynthia等代替家蠶幼蟲作為微孢子蟲孢子的宿主時，也和上面一樣得到構成細胞壁的主要成分為幾丁質的微孢子蟲孢子。實施例3與實施例2相同，為了定性地闡明從微孢子蟲原蟲得到的乾燥孢子粉末的結晶形態，使用X射線衍射裝置(理學電機株式會社製造)攝錄X射線衍射照片。所得各樣品面間距離的測定值和標準品幾丁質一起如表2所示。即使微孢子蟲原蟲的種類不同，在樣品的X射線衍射照片中，也都能見到有對應於8.53、6.70、4.64、3.31埃晶面間距的衍射，它們同時都伴隨著寬的暈光。在幾丁質標準品的X射線衍射圖中，可見對應9.30、6.90、4.64、3.36、3.00、2.80埃晶面間距的衍射，和孢子的X射線衍射圖類似。構成微孢子蟲孢子細胞壁的主要物質為幾丁質，X射線衍射照片也能確認這一點。
表2

實施例4蠶絲·昆蟲農業技術研究所保存的微孢子蟲、家蠶微粒子蟲*(相當於ATCC第209694號)的孢子用於實驗，對每隻2齡起蠶的家蠶幼蟲(日135號×支135號)經口接種入3×103個/毫升的家蠶微粒子蟲孢子。因為在家蠶幼蟲體內微孢子蟲孢子極大量地增殖，發生孢子的形成，家蠶幼蟲在5齡期時就皆因微粒子病而死亡。將死亡幼蟲在0.85％氯化鈉水溶液中磨碎後，用脫脂棉濾過，收集孢子。孢子的精製是將2份0.85％氯化鈉水溶液的孢子懸浮液用8份Percoll(商品名瑞典法瑪西亞公司製造)提取分層，以3000rpm在25℃下進行30分鐘的離心分離。
從1隻家蠶幼蟲所得的家蠶微粒子蟲孢子數總數約為1×1010個。將孢子的水溶液乾燥，得到100毫克粉末狀的孢子。實施例5對桉大蠶蛾Antheraea eucalypti培養細胞的微孢子蟲家蠶微粒子蟲*的孢子形成狀態按下述方法進行研究。往加了不同量家蠶血清(家蠶體液上清)的市售細胞培養基(Grace培養液，Gibco公司製造)中接種桉大蠶蛾Antheraea eucalypti培養細胞後，加入一定量的微孢子蟲家蠶微粒子蟲的孢子，培養給定的時間，用血細胞密度計數板在顯微鏡觀察下測定每毫升所含的孢子數。將5齡家蠶幼蟲的足用剪刀剪斷，用冰冷卻的玻璃制試管收集體液，所收集的體液在60℃水浴下加熱15分鐘，除去所含的蛋白質，使用如此所得的體液的上清。測定結果如表3所示。
從此結果可以明顯地看出，在培養細胞增殖時，如果往培養液中加入一定濃度家蠶體液的上清，微孢子蟲孢子就容易在培養細胞內大量增殖，形成孢子。作為經濟且高效生產微孢子蟲孢子的家蠶體液上清的添加量，一般在對應培養液約5～50％重量的範圍，優選在10～40％重量範圍。
表3

實施例6與實施例5不同，使用其它昆蟲來源的培養細胞，討論培養細胞中微孢子蟲孢子的增殖狀態。將家蠶微粒子蟲*和微粒子蟲屬(M 11)兩種原蟲接種於不同種類的昆蟲培養細胞，觀察昆蟲培養細胞中增加的微孢子蟲孢子的數量。培養細胞的增殖方法和實施例5一樣，評價培養液中所加體液量分別為細胞培養基重量的0％和20％兩種情況。所得結果如表4所示。
表4

