一種芽孢乳桿菌及其生產的活菌製劑的製作方法

2023-09-14 04:36:45

專利名稱：一種芽孢乳桿菌及其生產的活菌製劑的製作方法
技術領域：
本發明的一種芽孢乳桿菌S1及其生產的菌劑，屬於生物高技術領域，是利用通過調整動物腸道微生態的方法來降低仔豬的腹瀉率，提高仔豬的生長速度，適用於現代農業生產中綠色無公害畜產品的生產。
二、技術背景自上世紀50年代，美國食品與藥物管理局(FDA)首次批准抗生素可用作飼料添加劑後，世界各國先後進行抗生素的飼養試驗，並用於生產。無容置疑，抗生素用作促生長類飼料添加劑，在預防動物疾病，促進動物生長方面起到過積極作用。但隨著時間的推移和科學的進步，人們認識到，在飼養中使用飼用抗生素等抗菌藥物可產生嚴重的負面效應。主要表現為病原菌等微生物的抗藥性增加，抗菌藥物失去應有效果，一些疾病給人和動物帶來嚴重威脅，正常菌群平衡失調，人、動物免疫力降低等。因此，一些發達國家在飼養中禁用和限用抗生素等抗菌藥物。在我國，安全問題是限制我國畜產品出口的一個瓶頸，隨著我國加入WTO，環保型飼料的生產愈顯重要。因此，尋找抗生素的替代品是國內、國際飼料產業研究的熱點問題。
益生素是一類通過調控動物腸道微生物區系平衡而有效地促進宿主動物健康和生長的微生物活菌製劑，因此也常稱微生物活菌製劑。當生理和環境條件變更時，幼畜腸道中有害病原菌常迅速繁殖，造成腸道性疾病如腹瀉的發生。益生素的應用可通過微生物拮抗、競爭排斥以及免疫刺激改善腸道微生物區系的平衡，從而減少疾病的發生。作為益生素的微生物通常是來自動物自身腸道或來自其它生態環境的有益微生物，對動物和人無毒副作用，因此被認為是一類具有廣闊開發和應用前景的抗生素替代品，這一方面的研究也成為當今國際上畜牧獸醫學科的一個前沿研究領域。
在動物營養中用作益生素的微生物主要有乳酸菌(包括芽孢桿菌Bacillus spp.、腸球菌Enterococcus spp.、乳酸桿菌Lactobacillus spp.、雙歧桿菌Bifidobacterium spp.等)、酵母菌(如Saccharomyces cerevisiae)等。但有關其應用效果的報導很不一致，原因可能與下述因素有關(1)菌株來源。目前所用的益生菌大多為體外篩選而得，由於體內外環境差異極大，外源微生物必須經過定植、競爭和排斥才能在動物腸道中生存，因而許多學者認為，理想的益生素菌種最好來自動物腸道。(2)益生菌株的作用機理不清楚，特別是其在動物腸道中的活動規律仍不十分清楚。(3)益生素在體內的存活條件不清楚。目前生產中所用的不少益生菌株是通過體外微生物平板實驗篩選出來的。但是益生素被飼用後，必須適應或耐受腸道中的生理和生活環境，必須能附著在腸道壁上，必須能夠與其它腸道微生物競爭並達到可控制有害微生物繁殖所需的數量和存活率。這些是益生素能否發揮其作用的先決條件。
目前國外已有研究室開展尋找內源性乳酸菌作為仔豬益生菌的研究工作，但有關其作用機理和將其應用到生產實際中的報導甚少。一些國內學者在此方面也做了很多工作，但多限於菌株的分離、單一菌株的抑菌實驗等方面的研究，有關深入探討乳酸菌的作用機理的研究尚少。

