噴霧乾燥的酶產品的製作方法

2023-09-14 10:28:15

專利名稱：噴霧乾燥的酶產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及含酶的顆粒、製備含酶的顆粒的方法，及含酶的顆粒在組合物中的用途和此顆粒及組合物的應用。
背景技術：
在許多工業和應用方面，酶產品都是已知和有用的。
已知的提供乾燥微粒狀酶產品的技術包括-噴霧乾燥產品，記載在Michael S.Showell(編輯)的《粉末狀去汙劑》(Powdered detergents)中；表面活性劑科學叢書(SurfactantScience Series)；1998；vol.71；140-142頁；Marcel Dekker和GB1,360,969。
-分層產品，如WO97/23606和US5,814,501記載的。
工業和應用渴求和必需的生物學化合物例如酶的改良的性質，導致了複合微粒酶產品的發展，這是一項有許多挑戰性難題的任務。產品的製備過程和加工所用組分及化學藥品應是價廉的，但也應為酶產品提供理想的性能，如改進的酶儲存穩定性、低起塵特性、改良的顆粒機械強度、理想的顏色、形狀和大小。
發明概述本發明第一方面涉及製備一種顆粒的方法，包括使含有酶和生物質的發酵肉湯原料噴霧乾燥，以得到含有酶和生物質的固體顆粒。
第二方面，本發明涉及一種製備含有酶的顆粒的方法，包括使含有酶的水性液體原料噴霧乾燥，得到噴霧乾燥的第一含酶顆粒，隨後使此第一乾燥顆粒經過選自製粒、包衣和二者的組合的工藝，得到第二乾燥的含酶顆粒。
在其它方面，本發明也提供了含有酶和生物質的顆粒、含有這些顆粒的組合物及使用這些顆粒和組合物的方法。
本發明提供了製備性質優良的乾燥酶顆粒的簡單而廉價的方法。
定義本發明上下文使用的術語「發酵肉湯」應理解為水性組合物，含有酶和微生物細胞和/或其細胞碎片，這些細胞在發酵過程中產生了酶。
本發明上下文使用的術語「細胞碎片」應理解為發酵過的微生物細胞的不溶解部分，包括從細胞擴展的結構，如從真菌細胞擴展的菌絲體。
本發明上下文使用的術語「生物質(biomass)」應理解為微生物細胞、細胞碎片或其組合的同義詞。
本發明上下文使用的術語「發酵濾液」應理解為除去了微生物細胞和細胞碎片的發酵肉湯。
本發明上下文使用的術語「酶濃縮物」應理解為已經過加工提高了酶濃度的發酵濾液。
本發明上下文使用的術語「SPAN」(跨度)應理解為顆粒大小分布(PSD)的寬度，表示為SPAN＝(D90-D10)/D50PSD可以用各顆粒的質量平均直徑表示。D50表示的平均直徑是50％重量的顆粒具有小於此值的直徑，50％重量的顆粒具有大於此值的直徑。值D10和D90表示的直徑值指分別有10％和90％重量的顆粒，具有比所述的值小的直徑。
術語「Rayleigh霧化器」應理解為能產生有低SPAN值的液滴的霧化器(通常可以得到的SPAN值低於1.5，例如在0.9-1.3之間)，所述的霧化器其特徵是包含噴霧部分和表面部分，表面部分包括至少一個孔洞。在一個優選實施方案中，Rayleigh霧化器是旋轉霧化裝置，在其中將液體分散到旋轉的有孔洞的空圓柱體的內表面，從而將液體霧化，液體從孔洞穿過圓柱體，形成液滴。WO94/21383的權利要求9-30和


圖1-18記載了此霧化器，權利要求1-8記載了霧化的方法，將所有的內容引入本文作為參考。
發明詳述微生物使之發酵產生含有酶和生物質的發酵肉湯的微生物細胞或微生物體可以是任何適於發酵的微生物。
微生物包括單細胞微生物，例如原核生物，或非單細胞微生物，例如真核生物。
有用的單細胞類的細胞是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌，包括擔不局限於芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞，例如，Bacillus alkalophilus，解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)；或鏈黴菌屬(Streptomyces)細胞，如淺青紫鏈黴菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)；或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌或假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌。在一優選實施方案中，細菌類的微生物是遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、Bacillus clausii、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞。在另一優選實施方案中，芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞是一種嗜鹼性芽孢桿菌細胞。
微生物也可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。在另一優選實施方案中，微生物是真菌細胞。此處用「真菌」包括phylaAscomycota，Basidiomycota，Chytridiomycota和Zygomycota(其定義見Hawksworth等，Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cabridge，UK)以及Oomycota(見Hawksworth等，1995，同上，第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，見上)。
在一個更優選的實施方案中，該真菌微生物是酵母細胞。這裡所用「酵母」包括產子囊酵母(內孢黴目(Endomycetales))、產擔孢子(basidiosporogenous)酵母和屬於半知菌類(Fungi Imperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。因為酵母的分類將來可能改變，為了本發明的目的，酵母應按《酵母的生物學和活性》(Biology andActivities of Yeast)(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.編著，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中的描述來定義。
在一個甚至更優選的實施方案中，該酵母微生物是假絲酵母屬(candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia細胞。
在一個最優選實施方案中，該酵母微生物是卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergernsis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、糖化酵母(S.diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母(S.kluyveri)、諾地酵母(S.norbensis)或Saccharomyces oviformis細胞。在另一個最優選的實施方案中，該酵母微生物是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細胞。在另一個最優選的實施方案中，該酵母微生物是Yarrowia lipolytica細胞。
