凝集性酵母及其製備方法

2023-09-19 16:41:50 1

專利名稱：凝集性酵母及其製備方法
技術領域：
本發明涉及用於生物乙醇生產的、屬於凝集性得到提高的馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)的凝集性酵母及其製備方法等。
背景技術：
微生物在工業產品生產中佔有重要的位置。其中，更高效、便宜地進行生產是人們 想解決的一項課題。其解決方法有選擇表現更高生產率的菌株、以及對用於微生物培養的 培養基的組成或培養溫度等培養條件進行研究等。以近年來分子遺傳學的發展為基礎，作 為菌株的一種選擇方式，可以列舉由現有的菌株利用特定的優秀基因，將菌株轉化的方法。 目前，即使對於生產有用的食品類的酵母，為了更有效的生產，也較多地進行了轉化。作為用於有效生產的轉化的一種，可以列舉提高菌體凝集性的轉化。利用了發酵 法的醇生產，可以通過在作為發酵酵母的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中使用醇 生產率特別高的株，並利用分批發酵法或連續發酵法這樣的方法來實施。現有的分批發酵 法，是通過在醇發酵酵母中添加糖蜜等作為原料，並在一定的條件下進行培養來生成醇的。 生成的醇通過加熱培養液而蒸餾回收，但殘留在培養液中的酵母由於加熱而滅活。因此，在 持續進行醇生產時，必須要補充酵母液。這樣的工序效率差，進而成本高。當使用凝集性 酵母時，靜置並回收上清液的醇，在沉澱的凝集性酵母中添加新的發酵液，可再次進行醇生 產，因此對於利用了分批發酵法的醇生產，優選使用凝集性的酵母。作為賦予凝集性的轉化的方法，有在醇發酵酵母染色體上的任意的標記基因區 域，導入作為外源DNA的凝集性基因表達盒而製成的實用的凝集性醇發酵酵母和其育種方 法(專利文獻1)；獲取酵母的凝集性基因的、編碼與凝集性有關的蛋白區域的DNA，並將該 DNA導入啤酒酵母中來製備凝集性得到強化的酵母的方法(專利文獻2)；用於燃料用乙醇 生產的凝集性酵母的構築(非專利文獻1)等。這些已經報導的轉化酵母，是將源於釀酒酵 母的凝集性基因導入屬於釀酒酵母的酒類製造用酵母而製成的。另一方面，對於在屬於與 釀酒酵母為不同屬的酵母中導入了源於釀酒酵母的凝集性基因的轉化酵母，尚未有報導， 並且對於源於釀酒酵母的凝集性基因在釀酒酵母以外的酵母中是否也能參與凝集性的調 節，完全不清楚。對於釀酒酵母，全基因組分析已經完成，正在確定凝集性基因。涉及凝集性的FLO 基因群組中，有存在於1號染色體上的FLOl基因(非專利文獻2)、存在於8號染色體上的 FL05基因(非專利文獻3)、存在於5號染色體上的FL08基因(非專利文獻4)、存在於1號 染色體上的FL09基因(非專利文獻5)、存在於11號染色體上的FL010基因(非專利文獻 6)等。這些基因被認為是具有與FLOl類似的鹼基序列的凝集素樣蛋白質。目前，從石油供給的問題考慮，在世界範圍內，正嘗試進行使用來自生物資源(〃 ^ t-r 的能源來代替石油的探索。依賴於生物資源的新能源的一種有作為生物資源燃 料的生物乙醇。生物乙醇可以利用較多含有糖質或澱粉質的植物資源獲得。作為利用以生 物資源為原料的微生物來進行醇生產的方法，公開了將西谷椰子原木的粉碎物糖化，利用
3釀酒酵母進行的乙醇的發酵生產法(專利文獻3)；使用屬於釀酒酵母的酵母，由垃圾等廢 棄物生產燃料用醇的方法(專利文獻4)。在生物乙醇的生產中使用的酵母，優選具有可與 生物資源的處理相對應的耐熱性、具有與醇生產酵母同樣高的凝集性的酵母。馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)是具有耐熱性的酵母，由 Lertwattanasakul 以及山田等，確認了醇脫S酶(alcohol dehydrogenase ；Adh)的表達， 所述醇脫氫酶與由糖向乙醇的轉換有關(非專利文獻7)。馬克斯克魯維酵母不僅可以產生 乙醇，而且由於蛋白質生產率高，因而被認為在工業生產中非常有用，然而現狀是，沒有一 般性地確立馬克斯克魯維酵母的轉化方法，這等的研究沒有進展。因此，對於適於生物乙醇 的工業生產的馬克斯克魯維酵母轉化株，至今沒有任何報導。專利文獻1 專利第3040959號公報專利文獻2 專利第3643404號公報專利文獻3 特開2007-195406號公報專利文獻4 特開2006-325577號公報非專利文獻1 =Biotechnol Lett, 30 :97_102，2008非專利文獻2 Yeast, 9 :423_427，1993非專利文獻3 =Science, 265 :2077_2082，1994非專利文獻4 =Nature 387 78-81,1997非專利文獻5 :Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :3809_3813，1995非專利文獻6 =Nature 369 :371_378，1994非專利文獻7 =Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 :1170_82，200
發明內容