實施例7按以下方法將上述實施例4製得的微孢子蟲、家蠶微粒子蟲*孢子的細胞壁物質調製成聚氨基葡糖孢子。首先，將此微孢子蟲孢子在40％氫氧化鈉溶液中80℃下處理4小時後，加入水洗淨。其結果是微孢子細胞壁的主要成分幾丁質N-脫乙醯化。光學顯微鏡和掃描式電子顯微鏡觀察顯示，各微孢子蟲孢子即使進行N-脫乙醯化處理，微孢子蟲孢子也不溶解，仍然保持微孢子形狀。實施例8將2毫克和實施例4作同樣處理的家蠶微粒子蟲孢子水解除去孢子內容物所得的粉末狀幾丁質孢子的細胞壁組織按以下方法吸附抗生素。水解時，用室溫的1N NaOH處理12小時後，用1N HCl在處理12小時。將分別用NaOH和HCl處理1次作為1個循環，合計反覆操作5個循環後，為了使孢子脫水最後用95％乙醇處理2小時。這樣就能夠將作為微孢子蟲孢子細胞壁物質的蛋白質完全除去。此外，對於抗生素的吸附來說，將10毫克利福平或四環素用3毫升蒸餾水溶解所得的溶液和該幾丁質孢子裝入管中，用水流唧筒(水泵)反覆進行3次減壓、抽氣，進一步用超聲波進行10分鐘處理使抗生素滲透入細胞壁組織。接著，用離心機以2500rmp離心分離20分鐘，使含有抗生素的幾丁質孢子沉澱下來。進一步加入10毫升蒸餾水，再次離心分離，用傾潷的方法除去上清，分離得到含有利福平或四環素的幾丁質孢子。
家蠶微粒子蟲孢子中是否負載有利福平或四環素按以下方法確定。將家蠶微粒子蟲孢子小心地用水洗3次後，以3000rpm離心分離20分鐘回收孢子，評價對番茄潰瘍病細菌(密執安棍狀桿菌密執安變種Clavibactermichiganensis pv.michiganensis)增殖的抑制程度。其結果表明，即使是反覆用水洗的家蠶微粒子蟲孢子也能完全抑制番茄潰瘍病細菌的增殖，因此判定孢子上負載有抗生素。實施例9應用實施例2所示的紅外吸收光譜測定用試樣片的製作方法，如下述過程製造完全不用溴化鋰只用家蠶微粒子蟲孢子作成的圓形板狀片。
將200毫克實施例4所得的粉末狀家蠶微粒子蟲孢子裝入日本分光工學工業公司製造的直徑10mmφ的紅外吸收光譜片劑成形器中，用真空泵抽氣20分鐘後，用油壓式加壓裝置往片劑成形器上施加150kg/cm2的壓力，在此狀態保持10分鐘的壓力，製得厚度約0.3毫米的強韌的圓形板狀盤。象這樣，能夠將本發明所得的微孢子蟲孢子作為塊狀材料使用。實施例10將200毫克實施例4所得粉末狀家蠶微粒子蟲孢子加入裝有冷凝器的50毫升梨形瓶中，再加入30毫升40％重量的氫氧化鈉水溶液，用油浴在100℃下處理3小時，得到脫乙醯化度93.6％的均勻微細粒徑的聚氨基葡糖珠。實施例11天敵微生物的保護效果(利用微孢子蟲孢子的對紫外線的細菌保護作用)如下述將細菌封入微孢子蟲孢子中。在和實施例8相同的條件下進行水解處理除去孢子的內容物，將2毫克與實施例4作同樣處理所得的粉末狀家蠶微粒子蟲孢子裝入細胞培養用的離心管，往其中加入2.0毫升109個/毫升濃度的地耳腐(褐斑)病細菌託拉氏假單胞菌Pseudomonas tolaasii或番茄潰瘍病細菌(密執安棍狀桿菌密執安變種Clavibacter michiganensispv.michiganensis)的懸濁液，用水流唧筒減壓10分鐘後，解除減壓，引入空氣。減壓和空氣引入反覆操作3次。接著，用離心機以1000rpm離心分離10分鐘，孢子在離心管底部聚集。取0.2毫升沉澱的孢子(下面稱為有孢子區)，在直徑9釐米的玻璃制培養皿內的瓊脂培養基上用L字棒均勻地展開。風乾孢子液直至在培養基上不呈水狀後，將培養基置於距離紫外燈20釐米處，分別照射10秒、30秒、1分鐘、2分鐘、5分鐘。還有，UV照射實驗在淨化臺內進行，光源用national GL-15(15瓦)的殺菌燈。紫外線照射3天後統計1/6培養皿面積上出現的菌落數，評價微孢子蟲孢子對紫外線照射的保護作用。所得結果如表5所示。還有，在完全不含有微孢子蟲孢子的系統中，將和上述一樣在離心管沉澱所得的細菌液作為對照區(下面稱為無孢子區)使用。