在另一個更優選的實施方案中，該真菌微生物是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門(Eumycota)和Oomycota的所有絲狀類型(正如Hawksworth等，1995，見上，所定義的)。絲狀真菌的特徵在於由幾丁質、纖維素、葡聚糖、脫乙醯殼多糖、甘露聚糖和其它複合多糖構成的菌絲體壁。營養生長是通過菌絲延長來進行的，碳代謝為專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養生長是通過單細胞菌體的出芽來進行的，而且碳代謝可以通過發酵進行。
在一個甚至更優選的實施方案中，該絲狀真菌微生物是但不限於支頂孢(Acremonium)、麴黴屬(Aspergillus)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質黴屬(Humicola)、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木黴屬(Trichoderma)的種的細胞。
在一個最優選的實施方案中，該絲狀真菌微生物是泡盛麴黴(Aspergillus awamori)、臭麴黴(A.foetidus)、日本麴黴(A.japonicus)、構巢麴黴(A.nidulans)、黑麴黴(A.niger)或米麴黴(A.oryzae)細胞。在另一個最優選的實施方案中，該絲狀真菌微生物是杆孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(F.culmorum)、禾本科鐮孢(F.graminearum)、禾赤鐮孢(F.graminum)、異孢鐮孢(F.heterosporum)、合歡木鐮孢(F.negundi)、尖鐮孢(F.oxysporum)、多枝鐮孢(F.reticulatum)、粉紅鐮孢(F.roseum)、接骨木鐮孢(F.sambucinum)、膚色鐮孢(F.sarcochrom)、擬分枝孢鐮孢(F.sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum細胞。
在另一個最優選的實施方案中，該絲狀真菌微生物是Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、米黑毛黴(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產紫青黴(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康寧木黴(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木黴(Trichodermaviride)細胞。
本發明也包含上述微生物的變種，其是用常規的基因操作方法通過改變所述微生物遺傳物質而獲得的，這樣將編碼酶的外來核苷酸序列插入到所述微生物中。
酶本申請上下文使用的酶可以是能夠通過發酵得到的任何酶或不同酶的組合。相應地，當提到「酶」時，通常應理解為包括單一的酶和一種以上的酶的組合。
應理解的是術語「酶」包括酶的變體(例如用重組技術製備的)。這些酶的變體的例子記載於以下文獻中例如EP251,446(Genencor)，WO91/00345(Novo Nordisk)，EP525,610(Solvay)和WO94/02618(Gist-Brocades NV)。本說明書和權利要求書中使用的酶的分類法與學術出版公司1992年出版的《生物化學和分子生物學國際聯合會命名委員會的建議(1992)》一致(Recommendations(1992)of theNomenclature Committee of the International Union of Biochemistryand Molecular Biology，Academic Press，Inc.，1992)。
相應地，適用於本發明的酶產品中的酶的種類包括氧化還原酶(EC1.-.-.-)、轉移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂解酶(EC4.-.-.-)、異構酶(EC 5.-.-.-)和連接酶(EC 6.-.-.-)。
本申請上下文中的優選的氧化還原酶是過氧化物酶(EC 1.11.1)，例如haloperoxidase、漆酶(EC 1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)，而優選的轉移酶是以下任何亞類中的轉移酶a)轉移一碳基團的轉移酶(EC 2.1)；b)轉移醛或酮殘基的轉移酶(EC 2.2)；醯基轉移酶(EC 2.3)；c)糖基轉移酶(EC 2.4)；d)轉移烷基或芳香基而不包括非甲基的轉移酶，(EC 2.5)；和e)轉移含氮基團的轉移酶(EC 2.6)。
本發明的最優選類型的轉移酶是轉穀氨醯胺酶(蛋白質-谷醯胺γ-穀氨醯轉移酶；EC 2.3.2.13)。
適當的轉穀氨醯胺酶的進一步的例子記載於WO96/06931(NovoNordisk A/S)。
本發明的優選的水解酶是羧基酯水解酶(EC 3.1.1.-)例如脂肪酶(EC 3.1.1.3)；植酸酶(EC 3.1.3.-)，例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)；糖苷酶(EC 3.2，它歸為本文稱為「糖酶」的組的範圍中)，例如α澱粉酶(EC 3.2.1.1)；肽酶(EC 3.4，也稱為蛋白酶)；和其他的羰基水解酶。
在本文中，用術語「糖酶」不僅表示能使尤其是五元環和六元環結構的碳水化合物鏈(例如澱粉)斷開的酶(即糖苷酶，EC 3.2)，也包括能使糖產生異構的酶，例如，六元環結構如D-葡萄糖轉化成五元環結構如D-果糖。
相關的糖酶包括以下各種(EC號在括號內)α-澱粉酶(3.2.1.1)、β-澱粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纖維素酶(3.2.1.4)、內切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、內切-1，4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、殼多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、澱粉-1，6-葡萄糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1，4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖內切-1，3-β-D-葡萄糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精內切-1，6-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡萄糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖內切-1，3-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1，4-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖內切-1，6-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖內切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶(arabinosidases)(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、脫乙醯殼多糖酶(chitosanases)(3.2.1.132)和木糖異構酶(5.3.1.5)。