本發明的課題在於，通過將外源的凝集性基因引入馬克斯克魯維酵母菌，提供適 於生物乙醇的工業生產，並具有耐熱性和凝集性的新型的馬克斯克魯維酵母轉化株，以及 提供上述轉化株的有效製備方法。本發明人等著眼於釀酒酵母的凝集性基因FLO作為用於賦予馬克斯克魯維酵母 凝集性的外源基因，製備了含有已知的表達啟動子序列和源於釀酒酵母的FLO基因序列的 直鏈狀(線狀)DNA片段，來作為用於誘導FLO基因表達的FLO基因表達盒。將該線狀DNA 片段導入馬克斯克魯維酵母菌，結果確認能夠高效地得到馬克斯克魯維酵母轉化株，同時 作為預料之外的結果，確認上述轉化株的凝集性顯著提高，從而完成本發明。SP，本發明涉及[1]具有凝集性和耐熱性的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)轉化 株的製備方法，其特徵在於，依次含有下述工序(A) (C) (A)在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的內源性FLO基因的上遊導入標記基因序列和表達啟動子序列來製備釀酒酵 母轉化株的工序；⑶由染色體DNA得到含有標記基因序列、表達啟動子序列和FLO基因序 列的DNA片段的工序，所述染色體DNA源於工序(A)中製備的釀酒酵母轉化株；(C)將工序 (B)中得到的DNA片段作為FLO基因表達盒導入馬克斯克魯維酵母，製備馬克斯克魯維酵母 轉化株的工序；[2]根據上述[1]所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵在於，釀酒酵母的內源性FLO基因是選自FLO1基因、FL05基因、FL09基因和FLO10基因中的1種以上 的FLO基因；[3]根據上述[1]或[2]所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵在 於，標記基因為營養缺陷型標記基因；[4]根據上述[1] [3]中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其 特徵在於，營養缺陷型標記基因是組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸('J > )、腺嘌 呤、色氨酸、精氨酸的至少1種的營養缺陷型基因；[5]根據上述[4]所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵在於，營養 缺陷型標記基因是URA3基因；[6]根據上述[1] [5]中任一項所述的製備方法，其特徵在於，馬克斯克魯維酵 母是在組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1種的營養 缺陷型基因中具有突變的馬克斯克魯維酵母突變體；[7]根據上述[1] [6]中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其 特徵在於，表達啟動子是3-磷酸甘油醛脫氫酶(TDH3)啟動子；[8]根據上述[1] [7]中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其 特徵在於，將線狀的DNA片段作為FLO基因表達盒導入馬克斯克魯維酵母；[9]根據上述[1] [8]中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法， 其特徵在於，馬克斯克魯維酵母轉化株是RAK4299株(NITEBP-514)、RAK4300株(NITE BP-515)、RAK4301 株(NITE BP-516)或者 RAK4302 株(NITE BP-517)。另外本發明涉及[10]由上述[1] [8]中任一項所述的製備方法製備的、具有凝集性和耐熱性的 馬克斯克魯維酵母轉化株；[11]根據上述[10]所述的馬克斯克魯維酵母轉化株，其特徵在於，其是RAK4299 株(NITE BP-514)、RAK4300 株(NITE BP-515)、RAK4301 株(NITE BP-516)或者 RAK4302 株 (NITE BP-517)。根據本發明，可以將馬克斯克魯維酵母轉化，來製備凝集性和耐熱性優異的酵母， 能夠提供有效用於生物乙醇的工業生產的酵母。


[圖1]是表示在FLO基因上遊插入源於PST106質粒的TDH3啟動子和URA3DNA片 段的示意圖。[圖2]是表示轉化用DNA片段的電泳結果的圖。(Lane1,6 =DNAladder, lane 2 源於 FL03，lane 3 源於 FL05，lane 4 源於 FL09，lane 5 源於 FL010)[圖3]是表示導入了轉化用DNA片段的釀酒酵母BY4700的染色體DNA(TF)、和沒 有導入的染色體DNA(WT)的電泳結果的圖。[圖4]是表示導入轉化用DNA片段所得到的4種類型釀酒酵母的染色體DNA中的 重組 FLO 基因的電泳結果的圖。(Lane 1,6 :DNA ladder, lane 2 :URA3-TDH3p_FL01，lane 3 :URA3-TDH3p-FL05, lane4 :URA3_TDH3p-FL09，lane 5 :URA3_TDH3p-FL010)[圖5]是表示相對於馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042和釀酒酵母BY4700的各轉化