表5殺菌燈照射時間和封入進行的微孢子蟲孢子的保護作用

在上述表5中，1/6培養皿面積中出現的菌落(colony)數太多以致於不能測定時，以「多」表示；此外，對於集落數較多但可以在量上區別時，用+++～-(無)四個級別表示。
在紫外線照射下孢子對細菌的保護作用按下述方法定量化。使用半對數方格紙，將1/6培養皿面積上出現的菌落數的對數作為縱軸，將照射時間以分鐘為單位作為橫軸。從此圖中求出使培養皿中出現的菌落數減少到大約20個所需的照射時間，無孢子區為30秒，有孢子區為5分鐘。
從此結果可見，將地耳腐病細菌託拉氏假單胞菌Pseudomonas tolaasii封入家蠶微粒子蟲孢子中時，即使受到紫外線照射，封入內部的細菌的死亡率也比無孢子區的低，大約有10倍的保護作用。此外，對番茄潰瘍病細菌也可見保護作用。因為可以確認封入所帶來的保護作用，所以封入了細菌、酶、生理活性物質等的本發明的微孢子蟲孢子作為天敵微生物用的保護載體等很有用。實施例12幾丁質孢子的抗生素吸附實驗按下述方法，用濃鹼溶液處理幾丁質珠，將其改性成聚氨基葡糖珠。將100毫克幾丁質珠加入裝有回流冷凝器的梨形瓶中，加入50毫升30％重量的NaOH水溶液，用油浴在100℃下處理2小時。反應結束後，用充足的蒸餾水洗淨，用離心機以3000rpm離心10分鐘，製備聚氨基葡糖珠。接著，往0.2毫升10毫克利福平溶於3毫升水調製而成的抗生素水溶液中加入0.5毫克上述聚氨基葡糖珠後，用水流唧筒反覆抽氣5次，製成一個部分。按實施例8相同的方法研究對番茄潰瘍病細菌增殖的抑制作用，結果表明利福平反覆抽氣5次部分的聚氨基葡糖珠確實吸附了抗生素。為了研究吸附了利福平的微孢子蟲孢子的聚氨基葡糖作為緩釋載體是否有效，用番茄潰瘍病細菌評價其緩釋效果。
如上所述，將0.5毫克微孢子蟲孢子的聚氨基葡糖粉末分散於0.2毫升上述的利福平水溶液中，將此分散液裝入離心管中。接著，以5000rpm離心分離3分鐘，將微孢子蟲孢子沉澱物和上清分離。將0.1毫升沉澱物裝入其它離心管，往其中重新加入1毫升蒸餾水，再次離心分離，以同樣方法分離上清和微孢子蟲孢子沉澱物。每隔一定時間，就如此所得的沉澱物和上清部分，研究它們對番茄潰瘍細菌增殖抑制的抗菌作用。這樣得到的結果如表6所示。
表6

含有微孢子蟲孢子的沉澱物顯示出比上清恆定更高的抗菌活性，因為即使在8天後它也具有抗菌活性，所以可以判定吸附有抗生素的微孢子蟲孢子作為抗生素的緩釋載體是有效的。作為對照所用的上清稀釋液在所經過時間0天時使用對應上清的原液，所經過時間為2、4、6、8天時分別為依次稀釋10倍的原液(對應經過時間2、4、6、8天分別稀釋為10、100、1000、10000倍)。稀釋1000倍時對照稀釋上清液的抗菌作用消失，而相同樣品所對應上清的抗菌活性依然存在。由此可見，微孢子蟲孢子作為抗生素用緩釋載體有效。實施例13使用培養細胞的微孢子蟲孢子的生產作為昆蟲培養細胞，使用天蠶蛾科的一個種桉大蠶蛾Antheraeaeucalypti的培養細胞系、鱗翅目昆蟲來源的Bm36培養細胞系。使用分別添加了5％在60℃下加熱處理15分鐘的家蠶幼蟲體液上清和胎牛血清的培養液，將桉大蠶蛾Antheraea eucalypti的培養細胞系、鱗翅目昆蟲來源的Bm36培養細胞系分別在Grace培養基上、26℃下進行培養。微孢子蟲孢子往培養細胞的接種按下述方法進行。即，用Percoll精製已部分精製的微孢子蟲孢子，以0.2N-KOH在25℃下處理30分鐘後，將所得的精製孢子和培養細胞混合，以進行接種。