市售可獲得的氧化還原酶(EC 1.-.-.-)的例子包括GluzymeTM(可以從Novo Nordisk A/S得到的酶)。
市售可獲得的蛋白酶(肽酶)包括KannaseTM、EverlaseTM、EsperaseTM、AlcalaseTM、NeutraseTM、DurazymTM、SavinaseTM、PyraseTM、PancreaticTrypsin NOVO(PTN)、Bio-FeedTMPro和Clear-LensTMPro(所有都可以從Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark獲得)。
其他商業可獲得的蛋白酶包括MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、OpticleanTM和PurafectTM(能夠從Genencor International公司或Gist-Brocades得到)。
市售可獲得的脂酶的例子包括LipoprimeTM、LipolaseTM、LipolaseTMUltra、LipozymeTM、PalataseTM、NovozymTM435和LecitaseTM(所有都可以從Novo NordiskA/S得到)。其他市售可獲得的脂酶包括LumafastTM(從Genencor International Inc.獲得的門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)脂酶)；LipomaxTM(從Gist Brocades/Genencor Int.Inc.獲得的類產鹼假單胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)脂酶；和從Solvay enzymes得到的芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)脂酶)。
市售可獲得的糖酶的例子包括Alpha-GalTM、Bio-FeedTMAlpha、Bio-FeedTMBeta、Bio FeedTMPlus、Bio-FeedTMPlus、NovozymeTM188、CelluclastTM、CellusoftTM、CeremylTM、CitrozymTM、DenimaxTM、DezymeTM、DextrozymeTM、FinizymTM、FungamylTM、GamanaseTM、GlucanexTM、LactozymTM、MaltogenaseTM、PentopanTM、PectinexTM、PromozymeTM、PulpzymeTM、NovamylTM、TermamylTM、AMGTM(Amyloglucosidase Novo)、MaltogenaseTM、SweetzymeTM和AquazymTM(所有都可以從Novo Nordisk A/S得到)。
可以通過在同一發酵肉湯中同時發酵2種或多種酶並在本發明的方法中使用此液體或其加工過的液體作為原料而得到酶的組合。或者可以通過分別發酵各種酶並使用不同發酵肉湯和/或其加工過的液體的混合物作為本發明方法的原料，得到酶的組合。
發酵肉湯和含有酶的液體本發明所述方法根據該方法的步驟採用發酵肉湯或含有酶的液體作為原料。
如上所述，本發明的第一方面，原料是發酵肉湯並且此方法包括將所述的發酵肉湯噴霧乾燥的步驟。依照本發明，此處定義的發酵肉湯含有微生物細胞和/或其細胞碎片(生物質)。可以在噴霧乾燥前除去一些生物質以優化肉湯的性質和對噴霧乾燥的適應性，例如調整粘稠度。然而，除去的生物質越多，方法將越昂貴。相應地，在一個優選實施方案中，發酵肉湯含有至少10％生物質，更優選至少50％，甚至更優選至少75％，最優選至少90％或至少95％從發酵得到的生物質。在另一優選實施方案中，肉湯含有0-31％w/w的乾物質，優選0-20％w/w，更優選0-15％w/w，例如10-15％w/w乾物質，而此範圍應排除0％乾物質。生物質可以構成不超過90％w/w的乾物質，優選不超過75％w/w，更優選不超過50％w/w乾物質，而酶可以構成不超過50％w/w的乾物質，優選不超過25％w/w，更優選不超過10％w/w乾物質。
在本發明第一方面的另一優選實施方案中，噴霧乾燥前除去發酵肉湯原料中的粗顆粒或物體如稻草、碎石、大豆碎粒和其它不能溶解的非生物質。這些粗顆粒或物體可以來源於添加物，例如發酵中加入的營養物。可以通過過濾、沉降、離心和/或傾析肉湯而除去粗顆粒或物體。此過程稱為除渣。
在本發明的第二方面，原料是含有酶的液體，此方法包括將所述的含有酶的液體噴霧乾燥以得到第一乾燥的含酶顆粒，隨後使此第一乾燥顆粒經過第二加工步驟得到第二乾燥的含酶顆粒。
將要根據本發明的第二方面進行乾燥的原料，優選為水性液體，例如一或多種酶的水性溶液或分散體。
在本發明的第二方面的一個優選實施方案中，原料是發酵肉湯，或已經過一或多個加工步驟的發酵肉湯，例如上述定義的發酵濾液或所酶濃縮物。
可以用已知方法，例如過濾、離心、絮凝和這些方法的結合從發酵肉湯中除去生物質得到發酵濾液。
可以加工發酵濾液得到酶濃縮物。此加工包括蒸發溶劑(如水)、超濾以降低水和低分子組分的含量，將發酵濾液中的酶提取到第二溶液中。也可以通過柱層析進行純化，例如將發酵濾液泵過一個含有樹脂的柱，使酶以比濾液中的水、鹽或其他組分慢或快的速度通過。
在本發明的第一和第二方面，噴霧乾燥前，在本發明的原料中可以加入改善由此得到的含酶的乾燥粉末或產品的性質的材料。有用的添加劑包括選自鹽、無機礦物質或粘土、碳水化物、著色劑、纖維素或其衍生物、殺蟲劑、分散劑、防泡劑、粘度調節劑、酸性試劑、鹼性試劑、酶穩定劑、酶抑制劑、粘合劑、其他的酶及其組合的材料。加入無機鹽如鹼和鹼土的氯化物鹽、硫酸鹽、硝酸鹽和碳酸鹽，例如鈣鹽，可以活化酶。可以用其他鹽，尤其是硫酸鈉或氯化鈉作為填充材料。可以加入碳水化合物，如蔗糖和/或澱粉，增加顆粒的強度和改善酶的穩定性。加入著色劑如二氧化鈦可以為肉湯和最終微粒狀的酶產品提供所需的顏色。加入纖維素可以為酶顆粒提供強度和彈性。加入穩定劑如甲硫氨酸或硫代硫酸鹽可以保護酶，因而所得酶產品在本發明的加工和儲存過程中不會失活。加入無機物和粘土，如沸石、高嶺土、膨潤土、滑石和/或矽酸鹽可以為乾燥的酶顆粒和形成的顆粒劑提供增加的緊密度。加入抑制劑，如硼酸蛋白酶抑制劑，可以降低酶的蛋白酶消化作用或自身消化作用而提高產量。加入殺蟲劑，如Rodalon能控制微生物穩定性並可以減少最終產品的不良氣味。加入酸或鹼可以將pH控制在所需的水平。
在本發明的第一方面和第二方面，在噴霧乾燥前，原料也可以經過物理處理，如加熱和/或冷卻和/或輻射肉湯及混合、通氣或超聲處理。
在本發明的一個重要的實施方案中，在噴霧乾燥前，優選處理原料以殺死活的微生物細胞或處理原料使肉湯或液體中剩餘的遺傳物質如DNA(基因或質體)或其他多核苷酸水解或分解。
在本發明的第一方面，可以加入殺蟲劑如Rodalon(氯化苯甲烴銨)、加熱(巴氏滅菌法)或輻射以使肉湯消毒。在本發明的第二方面，對發酵濾液或酶濃縮物肉湯消毒，可以採用處理肉湯的同樣的方法，或也可以通過除菌過濾達到。在所有情況下，可以用已知方法，如多核苷酸的酶消化達到遺傳物質的分解。