發明內容
技術問題 本發明的目的在於針對生產實踐中的實際問題和需求，開發研製出一種新型的芽孢乳桿菌益生菌劑，使用本菌劑可較大程度的降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的生長速度，降低仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。同時生產和使用成本較低。該菌劑可以在仔豬正常飼養過程中使用，符合綠色飼料添加劑要求。
技術方案本發明菌株是採用PCR/DGGE技術，並結合常規微生物學方法，分離仔豬腸道內具益生作用的乳酸菌株，並通過活體動物實驗，結合體外培養、發酵技術，分析了腸道生理生化因素對所分離的外源乳酸菌的選擇性影響，最終篩選出可用作仔豬益生素生產的芽孢乳桿菌S1菌株，通過發酵生產、製成了益生菌劑。
下面為本發明的主要內容一種芽孢乳桿菌S1，其特徵在於該微生物是革蘭氏染色陽性的的菌株S1(2005年2月5日寄存於中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.1315)，經鑑定為Sporolactobacillus sp.。主要生物學特性為G+，菌體細長杆狀，有分節，橢圓形芽孢，孔雀綠染色後芽孢明顯，兼性厭氧生長，葡萄糖、乳糖、纖維二糖、菊糖能氧化產酸，但不分解阿拉伯糖、木糖、澱粉。該菌耐低pH值(pH2.5)及高膽鹽濃度(0.1-0.2％)，對胃蛋白酶不敏感，80℃下2小時內能生長，發酵菌液具有顯著的抑制大腸桿菌及金黃色葡萄球菌生長效應。仔豬生產中使用該菌劑後可較大程度的降低仔豬的腹瀉率，提高生長速度，減少仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。該菌可以用發酵工業通用發酵設備進行生產。
使用上述芽孢乳桿菌生產菌劑的工藝為斜面菌種----搖瓶種子液----發酵罐------冷凍乾燥----產品(包裝劑型凍乾粉)。
本發明的詳細實施步驟為1)將試管種接種於發酵培養基中，搖瓶振蕩培養至對數期；2)將上述培養好的菌種按10％的接種量接種入10升發酵罐，培養至對數生長期，培養基配方為蛋白腖1％；牛肉浸膏1％；酵母浸膏0.5％；葡萄糖2％；檸檬酸三銨0.2％；醋酸鈉0.5％；K2HPO40.5％；MgSO4.7H2O 0.05％；MnSO4.4H2O0.02％；吐溫-80 0.1％；番茄汁10％；pH5.5～6.2；培養溫度為37℃，全流程培養時間為48-60小時，發酵結束後菌體數量達到10億個/ml以上。
3)發酵罐中的菌液在3000×g，4℃下離心10分鐘後，所得菌泥添加無菌脫脂乳液，而後-70℃過夜，在冷凍乾燥儀中冷凍乾燥20h，製成凍乾粉。
有益效果本發明提供了一種新型的芽孢乳桿菌益生菌劑，使用本菌劑可較大程度的降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的生長速度，降低仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。
使用該發明生產的芽孢乳桿菌益生菌劑具有生產成本低，使用方便，使用效果好的優點，適合個體養殖戶及規模化豬場大面積推廣使用。本發明對於降低仔豬的腹瀉率，保護生態環境具有重要的意義。動物試驗表明，芽孢乳桿菌S1菌劑能使仔豬腹瀉率降低60％以上，可以大大降低豬生產過程中飼用抗生素的添加量，降低養豬成本，提高養豬生產效益。該益生菌劑可以與其他仔豬添加劑的同時使用，符合綠色飼料添加劑要求。並且該菌來源於仔豬腸道，屬有益微生物，對動物無任何副作用。
四

圖1對大腸桿菌K99的抑菌效果圖2分子跟蹤S1菌在仔豬腸道中的定植圖3S1菌的生長曲線
五具體實施例方式
1 菌株的分離和鑑定以無菌方法取仔豬腸道食糜及腸壁，將其溶解於無菌生理鹽水中，用旋渦混合儀將稀釋液混勻後，1000r.min-1下離心，取上清梯度稀釋後接種於固體培養基上，37℃培養數天。從中挑取數個菌落，菌株優化結果表明，S1菌的生長速度極快，在接種後10小時即可達到平穩期，見圖3；S1菌耐低pH值、高溫、高膽鹽濃度及抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果最好，該菌鑑定為Sporolactobacillus sp.。主要生物學特性為G+，菌體細長杆狀，有分節，橢圓形芽孢，孔雀綠染色後芽孢明顯，兼性厭氧生長。該菌可以用發酵工業通用發酵設備進行生產。
2 菌株優化實驗2.1pH值對芽孢乳桿菌S1存活的影響S1在MRS培養基中培養至對數後期，取菌液在pH2.5、3.5、4.5生理鹽水中，每隔30min測定S1菌株的數量，結果表明，上述pH值對S1菌株的存活無太大影響，在pH4.5時，其活菌數隨時間延長不斷上升，菌株呈正常生長態勢，在pH3.5時，在整個處理期間，活菌數基本無變化；在pH2.5時，隨時間延長，活菌數有所下降，但在150min時存活數仍較高。在pH1.5時，經60min處理後存活數低於1.00×104，說明S1菌株對pH1.5耐受性差。由此可見，S1菌可耐受pH2.5以上的條件。
2.2膽鹽對芽孢乳桿菌S1存活的影響S1菌在MRS培養基中培養至對數後期，接種於含膽鹽的無菌生理鹽水中，每間隔1h測定一次其中活菌數量。結果表明，與對照相比，S1菌株的生長受膽鹽的抑制，隨培養時間的增長，活菌數下降，且在同一時間點上，隨膽鹽濃度增加，S1菌株活菌數下降；但S1菌株對0.1-0.2％膽鹽耐受性較好。
2.3芽孢乳桿菌S1的熱耐受性S1菌在MRS培養基中培養到對數後期，按10％的接種量接到已預熱至50℃、80℃、100℃的無菌生理鹽水中，每間隔1min測定其中的活菌數量，結果表明，S1菌株經100℃加熱2min處理後存活率為1.94％，5min後存活率小於0.02％，50℃熱處理對S1菌株的存活無影響。
2.4芽孢乳桿菌S1的抑菌效果採用牛津杯法，研究S1的發酵液對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效應，表1所示，S1菌株發酵液對大腸桿菌K88、K99、O141、1987P和金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著。S1菌株菌液的抑菌物質中除乳酸外，同時存在其他抑菌物質，這些抑菌物質佔總抑菌效應的30％左右。S1菌株發酵液的抑菌物質具有良好的熱穩定性和耐蛋白酶特性，經70℃30min、100℃30min、121℃15min加熱處理後殘留抑菌效果(熱處理菌液抑菌圈直徑除以原液抑菌圈直徑)均在92％以上，經蛋白酶處理後殘留抑菌效果(蛋白酶處理菌液抑菌圈直徑除以原液抑菌圈直徑)均在85％以上，見表2。
2.5芽孢乳桿菌S1製劑與不同寡糖的複合效應研究芽孢乳桿菌S1菌劑與不同寡糖的組合效應。結果表明，快發酵型(FOS)和慢發酵型(菊糖)寡糖複合後對芽孢乳桿菌S1的生長速度和產酸能力促進作用最強。
3實際應用實驗3.1芽孢乳桿菌S1製劑的動物試驗選取多窩新生仔豬，分別在7(開食當天)、9、11日齡進行口服芽孢乳桿菌S1的試驗。結果表明，芽孢乳桿菌S1能提高斷奶後仔豬前後腸乳酸菌與大腸桿菌的數量比值；提高後腸VFA濃度尤其是丁酸濃度(丁酸濃度的提高對仔豬的健康有益)；分子跟蹤顯示其在乳仔豬胃腸道中能夠存活並定植。同時取仔豬胃底、十二指腸、空腸組織，進行組織形態學觀察，試驗發現，乳酸菌可顯著提高斷奶後仔豬胃底腺鹽酸細胞的數量，並可促進斷奶前十二指腸腸絨毛的增高，但對空腸腸絨毛高度無顯著影響。
3.2芽孢乳桿菌S1製劑的應用劑量試驗選用30窩新生仔豬，分別於7(開食當天)、9、11日齡給三個處理組口服不同劑量的芽孢乳桿菌S1，結果表明不同劑量的芽孢乳桿菌S1均能顯著降低乳仔豬的腹瀉率，CFU為109的口服劑量效果最佳。
3.3芽孢乳桿菌S1製劑的中試動物試驗選取多個豬場，每豬場30-40窩新生仔豬，於7、9、11日齡口服CFU為109的芽孢乳桿菌S1。結果表明，在7-21日齡期間，口服芽孢乳桿菌S1組的平均日增重比對照組提高9.49％，而且其日增重變異係數明顯好於對照組(7.47％vs23.15％)，試驗組腹瀉率極顯著低於對照組(3.1％vS19.7％)。
表1 對大腸桿菌K88、99、O141、987P、E1及金黃色葡萄球菌的抑菌效應單位mm