接種10天後收集這些培養細胞，將用超聲波清洗器處理破壞的培養細胞的懸浮液用Percoll分層，進行離心分離操作，大量製造微孢子蟲孢子。實施例14按下述方法除去和實施例1所用的相同的微孢子蟲孢子(家蠶微粒子蟲)的細胞壁物質蛋白質，製造無抗原性的幾丁質珠。
首先進行水解，在室溫下用1N NaOH處理12小時後，再用1NHCl處理12小時。NaOH和HCl處理合計反覆操作5次後，最後用95％乙醇處理2小時，將孢子脫水。接著，以2000rpm離心分離20分鐘，沉澱孢子，往此沉澱物中加入水，離心分離操作重複7次，製得完全除去孢子細胞壁物質蛋白質的幾丁質珠。為了以血清反應檢測如此所得的幾丁質珠的抗原抗體反應，將從使用了無處理的微孢子蟲孢子的家兔製得的抗血清用於實驗，使用此抗血清的稀釋液，比較對於無處理孢子(對照部分樣品)和處理孢子(水解處理樣品)，稀釋到何種程度的稀釋液與其發生血清反應。其結果如表7所示。
表7

注)+有血清反應-沒有血清反應對於無處理孢子(對照部分樣品)，抗血清即使稀釋1024倍也仍然可見血清反應，而對於處理孢子(水解處理樣品)稀釋到16倍時就完全沒有血清反應。這樣可以判定，經過水解處理，作為孢子細胞壁成分中抗原的蛋白質已被完全除去，所得的幾丁質珠是無抗原性的。
用酸或鹼除去微孢子蟲孢子的細胞壁物質蛋白質後，主要成分幾丁質的量相對增加，測定X射線衍射強度確認這一點。將微孢子蟲孢子用火棉膠固定，測定X射線衍射，如上述表2所見，可以觀察到R1、R2、R3、R4的衍射環(幹涉環)，但任一個都顯示出散亂的衍射環。然而如果用酸或鹼只是除去細胞壁物質中的蛋白質，那麼經過此處理的微孢子蟲孢子的幾丁質顯示的R1～R2的衍射強度變尖銳，證實幾丁質含量增加。
此外，即使將經水解處理的樣品在25℃下與1％的水合茚三酮反應20小時，也完全不見顯色反應，可以確定樣品中完全不存在胺基酸。實施例15具有微細小孔的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠將和實施例1中所用的相同的微孢子蟲孢子(擬微孢子蟲屬M27)的懸浮液加入0.2N的氫氧化鉀水溶液中，在25℃下放置30分鐘。1小時後用和光純藥工業製造的生物化學用pH7.2磷酸緩衝液中和樣品。經過此簡單的處理，微孢子蟲孢子內的細胞物質被活化，細胞內容物從孢子中放出，用掃描式電子顯微鏡觀察確定此時生成每個約0.3μm的孔。這种放出細胞物質後的微孢子蟲孢子的大小為長徑1.7μm×短徑0.9μm，細胞膜厚約0.13μm，呈細胞壁內全空的橢圓球狀，放出細胞物質所形成的孔在橢圓球體長徑方向的一端。因為此孔的存在，通過對此微孢子蟲孢子環境壓力的減壓或解除減壓，能夠很容易地將酶、抗生素、金屬離子、藥物、病毒、生理活性物質等封入微孢子的空隙中，所以本發明的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠，作為大小一致、呈微粒狀態的上述藥效成分的緩釋載體很有用。