對於許多應用，有用的含有酶的顆粒需要顆粒含有某一最小量的活性酶。相應地，在一優選實施方案中，原料應含有某一最小的液體中的酶濃度和/或酶應構成液體中固體(即，不揮發組分)的某一最小百分比，以通過本發明的方法產生有有用酶濃度的顆粒。我們意外地發現能提供直接產生有足夠高的酶含量的發酵肉湯的發酵作用，以致可以直接將肉湯乾燥，或通過除去生物質、滅菌及加入添加劑，僅最小程度進行精製得到酶含量足夠高的乾燥粉末，從而得到在大多數應用中有用的酶產品。進行任何進一步的精製過程前，本發明的發酵肉湯或發酵濾液中優選的酶含量為至少每升發酵肉湯液相中有3mg活性酶蛋白，更優選至少20mg/L，更優選至少50mg/L，最優選至少75mg/L，例如80mg/L或更多。
用於本發明方法的原料還應具有適於泵送液體的粘度，優選在5-5000cps範圍。
乾燥方法本發明通過噴霧乾燥方法乾燥肉湯、濾液或濃縮物，該方法包括將肉湯、濾液或濃縮物通過霧化裝置傳送到乾燥室中，其中霧化肉湯、濾液或濃縮物的液滴與空氣氣流混合，蒸發並除去液滴的揮發性部分，剩下乾燥的含有酶的顆粒。
在本發明的一個優選實施方案中，通過一個泵送裝置輸送肉湯、濾液或濃縮物，並優選預熱至5-150℃，優選50-120℃，更優選90-110℃。
霧化裝置可以適當地選自高速轉盤式霧化器(high speed rotatingdisk atomizers)、壓力噴嘴霧化器(pressure nozzle atomizers)、氣動噴嘴霧化器(pneumatic nozzle atomizers)或聲波噴嘴霧化器(sonicnozzle atomizers)，如1990年5月9日至11日由職業進步中心(Centerfor professional advancement)在阿姆斯特丹進行的微囊化專題討論會會議材料(Course Material from the Microencapsulation Seminar)所提及的。
然而，能用其提供優等乾燥的含酶顆粒的一種優選的特殊霧化器是Rayleigh霧化器，用它可得到顆粒的改進的性質，例如得到增強的機械強度、低起塵性(lower dusting)、窄的顆粒大小分布，即低的SPAN值和改良的球形體積。WO94/21383記載了一種這樣的霧化器，將該文獻合併於此作為參考。
噴霧乾燥粉末通常具有10-15％重量的水含量，優選進一步乾燥到更低的水含量，例如低於約5％w/w，其方法是通過將噴霧乾燥顆粒輸送到流化床乾燥設備中，在其中由向上的氣流使噴霧乾燥顆粒保持流體化蒸發除去其中過量的水分，此氣流優選加熱並乾燥的空氣。
所得的噴霧乾燥的固體含酶顆粒的性質取決於噴霧乾燥條件和加入原料中的添加劑。在一些噴霧乾燥方法中，在乾燥步驟開始形成非常小的顆粒，隨後在噴霧乾燥結束時聚結或粘合在一起形成大的有些易碎的團塊。這些聚結成塊的顆粒優選有150-2000μm的平均直徑或大小。在其他噴霧乾燥方法中，例如使用WO94/21383的霧化設備，會由於霧化器的特別的設計製備出更小的不聚結的更均勻的顆粒。這些顆粒一般有更好的起塵、強度和SPAN性質且平均大小優選落在50-300μm的範圍內，更優選在100-200μm範圍內。
優選的噴霧乾燥方法產生窄的大小分布，即窄的SPAN值。優選地，SPAN值低於約2.5，更優選低於約2.0，更優選低於約1.5，最優選低於約1.0。
乾燥顆粒的加工本發明第二方面的(上述)方法需要第一噴霧乾燥顆粒隨後經過選自製粒、包衣及其組合的工藝得到第二乾燥的含酶顆粒。制粒工藝包括混合制粒、造粒、擠出、流化床和壓緊工藝。
然而本發明也包括這樣的方法，其中由噴霧乾燥發酵肉湯得到的顆粒隨後經過選自製粒、包衣及其組合的工藝。
此進一步的加工改進含酶顆粒的性質。
混合制粒混合制粒(mixer granulation)工藝包括將噴霧乾燥的含有酶的顆粒與水及選自粘合劑、纖維、鹽、水不溶性礦物質、色素、酶穩定劑或其組合的組分混合。加入足量的水使固體組分聚結成有所需的平均大小的顆粒。
粘合劑包括有高熔點或無熔點和具有非蠟性質的粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、糊精、聚乙烯醇、纖維素衍生物，例如羥丙基纖維素、甲基纖維素或CMC。一種適宜的粘合劑是碳水化合物類粘合劑，如能從法國Roquette Freres得到的Glucidex 21D。
纖維包括纖維形式的純和/或不純的纖維素，例如鋸屑、純纖維性纖維素、棉或其他形式的純或不純的纖維性纖維素。也可以使用以纖維性纖維素為基質的助濾劑。市場上有一些纖維形式的纖維素的商標例如CEPO和ARBOCELL。在一個Svenska Tramjolsfabrikerna AB的出版物「Cepo纖維素粉末」中，對於Cepo S/20纖維素，聲稱大致最大纖維長度是500μm，大致平均纖維長度是160μm，大致最大纖維寬度是50μm，大致平均纖維寬度是30μm。它還聲稱CEPO SS/200纖維素的大致最大纖維長度150μm，大致平均纖維長度50μm，大致最大纖維寬度45μm，大致平均纖維寬度25μm。有這些尺寸的纖維素纖維非常適於本發明的目的。詞「Cepo」和「Arbocel」是商標。優選的纖維性纖維素是ArbocelTMBFC200。也可以使用EP304331B1記載的合成纖維，典型的纖維可以用聚乙烯、聚丙烯、聚酯，尤其是尼龍、聚甲酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸化合物製成。
鹽包括水溶性和/或不溶性鹽，例如鹼金屬和/或鹼土金屬的硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。
水不溶性礦物質包括沸石、粘土如高嶺土和膨潤土、滑石和/或矽酸鹽。
色素包括二氧化鈦。
酶穩定劑包括鹼性或中性材料、還原劑、抗氧化劑和/或第一過渡系列金屬離子的鹽。它們各自可以與其它同類或不同類的保護劑聯合使用。鹼性穩定劑的例子是通過活躍地中和例如氧化劑提供化學清除效果的鹼金屬矽酸鹽、碳酸鹽或碳酸氫鹽。還原性保護劑的例子是亞硫酸鹽、硫代亞硫酸鹽或硫代硫酸鹽，抗氧化劑的例子是甲硫氨酸、丁基化羥基甲苯(BHT)或丁基化羥基苯甲醚(BHA)。最優選的穩定劑是硫代硫酸鹽，例如硫代硫酸鈉。本領域技術人員可以從例如US4,106,991(NOVO NORDISK)和相關的文獻EP170360B1(NOVO NORDISK)、EP304332B1(NOVONORDISK)、EP304331(NOVO NORDISK)、WO90/09440(NOVO NORDISK)和WO90/09428(NOVO NORDISK)得知混合制粒方法，在這些文獻中，向噴霧乾燥的含酶顆粒加入水代替了加入本發明的液體酶濃縮物。混合制粒過程也包括US4,661,452記載的所謂「球形造粒」(marumerizer)法，將該文獻合併於此作為參考。
