犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法
2023-09-14 03:46:30 2
專利名稱：犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法
技術領域：
本發明利用鹼性蛋白酶水解犛牛乳酪蛋白製備抗氧化肽，屬於生物技術領域。
背景技術：
人體自由基的來源有兩種，一是生物 在氧化反應或其伴隨的次反應中產生，二是空氣汙染、食物中的脂肪腐敗、吸菸和紫外線作用與生物體產生。生物有自身的清除自由基防禦系統。但自身的防禦系統不足以清除自由基時，自由基會造成DNA損傷、細胞膜磷脂過氧化和低密度脂蛋白的改變，啟動慢性疾病的發生。目前認為有70多種病與自由基有關，包括心臟病、動脈硬化、靜脈炎、關節炎、過敏、白內障、老年痴呆、冠心病及癌症。人們需要抗氧化劑去抵抗氧化應激反應，合成的抗氧化劑雖然高效、廉價，但由於有副作用，人們更青睞於選擇天然的抗氧化劑。食物來源的抗氧化劑很多，人們從植物和動物源的蛋白中都獲得了抗氧化肽。其中包括花生、米糠、玉米、苜蓿、山藥、豆奶、魚類、蛋黃蛋白、酪蛋白等。犛牛乳酪蛋白是以西北特有的資源曲拉為原料，通過提取純化製備的蛋白質，是無限量添加的食品添加劑和營養強化劑。由於酪蛋白疏水性胺基酸含量高，蛋白質含量在90%以上，犛牛乳酪蛋白不易溶於水，溶於弱鹼液。活性肽是包含在完成蛋白質結構中的特定序列，只有通過水解後，才能釋放出各種生理功能，這些肽主要含2 20個胺基酸殘基，分子量小於6000Da。表現出阿片肽、礦物質吸收、免疫調節、抗微生物、抗血栓、降血脂、抗氧化、降血壓等特性。抗氧化肽的活性主要和肽的結構、組成和疏水性有關。其中酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、胱氨酸和組氨酸的存在對抗氧化肽的活性影響最大。除此外胺基酸在肽中的位置、蛋白的種類、水解酶的種類、肽的分子量和肽的含量都對抗氧化活性有影響。
發明內容
本發明的目的在於避免現有技術的不足，提供一種犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法。用鹼性蛋白酶水解酪蛋白製備抗氧化肽，實現了犛牛乳酪蛋白的深加工，緩解食物源抗氧化肽市場供應不足的問題，工藝簡單，抗氧化活性高，適合工業化推廣生產。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法，其主要特點是包括以下步驟(I)犛牛乳酪蛋白溶解稱取犛牛乳酪蛋白20g 40g，加水500mL，調節反應溫度30°C 60°C，pH7. O 9. 0，攪拌，使犛牛乳酪蛋白溶解；所述的犛牛乳酪蛋白購自華羚酪蛋白股份有限公司(2)加鹼性蛋白酶水解吸取250μ L 500 μ L酶液，維持反應溫度30°C 60°C，pH7. O 9. 0，反應I 4小時；鹼性蛋白酶購自諾維信，產品名稱Alcalase2. 4L FG ；(3)滅活鹼性蛋白酶，升溫至80°C 100°C，維持15 30分鐘；(4)沉澱酪蛋白用5mol/L鹽酸調節pH到4. I 4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出；(5)離心4000g IOOOOg離心力，離心5 30分鐘，離心除去酪蛋白沉澱，留上
清液；(6)超濾取離心後上清液，過截留量6000Da的超濾膜，收集透過液，除去大分子蛋白及多肽；(7)噴霧乾燥取步驟(6)中的超濾透過液，採用噴霧乾燥機進行噴幹，得到犛牛乳酪蛋白抗氧化肽。還包括有在步驟(6)超濾後還包括有納濾步驟取超濾透過液，通過截留分子量為200Da的納濾膜，收集回流液，除去小分子鹽和胺基酸；然後進行噴霧乾燥步驟取納濾回流液，採用噴霧乾燥機進行噴幹，得到犛牛乳酪蛋白抗氧化肽。
所述的犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法，所述的犛牛乳酪蛋白為食品級犛牛乳酪蛋白；所述的鹼性蛋白酶為食品級鹼性蛋白酶；所述的鹽酸為食用級鹽酸。所選用的酶製劑為鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中的一種。對以上方法得到的犛牛乳酪蛋白抗氧化肽進行抗氧化活性測定DPPH(1，I 二苯基 2 苦基苯肼)自由基清除測定方法其操作步驟如下①分別吸取ImL待測液(10mg/mL)和ImL DPPH的無水乙醇溶液(I X 10 4mol/L)置於試管中，搖勻，在暗處反應30min後在波長517nm處測吸光度值Ai ；②分別吸取ImL待測液(lOmg/mL)和乙醇溶液置於試管中，搖勻，在暗處反應30min後在波長517nm處測吸光度值Aj ；③分別吸取DPPH和乙醇溶液置於試管中，搖勻，在暗處反應30min後在波長517nm處測吸光度值Ac。結果計算