實施例16具有微細小孔的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠將實施例15中所用的微孢子蟲孢子用家蠶微粒子蟲No.520代替，其它和實施例15作相同處理。如此所得的放出細胞物質後的微孢子蟲孢子的大小為長徑2.6μm×短徑1.4μm，細胞膜厚約0.13μm，呈細胞壁內全空的橢圓球狀，透射式電子顯微鏡觀察確定，放出細胞物質所形成的孔在橢圓球體長徑方向的一端，孔的直徑為0.1μm。因為此孔的存在，和實施例5一樣作為藥效成分的緩釋載體有效。實施例17隻除去微孢子蟲孢子的細胞壁物質蛋白質的物質的安全性實驗如下述方法進行。
用實施例1中製造的微孢子蟲孢子用酸水解處理所得的孢子懸浮液(4×108孢子/毫升)每隔一周給家兔靜脈注射，觀察家兔的發育過程。接種6個月後，和沒有注射的對照組兔子相比，注射了的處理組兔子在體重變化和外觀上都完全沒有異常。
產業上的利用可能性根據本發明，均勻微細粒徑的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠可以作為藥物輸送系統用載體、甚至化妝品粉底原料使用。在聚氨基葡糖珠上吸附、固定酶或生物體細胞，能夠作為生物反應器應用於食品工業及其它廣泛的領域。
此外，在這些珠的表明和/或內部結合酶或免疫抗體等，可以作為免疫載體使用。此外，將幾丁質改良成乙二醇幾丁質、羧甲基幾丁質的改良幾丁質具有優良的保溫性，能夠作為化妝品材料使用。還有，將微孢子蟲孢子或幾丁質珠用乙烯化合物等進行接枝加工後，如往其中固定酶，不僅能提高酶活性的穩定性，還因為微粒子具有廣大有效表面積的特徵，能更高效地發揮酶的功能。
將本發明的進行蛋白質除去處理了的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠即使包埋於包括人在內的動物體內，也不發生抗原抗體反應，因此它可作為緩釋載體使用。此外，幾丁質珠、聚氨基葡糖珠在經過一定時間後，能被體內的酶分解，可以作為能在生物體內分解的安全材料。幾丁質珠、聚氨基葡糖珠即使進入生物組織內也難於成為抗原，所以可以在其上固定具有生理作用的藥物，然後埋入體內使用；特別地，封入具抗癌作用藥物的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠作為靶向載體能夠利用於尖端的醫療領域。
此外，本發明的幾丁質珠、聚氨基葡糖珠可以製成內部有空隙的中空珠，因為細胞壁組織上開有微細小孔，所以能夠將生物體細胞、細菌、抗生素、生理活性物質等通過微細小孔封入空隙中。封入的物質因不易受外界的蛋白質變性因素(紫外線等)的影響，其生物活性能夠長期保持。所以這些珠例如能夠作為天敵微生物保護材料的新原料。
本發明的微孢子蟲孢子作為藥物、生理活性物質、激素、疫苗等的微囊基質材料也很優秀，將農藥、肥料等封入微孢子蟲孢子中再膠囊化的物質可以作為土壤改良材料使用。此外，封入飼料成分在膠囊化的物質可以作為家畜飼料和養魚飼料使用。
根據本發明，通過增減水解處理的程度、或者微孢子蟲孢子的細胞壁上微細小孔打開的程度，就能很簡單地控制藥物、生理活性物質、抗生素等的緩釋速度、緩釋量、生物分解性的程度。更進一步，因為幾丁質珠、聚氨基葡糖珠能被生物體內的酶逐漸分解，所以能夠作為生物降解性材料使用。