在一個優選實施方案中，將要在混合制粒法處理的含酶的混合物也可以含有微粒組分，其直徑小於最終顆粒的直徑。通過在該工藝中加入這樣的微粒組分，會更易於控制大小和/或大小分布，如丹麥專利申請PA1999 01000(在本申請的申請日未公開)所述，將其結合於此作為參考。微粒組分可以是由可以保持微粒完整性(即在混合制粒過程中不碎裂)的無機或有機原料製成的團塊。無機微粒組分可以是例如聚結的二氧化矽和/或鹽。有機微粒複合物可以是天然化合物如聚結的碳水化合物，例如糖、澱粉糊精或可以是聚結的人造化合物或聚合物。然而優選的微粒複合物是植物粉。在本發明的範圍內，術語「植物粉」包括所有天然來源的(粉的來源)固體植物原料通過減小大小(研磨)而獲得的粉狀的產品。本發明的方法使用研磨穀粒、豆類和/或錦葵科(Malvaceae)果實(如棉籽)得到的植物粉末是方便的。本發明的範圍內可以作為粉末來源的穀類尤其是小麥或黑麥，還可以使用大麥、燕麥、稻和玉米及高粱和其他類的粟。雖然蕎麥不是一種穀類(是一種軟花屬植物)，但其山毛櫸果實樣產生粉末的部分也可以同樣作為本發明範圍內的粉末來源。在本發明的一種特定的變化中，豆類可以作為粉末的來源。此處豆類應理解為屬於果實和蔬菜的植物類食物來源(豆類)。豆類如豌豆屬(豌豆)、木豆屬(Cajamus)(木豆)，鷹嘴豆屬(鷹嘴豆)、兵豆屬(兵豆)、菜豆屬(草豆)、豇豆屬(豇豆)、Dolchius(lablab bean)、Cassavalia(刀豆)、野豌豆屬(蠶豆或野豌豆)、Peluschken(紫花豌豆(maple pea))、落花生屬(花生)、羽扇豆屬、苜蓿、大豆及利馬豆的果實，和如果適用，其他豆類和其他錦葵科果實(例如棉屬的果實，棉)、馬鈴薯或山藥作為粉末的來源，也在本發明的範圍內。尤其優選的是豌豆特別是大豆。本發明的微粒複合物也可以是上述粉末和/或團塊的組合。優選的微粒複合物是小麥製成的粉末，如商業可獲得的產品Farigel(Farigel de Ble F1100，WestHove，法國)。本發明的植物粉優選經過蒸汽處理，如用溫度約100℃-約110℃的乾燥過熱蒸汽在接近常壓至低過壓(例如0.8-1.2巴的過壓)經過高達約1小時的處理時間(在下述過熱蒸汽處理裝置中的駐留時間)處理。乾燥過熱蒸汽是過熱的不飽和蒸汽，可以用常規方法過熱和除去可能的水凝物或從高壓膨脹蒸汽而獲得。本發明的微粒組分的特點是在研磨植物來源的粉末後經過蒸汽處理，即對準備用於混合制粒過程的製備好的微粒組分進行處理。用蒸汽處理的微粒組分的優點是會降低微粒組分中可能會引起產品中微生物生長的細菌或真菌的數量，但更重要的是微粒組分將完全或部分膠凝化。膠凝化提高顆粒的完整性使其不會在制粒過程中碎裂、溶解或分散，而保持其微粒特性。
微粒組分的優選的平均顆粒大小至少為40μm，更優選至少60μm，例如至少80μm，例如至少100μm。一些有用的微粒組分可以更大，有至少140μm或至少200μm的平均顆粒大小。
混合裝置可以是批式混合器或連續混合器，例如對流式混合器[見，例如Harnby等，工業過程中的混合，pp.39-53(ISBN 0-408-115742)]。也可以使用非對流式混合裝置，如轉鼓式混合器或所謂的造粒鍋(pan-granulators)。
造粒工藝在造粒工藝(prilling process)中，噴霧乾燥的酶顆粒懸浮在熔融的蠟中，懸浮液噴霧冷卻，例如通過霧化裝置，進入冷卻室，含有酶顆粒的蠟的液滴在其中固化。可以從Michael S.Showell(編輯)；《粉末狀去汙劑》(powdered detergents)；表面活性劑科學叢書(SurfactantScience Series)；1998；71卷；140-142頁；Marcel Dekker和DK-PA 199901358得知此工藝，將二者引入本文作為參考。造粒工藝使用的霧化器適當地與上述噴霧乾燥過程記載的相同，優選Rayleigh霧化器。
可以製成有所需的平均大小和統一的密度的造粒顆粒，進一步將酶保護在蠟基質中。此處使用的術語「蠟」，應理解為熔點在25-150℃範圍內的化合物。優選的蠟是熔點在所述範圍內的有機物或有機化合物的鹽或其混合物。使用不同蠟的混合物時，可選地與重/或輕的固體聯合，可以得到有所需真密度的酶顆粒。並且，蠟或蠟的混合物的一個重要的特點是蠟(優選在鹼性或中性溶液中)應是水溶性或水可分散的，因而酶顆粒的蠟基質可以分散和/或溶解在水性溶液中。水溶性蠟的例子是聚乙二醇(PEG’s)。相應地，在水溶性蠟當中，蠟在水中的溶解度應優選高達75份蠟/25份水，例如對於PEG1000。在水不溶性蠟中，可分散在水性溶液中的是甘油三酯和油類。另外，一種有用的蠟不溶解或分散在基本非水性的液相中。本文使用的術語「基本非水性」可以定義為液相含有少量(例如低於5％w/w或低於3％w/w)水或無水(非水性)。蠟也應與酶相容，即它不應使酶失活，例如通過與酶反應或永久性地改變結構，例如摺疊、螺旋部分、片層部分、輔基和此類對酶保持活性必需的結構。另外，蠟應與酶混合，即酶可以溶解在(熔融的)蠟中和/或酶可以以無定形的或結晶形的酶蛋白顆粒的形式分散在(熔融的)蠟中。適宜的蠟是在室溫(25℃)為固態的蠟，因此有高於此溫度的熔點或熔融範圍(聚合物蠟趨向於在一個溫度範圍內熔融)。優選的蠟有在約35℃-約120℃範圍內的熔點或熔融範圍。低限優選在蠟熔融的溫度至含有酶顆粒的液體去汙劑通常儲存的溫度(20-30℃)之間設一合理的距離。並且，在酶顆粒的製備中當蠟的熔點低於35℃時預期有困難。溫度高限設在通常適用於酶而不引起酶活性由於加熱變性顯著喪失的最高溫度。更優選的熔點或範圍在約40℃-約100℃，例如在約50℃-約80℃。在另一優選的實施方案中，蠟的分子量在約150道爾頓-10,000道爾頓。蠟可以是化學合成的或它同樣可以是從天然來源分離出的蠟或其衍生物。相應地，本發明的蠟優選選自以下蠟的非限定性的列表。
-聚乙二醇，縮寫為PEG，蠟類。商業可獲得的不同的PEG蠟有不同的分子大小，其中有低分子大小的PEG，也有最低的熔點。適宜的PEG類蠟的例子是PEG1500、PEG3000、PEG4000、PEG6000、PEG9000，例如從德國BASF公司獲得的。為滿足對於蠟和/或酶顆粒真密度和熔點所需的性質，也考慮到有低熔點的蠟與有高熔點的蠟的混合物是本發明非常有用的實施方案。
-聚丙烯或聚乙烯或其混合物。
-在室溫為固體的非離子表面活性劑，例如有高水平乙氧基基團的乙氧基化脂肪醇，例如BASF的Lutensol AT80，每分子有80單位環氧乙烷。或者環氧乙烷、環氧丙烷的聚合物或其共聚物是有用的，例如嵌段共聚物，如德國BASF的Pluronic PE6800。
-從天然來源分離出的蠟，例如巴西棕櫚蠟(熔點在80-88℃之間)，小燭樹蠟(熔點在68-70℃之間)和蜂蠟。其他天然來源的蠟或其衍生物是從動物或植物衍生得到的蠟，例如來源於海洋的。這樣的蠟的例子是氫化牛脂、氫化棕櫚油、氫化棉籽油和/或氫化大豆油，其中此處使用的術語「氫化」應解釋為使不飽和碳水化物鏈飽和，例如在甘油三酯中，其中C＝C雙鍵轉化成C-C單鍵。氫化棕櫚油的一個例子是商業可獲得的，例如從Hobum Oele und Fette GmbH-Germany或Deutche Cargill GmbH-Germany得到的。
-脂肪酸醇，例如從Condea Chemie GMBH-Germany得到的線形長鏈脂肪酸醇NAFOL 1822(C18，20，22)，有處於55-60℃之間的熔點和約0.96g/cm3的真密度。
-單酸甘油酯和/或二酸甘油酯是有用的蠟，例如硬脂酸甘油酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕櫚酸的混合物。一個這樣的例子是得自於丹麥Danisco Ingredients的Dimodan PM，它有約1g/cm3的熔點。
-脂肪酸，例如氫化線性長鏈脂肪酸。
-石蠟，即固態烴。
-微晶蠟。
在另外的實施方案中，可以在C.M.McTaggart等，Int.J.Pharm.19，139(1984)或Flanders等，Drug Dev.Ind.Pharm.13，1001(1987)找到在本發明中有用的蠟，將二者合併於此作為參考。
擠出工藝在擠出(extrusion)或制丸(pelletizing)工藝中，單獨或與添加劑如混合制粒工藝所述的添加劑混合向噴霧乾燥的含酶顆粒加入水分，產生一種含酶的糊狀物。然後擠壓此糊狀物成丸或在壓力下通過小孔擠出並切成大顆粒，隨後乾燥。從Michael S.Showell(編輯)；《粉末狀去汙劑》；表面活性劑科學叢書(Surfactant Science Series)；1998；71卷；140-142頁；Marcel Dekker和US4,661,452可以得知擠壓過程，將二者合併於此作為參考。
流化床工藝本發明上下文的流化床工藝包括使噴霧乾燥的含酶顆粒在流化床中流體化，並將含有粘合劑的溶液噴霧到流體化的粉末上，以使含有酶的粉末顆粒結合形成更大更硬的顆粒。