表2 S1菌液中抑菌物質的熱穩定性

權利要求
1.一種芽孢乳桿菌，其特徵在於該微生物是革蘭氏染色陽性的Sporolactobacillus sp.的菌株S1，2005年2月5日寄存於中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.1315，經鑑定為Sporolactobacillus sp.，主要生物學特性為G+，菌體細長杆狀，有分節，橢圓形芽孢，孔雀綠染色後芽孢明顯，兼性厭氧生長，葡萄糖、乳糖、纖維二糖、菊糖能氧化產酸，但不分解阿拉伯糖、木糖、澱粉；該菌發酵菌液具有顯著的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長的效應；該菌耐低pH值及高膽鹽濃度，對胃蛋白酶不敏感，80℃下2小時內能生長，其菌劑在仔豬飼養中使用後可較大幅度的降低仔豬的腹瀉率，提高生長速度，減少仔豬飼料中飼用抗生素的添加量。
2.一種用權利要求1所述的芽孢乳桿菌的菌劑，是通過以下方法生產而成1)將試管種接種於發酵培養基中，搖瓶振蕩培養至對數期；2)將上述培養好的菌種按10％的接種量接種入10升發酵罐，培養至對數生長期，培養基配方為蛋白腖1％；牛肉浸膏1％；酵母浸膏0.5％；葡萄糖2％；檸檬酸三銨0.2％；醋酸鈉0.5％；K2HPO40.5％；MgSO4.7H2O 0.05％；MnSO4.4H2O 0.02％；吐溫-80 0.1％；番茄汁10％；pH5.5～6.2；培養溫度為37℃，全流程培養時間為48-60小時，發酵結束後菌體數量達到10億個/ml以上；3)發酵罐中的菌液在3000×g，4℃下離心10分鐘後，所得菌泥添加無菌脫脂乳液，而後-70℃過夜，在冷凍乾燥儀中冷凍乾燥20h，製成凍乾粉。
全文摘要
本發明提供了一種可降低仔豬腹瀉率的芽孢乳桿菌及其生產的活菌製劑，所用菌株為革蘭氏染色反應陽性菌S1，經鑑定為Sporolactobacillus sp.。主要生物學特性為G
文檔編號C12N1/20GK1687400SQ20051003889
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月15日 優先權日2005年4月15日
發明者朱偉雲, 姚文, 毛勝勇 申請人:南京農業大學