DPPH 清除率(％) =1- ............................X 100
Ac羥自由基清除測定方法其操作步驟如下①試劑配製7. 5mmol/L鄰二氮菲的配製稱取0. 1487g鄰二氮菲溶於IOOml蒸餾水中。PH7. 4，0. 75mol/L磷酸緩衝液的配製稱取磷酸氫二鈉106. 5g,溶於IOOOmL蒸餾水中，用酸度計調兩者於PH7. 4。0. 1%過氧化氫的配製取0. Iml過氧化氫加入99. 9ml蒸餾水中。7. 5mmol/L硫酸亞鐵的配製取0. 114g硫酸亞鐵溶於IOOml蒸懼水中。②測定方法取3個反應試管，分別標號AP、Ab和As，按照表1，分別加入反應溶液，每加一管後迅速搖勻，在37°C溫浴I小時。待反應完全後在波長536nm處測定吸光度。羥自由基(HO ·)清除率⑷按下式計算d(% ) = [A-Ap / Ab Ap] X 100。表I反應體系表
權利要求
1.一種犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 (O犛牛乳酪蛋白溶解稱取犛牛乳酪蛋白20g 40g，加水500mL，調節反應溫度30°C 60°C，pH7. O 9. O，攪拌，使犛牛乳酪蛋白溶解； (2)加鹼性蛋白酶水解吸取250μ L 500 μ L酶液，維持反應溫度30°C 60°C，pH7. O 9· 0，反應I 4小時； (3)滅活鹼性蛋白酶，升溫至80°C 100°C，維持15 30分鐘； (4)沉澱酪蛋白用5mol/L鹽酸調節pH到4.I 4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出； (5)離心4000g IOOOOg離心力，離心5 30分鐘，離心除去酪蛋白沉澱，留上清液； (6)超濾取離心後上清液，過截留量6000Da的超濾膜，收集透過液，除去大分子蛋白及多肽； (7)噴霧乾燥取步驟(6)中的超濾透過液，採用噴霧乾燥機進行噴幹，得到犛牛乳酪蛋白抗氧化肽。
2.如權利要求I所述的犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法，其特徵在於，步驟還包括有 在步驟(6)超濾後還包括有納濾步驟取超濾透過液，通過截留分子量為200Da的納濾膜，收集回流液，除去小分子鹽和胺基酸；然後進行噴霧乾燥步驟取納濾回流液，採用噴霧乾燥機進行噴幹，得到犛牛乳酪蛋白抗氧化肽。
3.如權利要求I所述的犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法，其特徵在於，所述的犛牛乳酪蛋白為食品級犛牛乳酪蛋白；所述的鹼性蛋白酶為食品級鹼性蛋白酶；所述的鹽酸為食用級鹽酸。
4.如權利要求I所述的犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法，其特徵在於，所選用的酶製劑為鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中的一種。
全文摘要
本發明利用鹼性蛋白酶水解犛牛乳酪蛋白製備抗氧化肽，屬於生物技術領域。一種犛牛乳酪蛋白抗氧化肽的製備方法，其主要特點是包括以下步驟(1)犛牛乳酪蛋白溶解；(2)加鹼性蛋白酶水解；(3)滅活鹼性蛋白酶；(4)沉澱酪蛋白；(5)離心；(6)超濾；(8)噴霧乾燥。本發明製備的抗氧化肽，肽分子量小，結構簡單，抗氧化活性高，1mg/mL的反應體系清除1,1～二苯基～2～苦基苯肼54.53%，清除羥自由基49.46%。
文檔編號C12P21/06GK102787156SQ20121031554
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月30日 優先權日2012年8月30日
發明者何瀟, 宋禮, 紀銀莉, 蘇豔萍, 葛靜微, 謝小冬, 高維東 申請人:甘肅華羚生物技術研究中心