噴霧乾燥的含酶顆粒不大適於製備分層顆粒的方法，該方法此處定義為這樣的方法，其中酶作為包圍惰性微粒核材料的一層而使用，例如在一流化床設備中，將惰性核流體化，在核上噴霧含有酶的溶液而加上酶層。此方法需要乾燥的含酶粉末再溶解或再懸浮在液體中以將含酶層包圍在惰性核周圍，因而引入一個比上述方法更耗能的步驟。相應地，在一優選實施方案中，乾燥的含酶顆粒的隨後步驟不是分層的過程。
包衣工藝由此得到的噴霧乾燥的顆粒或粒劑可以優選用一或多個包衣層包衣，以為顆粒提供進一步改良的性質。可以適當地使用本領域已知的包衣層和方法，例如WO89/08694、WO89/08695、270 608 B1和/或WO00/01793記載的包衣層。可以從US4,106,991、EP170360、EP304332、EP304331、EP458849、EP458845、WO97/39116、WO92/12645A、WO89/08695、WO89/08694、WO87/07292、WO91/06638、WO92/13030、WO93/07260、WO93/07263、WO96/38527、WO96/16151、WO97/23606、US5,324,649、US4,689,297、EP206417、EP193829、DE4344215、DE4322229 A、DD263790、JP61162185A和/或JP58179492找到常規包衣材料的其他例子。
包衣可以包含選自上述混合制粒部分記載的粘合劑、纖維、鹽、水不溶性無機物、色素、酶穩定劑或這些物質的組合的材料。
在一個特別的實施方案中，包衣含有較少數量的能與從周圍介質進入顆粒或粒劑中而使酶失活(對酶有害)的組分反應的保護劑，即在此組分與酶接觸並使酶失活之前與其反應。此保護劑可以例如能中和、還原此對酶有害的組分或以其它方式與此組分反應。能使酶失活的典型的組分是氧化劑例如過硼酸鹽、過碳酸鹽、有機過酸及類似物。
保護劑可以分為幾類鹼性或中性材料、還原劑、抗氧化劑和/或第一過渡系列金屬離子的鹽。它們各自可以與其它同類或不同類的保護劑聯合使用。鹼性保護劑的例子是通過活躍地中和例如氧化劑提供化學清除效果的鹼金屬矽酸鹽、碳酸鹽或碳酸氫鹽。還原性保護劑的例子是亞硫酸鹽、硫代亞硫酸鹽或硫代硫酸鹽，抗氧化劑的例子是甲硫氨酸、丁基化羥基甲苯(BHT)或丁基化羥基苯甲醚(BHA)。最優選的保護劑是硫代硫酸鹽，例如硫代硫酸鈉。包衣中保護劑的數量可以是包衣的5-40％w/w，優選5-30％，例如10-20％。
包衣層應形成基本連續的均質層而將含有酶的顆粒或粒劑包裹起來。
包衣層可以根據所需的用途在顆粒或粒劑中發揮任何一項功能。例如，包衣層可以達到一或多種以下功能(i)進一步降低酶顆粒或粒劑的起塵趨勢；(ii)進一步保護酶顆粒或粒劑中的酶不被漂白物質/系統氧化(例如過硼酸鹽、過碳酸鹽、有機過酸及類似物)；(iii)顆粒/粒劑進入液體介質(例如水性介質)時能以理想的速率溶解；(iv)為酶顆粒/粒劑提供更好的物理強度。
包衣層可以還含有一或多種以下物質抗氧化劑、氯清除劑、增塑劑、色素、潤滑劑(例如表面活性劑或抗靜電劑)、另外的酶和芬芳劑。
在本發明的上下文中用於包衣層的增塑劑包括例如多元醇，例如糖、糖醇或分子量小於1000的聚乙二醇(PEGs)；尿素，鄰苯二甲酸酯例如鄰苯二甲酸二丁基或二甲基酯；和水。
適宜的色素包括但不限於精細分散的增白劑，例如二氧化鈦或高嶺土，著色的色素，水溶性著色劑，及一或多種色素和水溶性著色劑的組合。
用於本文中時，術語「潤滑劑」指任何降低表面摩擦力、使顆粒表面潤滑、減少形成靜電的趨勢和/或降低顆粒脆碎性的添加劑。潤滑劑通過降低包衣層中粘合劑的粘結性，在促進包衣過程方面也可以起到相關作用。因此潤滑劑可以作為抗聚結劑和潤溼劑。
適宜的潤滑劑的例子是聚乙二醇(PEGs)和乙氧基化脂肪醇。
在本發明的一個優選實施方案中，本發明噴霧乾燥的顆粒或隨後加工的粒劑用有高恆定溼度的保護性包衣層包衣，例如在本申請的申請日未公開的丹麥專利申請WO00/01793的5-9頁和所給實施例中記載的，將其合併於此作為參考。
粉碎/研磨和篩選能夠理解的是上述方法可以在任何階段適當地補充以粉碎/研磨和/或篩選過程。例如在隨後的加工步驟之前將噴霧乾燥的含酶顆粒研磨，及篩分最終的產品以得到所需大小的部分將是理想的。
含有酶和生物質的顆粒本發明包括含有酶和生物質的顆粒，例如由本發明的第二方面獲得的顆粒，即從選自噴霧乾燥發酵肉湯、將噴霧乾燥的發酵肉湯制粒、將噴霧乾燥的發酵肉湯包衣及將噴霧乾燥的發酵肉湯制粒和包衣的工藝得到的顆粒。
應用本發明的顆粒用於廣泛的組合物和應用領域。有用的組合物的例子是清潔組合物、紡織品加工組合物、皮革加工組合物、紙漿或紙加工組合物、食品和飲料組合物、動物飼料組合物和個人護理(personal care)組合物。清潔組合物包括例如去汙劑和抗微生物組合物。紡織品加工組合物包括用於紡織品例如牛仔布的酶漂白和/或砂洗(stone washing)的組合物。食品和飲料組合物包括用於酒、油和脂肪、柑橘和果汁產品、澱粉和糖製品、酒和/或釀造產品、豆製品和烘焙麵粉或麵團等製造業的酶組合物。
相應地，本發明包括含有顆粒的組合物，顆粒是優選從選自發酵肉湯噴霧乾燥、將噴霧乾燥的發酵肉湯制粒、將噴霧乾燥的發酵肉湯包衣和將噴霧乾燥的發酵肉湯制粒和包衣的工藝得到的含酶和生物質的顆粒。
本發明也包括含有酶和生物質的顆粒和含有這些顆粒的組合物的用途。尤其是用於處理紡織品、皮革、紙漿、紙、食品、飲料、硬表面和人或動物體的用途。含有酶和生物質的顆粒和含有這些顆粒的組合物也可以用於製造治療人體或動物的藥品。
去汙劑組合物一種優選的組合物是去汙劑組合物，其中含有表面活性劑和從噴霧乾燥發酵肉湯得到的含酶及生物質的顆粒或從這些噴霧乾燥顆粒得到的粒劑。
例如，可以將本發明的去汙劑組合物配成手洗或機洗去汙劑組合物，其中包括適用於汙染纖維預處理的去汙添加劑成分和添加了織物軟化劑的漂洗成分，或配製成用於一般家庭硬表面清潔操作的去汙劑組合物，或配製成用於餐具的手洗或機洗操作的去汙劑組合物。
在一個具體方面，本發明提供含有本發明含酶和生物質的噴霧乾燥顆粒或粒劑的去汙添加劑。該去汙添加劑以及該去汙劑組合物可以含有一或多種其它酶例如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或過氧化物酶。
通常，所選酶的性質應與所選的去汙劑相適應，(即最適pH、與其它的酶和非酶成分的兼容性，等等)，並且該一種或多種酶應當以有效的量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的蛋白酶。優選微生物來源的蛋白酶。化學修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內。該蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選微生物的鹼性蛋白酶，或胰蛋白酶樣蛋白酶。鹼性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶；尤其是來自芽胞桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述於WO89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的胰蛋白酶)和描述於WO89/06270和WO94/25583中的鐮孢屬蛋白酶。
有用的蛋白酶的例子是描述於WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中的變體，尤其是在一個或多個下列位置發生了替代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