權利要求
1．昆蟲或培養細胞內增殖的微孢子蟲孢子製得的、以幾丁質為主要細胞壁物質的均勻微細粒徑的幾丁質珠和該細胞壁物質幾丁質N-脫乙醯化形成的聚氨基葡糖珠。
2．根據權利要求1記載的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠，其中幾丁質珠和聚氨基葡糖珠為除去了蛋白質的無抗原性的物質。
3．根據權利要求1或2記載的幾丁質珠和聚氨基葡糖珠，其中增殖微孢子蟲孢子為其細胞壁上有孔的物質，而且幾丁質珠和聚氨基葡糖珠為中空的。
4．載體，是由昆蟲或培養細胞內增殖的微孢子蟲孢子製得的、以幾丁質為主要細胞壁物質的均勻微細粒徑的幾丁質珠和該細胞壁物質幾丁質N-脫乙醯化形成的聚氨基葡糖珠製成的。
5．根據權利要求4記載的載體，其中幾丁質珠和聚氨基葡糖珠為除去蛋白質的無抗原性的物質。
6．根據權利要求4或5記載的載體，其中增殖微孢子蟲孢子為其細胞壁上有孔的物質，而且幾丁質珠和聚氨基葡糖珠為中空的。
7．根據權利要求4～6任一項記載的載體，其中的載體是用於固定或導入生理活性物質、抗生素、生物體細胞、微生物、染料、藥物、農藥、香料、飼料原料、或食品原料等的物質。
8．一種均勻微細粒徑幾丁質珠的製造方法，其特徵在於，將濃度為5×102～5×108個/毫升的微孢子蟲孢子經口或經皮接種於昆蟲使之增殖後，取出在生育後的昆蟲體內增殖的該微孢子蟲孢子，進行精製，得到均勻微細粒子的幾丁質珠。
9．根據權利要求8記載的均勻微細粒徑的幾丁質珠的製造方法，其特徵在於，其中的昆蟲為2齡起的蠶，上述生育後的昆蟲為5齡期。
10．根據權利要求8或9記載的均勻微細粒徑的幾丁質珠的製造方法，其特徵在於，其中的昆蟲為家蠶幼蟲。
11．一種均勻微細粒徑聚氨基葡糖珠的製造方法，其特徵在於，將濃度為5×102～5×108個/毫升的微孢子蟲孢子經口或經皮接種於昆蟲使之增殖後，取出在生育後的昆蟲體內增殖的該微孢子蟲孢子，進行精製，得到均勻微細粒子的幾丁質珠，接著將幾丁質珠的幾丁質進行N-脫乙醯化，得到聚氨基葡糖珠。
12．根據權利要求11記載的均勻微細粒徑的聚氨基葡糖珠的製造方法，其特徵在於，其中的昆蟲為2齡起的蠶，生育後的昆蟲為5齡期。
13．根據權利要求11或12記載的均勻微細粒徑的聚氨基葡糖珠的製造方法，其特徵在於，其中的昆蟲為家蠶幼蟲。
14．一種微孢子蟲孢子的製造方法，其特徵在於，往含有5～50％重量家蠶幼蟲體液上清的細胞培養基中加入昆蟲來源的培養細胞，往此細胞中接種微孢子蟲孢子使之增殖後，從增殖的細胞中取出微孢子蟲孢子。
全文摘要
本發明涉及從主要細胞壁物質為幾丁質的微孢子蟲孢子製得的均勻微細粒徑的幾丁質珠、該幾丁質N－脫乙醯化得到的均勻微細粒徑聚氨基葡糖珠、這些珠的製造方法和這些珠製得的載體以及微孢子蟲孢子的製造方法。使微孢子蟲孢子在昆蟲或培養細胞內增殖,得到以幾丁質為主要細胞壁物質的均勻微細粒徑幾丁質珠。使細胞壁物質的幾丁質N－脫乙醯化得到聚氨基葡糖珠。昆蟲為家蠶幼蟲時,將濃度為5×10
文檔編號A23L1/22GK1226900SQ98800631
公開日1999年8月25日 申請日期1998年5月13日 優先權日1997年5月14日
發明者冢田益裕, 白田昭, 早坂昭二 申請人:農林水產省蠶絲、昆蟲農業技術研究所長代表的日本國 被以下專利引用 (1),