優選的商業上可獲得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的脂肪酶。化學修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質黴屬(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，例如EP258068和EP305216中描述的來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶、或WO96/13580中描述的來自H.insolens的脂肪酶；假單胞菌屬(Pseudomonas)的脂肪酶例如來自產鹼假單胞菌(P.alcaligenes)或類產鹼假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)，洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、司徒茨氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬的菌株SD 705(WO95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)的脂肪酶；芽胞桿菌屬脂肪酶例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993)，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。
其它例子包括例如記載於WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中的脂肪酶變體。
優選的商業上可獲得的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)。
澱粉酶適合的(α和/或β)澱粉酶包括細菌或真菌來源的澱粉酶。化學修飾的突變體或蛋白質工程突變體也包括在內。澱粉酶包括，例如，從芽胞桿菌屬例如地衣芽孢桿菌的特定菌株中獲得的α-澱粉酶，更詳細的描述在GB1,296,839中。
有用的澱粉酶的例子是描述於WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中的變體，尤其是在一個或多個下列位置發生了替代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商業上可獲得的澱粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/s)、RapidaseTM和PurastarTM(來自GenencorInternational Inc.)。
纖維素酶適合的纖維素酶包括細菌或真菌來源的纖維素酶。化學修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質黴屬、鐮孢黴屬、梭孢殼屬、枝頂孢黴屬(Acremonium)的纖維素酶，例如由Humicola insolens、Myceliophthora thermophila和尖鐮孢產生的真菌纖維素酶，它們公開於US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WO89/09259。
特別適合的纖維素酶是具有護色功能的鹼性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是描述於EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纖維素酶。其它例子有例如描述於WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中的纖維素酶變體。
商業上可獲得的纖維素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovoNordisk A/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor InternationalInc.)，以及KAC-500(B)TM(Kao公司)。
過氧化物酶/氧化酶適合的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。化學修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內。有用的過氧化物酶的例子包括來自鬼傘菌屬(Coprinus)的過氧化物酶，例如來自灰蓋鬼傘(C.Cinereus)的過氧化物酶，和WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所描述的它的變體。
商業上可獲得的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
可以通過加入含有一或多種酶的獨立添加劑，或通過加入含有所有這些酶的組合添加劑，將所述的一種或多種去汙劑酶包含在去汙劑組合物中。本發明的去汙劑添加劑即獨立添加劑或組合添加劑，可以配製成含有一或多種本發明的酶顆粒。
本發明的去汙劑組合物可以是任何方便的形式例如條形、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體去汙劑可以是水性的，典型地含有高達70％的水和0-30％的有機溶劑，或非水性的。
該去汙劑組合物含有一或多種表面活性劑，該表面活性劑可以是非離子包括半極性表面活性劑，和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子表面活性劑。這些表面活性劑典型地按重量計以0.1％到60％的水平存在。
當被包括在內時，該去汙劑通常含有大約1％到大約40％的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽、α-烯基磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。
當被包括在內時，該去汙劑通常含有大約0.2％到大約40％的非離子表面活性劑例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇醯胺、脂肪酸單乙醇醯胺、聚羥基烷基脂肪酸醯胺，或氨基葡糖(「葡糖醯胺」)的N-醯基N-烷基衍生物。
該去汙劑可以含有0-65％的去汙助劑或絡合劑例如沸石，二磷酸鹽，三磷酸鹽，膦酸酯，碳酸鹽，檸檬酸鹽，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基丁二酸、可溶性矽酸鹽或分層的矽酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。
該去汙劑可以包含一或多種聚合物。例子有羧甲基纖維素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，馬來酸/丙烯酸共聚物和十二烷基異丁烯酸/丙烯酸共聚物。
該去汙劑可以含有漂白體系，該漂白體系可以包括H2O2來源物質例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，並且可以與形成過酸的漂白活化劑例如四乙醯乙二胺或壬醯羥苯磺酸鹽結合。或者，該漂白體系可以含有例如醯胺、醯亞胺或碸類的過氧酸。
本發明去汙劑組合物中的酶可以通過使用常規穩定劑來穩定，例如多元醇例如丙二醇或丙三醇，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲醯基苯基硼酸，並且該組合物可以按例如WO92/19709和WO92/19708所述的方法配製。
該去汙劑還可以含有其它常規去汙成分，例如包括粘土在內的織物調理劑、發泡增效劑、泡沫抑制劑、抗腐蝕劑、汙垢懸浮劑、抗汙垢再沉積劑、染料、殺菌劑、光漂白劑、增溶劑、晦暗抑制劑或香料。
目前正在設想，在該去汙劑組合物中可以加入任何酶，尤其是本發明的酶，其加入量相當於每升洗滌液中加入0.01-100mg酶蛋白，優選每升洗滌液中加入0.05-5mg酶蛋白，尤其是每升洗滌液中加入0.1-1mg酶蛋白。
此外還可以將本發明的酶加入WO97/07202中所公開的去汙劑製品中，其中WO97/07202在此以參考文獻方式併入。
材料和方法本文使用的蛋白酶活性單位是Kilo Novo Protease(蛋白酶)。樣品的KNPU是在標準測定中相對於Savinase標準而確定的，方法是測定一給定數量樣品溶液中由酶消化二-甲基-酪蛋白(DMC)釋放出的游離氨基的形成速度(μmol/分鐘)。記錄在形成的游離氨基和加入的2，4，6-三-硝基-苯-磺酸(TNBS)反應的同時在420nm處光吸收的線性增長監測形成速率。在50℃、pH8.3的硼酸緩衝液中，進行DMC的消化和顏色反應，反應時間9分鐘，其後有3分鐘的測定時間。
實施例1高產品效價的蛋白酶發酵肉湯的噴霧乾燥將成批量生產規模的乾物質含量為13％w/w的含有蛋白酶的發酵肉湯通過旋轉刷濾過器過濾以除去大的固體顆粒。在保持攪拌的條件下向肉湯中加入0.5％Rodalon(50％苯扎氯銨)殺死發酵過的微生物。然後加入甲酸將pH降低到5.5，並將肉湯放置1小時或更長使Rodalon產生效果。將肉湯加熱到投料口溫度140℃並通過一旋轉噴霧噴口導入一乾燥腔室(Niro Atomizer，SD200-R噴霧乾燥塔)。出口溫度為55℃。產生的噴霧乾燥粉末的活性為41KNPU/g，水分含量為4.86％。
實施例2高產品效價的纖維素酶發酵肉湯的生產規模的噴霧乾燥將成批量生產規模的含有纖維素酶的發酵肉湯通過旋轉刷濾過器過濾以除去大的固體顆粒。在保持充分攪動的條件下向肉湯中加入0.5％Rodalon(50％苯扎氨銨)殺死生產菌株，並將肉湯放置至少1小時使Rodalon產生效果。在入口溫度為140℃時通過旋轉噴霧噴口將肉湯輸入噴霧塔(Niro Atomizer，SD200-R)。出口溫度為55℃。產生的噴霧乾燥粉末的預估活性為20000ECU/g，預計水分含量低於5.0％。
實施例3高產品效價的澱粉酶發酵肉湯的生產規模的噴霧乾燥將成批量生產規模的含有澱粉酶的發酵肉湯通過旋轉刷濾過器過濾以除去大的固體顆粒。在保持充分攪動的條件下向肉湯中加入0.5％Rodalon(50％苯扎氯銨)殺死生產菌株，並將肉湯放置至少1小時使Rodalon產生效果。在入口溫度為140℃時通過旋轉噴霧噴口將肉湯輸入噴霧塔(Niro Atomizer，SD200-R)。出口溫度為55℃。產生的噴霧乾燥粉末的預估活性為960KNU/g，預計水分含量低於5.0％。
權利要求
1.一種製備含有酶的顆粒的方法，包括將含有酶和生物質的發酵肉湯原料噴霧乾燥，得到含有酶和生物質的固體顆粒。
2.權利要求1的方法，其中生物質中發酵的微生物是選自芽孢桿菌屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia、支頂孢屬、麴黴屬、鐮孢屬、腐質黴屬、毛黴屬、毀絲黴屬、脈孢菌屬、青黴屬、梭孢殼屬、Tolypocladium和木黴屬的菌株。
3.權利要求1的方法，其中酶選自氧化還原酶(EC 1.-.-.-)、轉移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂解酶(EC 4.-.-.-)、異構酶(EC 5.-.-.-)和連接酶(EC 6.-.-.-)。
4.權利要求1的方法，其中生物質構成從發酵得到的生物質的至少10％。
5.權利要求4的方法，其中生物質構成從發酵得到的生物質的至少50％。
6.權利要求5的方法，其中生物質構成從發酵得到的生物質的至少75％。
7.權利要求6的方法，其中生物質構成從發酵得到的生物質的至少90％。
8.權利要求1的方法，其中肉湯含有0-30％w/w乾物質。
9.權利要求1的方法，其中生物質構成不超過90％w/w的乾物質。
10.權利要求1的方法，其中酶構成不超過50％w/w的乾物質。
11.權利要求1的方法，還包括在噴霧乾燥前肉湯的除渣。
12.一種製備含有酶的顆粒的方法，包括將含有酶的水性液體原料噴霧乾燥，得到噴霧乾燥的第一含酶顆粒，並隨後使此第一乾燥顆粒經過選自製粒、包衣和其組合的工藝，得到含酶的第二乾燥顆粒。
13.權利要求12的方法，其中含酶的水性液體是發酵肉湯、酶濾液或酶濃縮物。
14.權利要求1或12的方法，其中已向原料中加入了選自無機鹽、無機礦物質或粘土、碳水化合物、著色劑、纖維素或其衍生物、殺蟲劑、分散劑、防泡劑、粘度調節劑、酸性試劑、鹼性試劑、酶穩定劑、酶抑制劑、粘合劑、其它酶及其組合的添加劑。
15.權利要求1或12的方法，其中原料經過了選自加熱、冷卻、輻射、混合、通氣和超聲處理等物理處理。
16.權利要求15的方法，其中原料已被加熱或冷卻到5-150℃。
17.權利要求1或12的方法，其中已將原料滅菌。
18.權利要求1或12的方法，其中已處理原料以水解原料中存在的多核苷酸。
19.權利要求1或12的方法，其中原料是發酵肉湯或發酵濾液濃縮物，每升液相中含有至少3mg活性酶。
20.權利要求1或12的方法，其中原料具有5-5000cps的粘度。
21.權利要求1或12的方法，其中噴霧乾燥包括通過選自高速轉盤式霧化器、壓力噴嘴霧化器、氣動噴嘴霧化器或聲波噴嘴霧化器和Rayleigh霧化器的霧化裝置將原料霧化的步驟。
22.權利要求21的方法，其中霧化裝置是Rayleigh霧化器。
23.權利要求1或12的方法，還包括使噴霧乾燥的顆粒在流化床乾燥設備中進一步乾燥。
24.權利要求1或12的方法，其中噴霧乾燥顆粒的SPAN值小於約2.5。
25.權利要求12的方法，其中制粒工藝選自混合制粒、造粒、擠出、流化床和壓緊工藝。
26.一種含有酶和生物質的顆粒。
27.權利要求26的顆粒，從選自噴霧乾燥發酵肉湯、將噴霧乾燥的發酵肉湯制粒、將噴霧乾燥的發酵肉湯包衣和將噴霧乾燥的發酵肉湯制粒和包衣的工藝得到。
28.一種組合物，含有權利要求26和27的顆粒。
29.權利要求28的組合物，其中組合物選自清潔組合物、紡織品加工組合物、皮革加工組合物、紙漿或紙加工組合物、食物和飲料組合物、動物飼料組合物和個人護理組合物。
30.權利要求29的清潔組合物，其中清潔組合物是還含有表面活性劑的去汙劑組合物。
31.權利要求26-30的顆粒和組合物在處理選自紡織品、皮革、紙漿、紙、食物、飲料、硬表面和人或動物體的對象中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種含有酶和生物質的顆粒;及一種製備顆粒的方法,包括將含有酶和生物質的發酵肉湯原料噴霧乾燥,得到含有酶和生物質的固體顆粒;還涉及一種製備含有酶的顆粒的方法,包括將含有酶的水性液體原料噴霧乾燥,得到噴霧乾燥的第一含酶顆粒,隨後使此第一乾燥顆粒經過選自製粒、包衣和其組合的過程得到第二乾燥的含酶顆粒。
文檔編號C12N9/00GK1382213SQ00814580
公開日2002年11月27日 申請日期2000年9月29日 優先權日1999年10月1日
發明者J·託普-喬根森, C·雅各布森, K·U·漢森, A·喬根森, D·奧夫特倫德, P·巴克, G·B·桑德嘉德 申請人:諾沃奇梅茲有限公司