5株的凝集性的圖。[圖6]是表示馬克斯克魯維酵母轉化株在28°C和40°C下的凝集性的圖。[圖7]是表示對於溫度為40 50°C的熱休克的時間，相對於溫度的反應時間的 上限和下限的圖。[圖8]是表示對於馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉化的結果的照片的圖。使 用25ng直鏈DNA的URA3片段，可以得到板面的轉化株數。[圖9]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉化效果中酵母細胞濃度的影響 的圖。[圖10]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉化效果中聚乙二醇(PEG)的分 子量和熱休克後的稀釋液的影響的圖。[圖11]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉化效果中DTT的影響的圖。[圖12]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉化效果中DNA片段大小的影響 的圖。[圖13]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉化效果中熱休克溫度和時間的 影響的圖。[圖14]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042為在使用了DNA片段的轉化中最有 效的菌株的圖。
具體實施例方式作為本發明的具有凝集性和耐熱性的酵母的製備方法，只要含有在耐熱性馬克斯 克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)中導入FLO基因表達盒的方法即可，沒有特別限 制。上述FLO基因只要是可賦予馬克斯克魯維酵母凝集性的FLO基因，可使用任意的基 因，可以優選列舉例如全基因組序列得到解析的釀酒酵母的FLO基因，更具體地，可以優選 例示釀酒酵母的FLOl基因、FL05基因、FL09基因、FL010基因等。對於釀酒酵母的FLO基 SWffE^ADDBJ (DNA Data Bank of Japan) > EMBL-EBI (European Molecular Biology Laboratory)、GenBank-NCBI (National Center for Biotechnology Information)、 S⑶(Saccharomyces Genome Database)等的基因組資料庫中，可知其鹼基序列信息。上述FLO基因表達盒只要可在馬克斯克魯維酵母中誘導FLO基因的表達即可，沒 有特別限制，優選下述那樣的FLO基因表達盒，其含有用於有效選擇轉化株的標記基因序 列，還以通過表達啟動子控制FLO基因的表達這樣的方式來設計。上述選擇標記基因可以 列舉抗生素等的耐藥性基因、營養缺陷型標記基因等編碼受體(宿主)細胞中缺失產物的 基因等，上述耐藥性基因可以例示對於氨苄青黴素、博來黴素、卡那黴素、寡黴素等藥物的 耐藥性基因等，上述營養缺陷型標記基因可以例示HIS3、URA3、LEU2等，特別優選使用營養 缺陷型標記基因。通過將選擇性培養基與營養缺陷型標記基因組合，可以選擇表達標記基 因的細胞，例如當將URA3的營養缺陷型基因導入細胞時，轉化的宿主細胞可以在不含有尿 嘧啶的培養基中生長，可進行被賦予凝集性的菌株的選擇。另外，上述表達啟動子沒有特別 限制，具體可以列舉例如3-磷酸甘油醛脫氫酶3 (TDH3、GAP)啟動子、TDHl啟動子、TDH2啟 動子、PH05啟動子、PGK啟動子、ADH啟動子、GALl啟動子、GAL10啟動子、熱休克蛋白質啟 動子、MFa 1啟動子、CUPl啟動子等，這些啟動子序列可以是源於生物體的基因組DNA序列，也可以是利用化學方法等，人工得到的DNA序列。用於導入FLO基因表達盒進行轉化的馬克斯克魯維酵母(夕X《口 4七 ^ · ^ ^ 5 )菌體，優選使用作為標記的基因突變的突變體。獲取突變基因的方法沒 有特別限制，可以使用現有公知的方法進行。作為利用了 UV照射的方法，例如有Hashimoto 等的方法(Applied andEnvironmental Microbiology, 71 (1) :312_319，2005)。在該方法 中，對於菌體生長的板上的酵母株，從距離35cm處照射UV 20秒，得到0. 05 0. 2%的突 變體。根據該方法，可以得到組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、尿嘧啶(Ura)、蛋 氨酸(Met)、色氨酸(Tri)的營養缺陷型突變株。或者，還有下述的方法將基因破壞盒載 體(Gene Disruption Cassette Vector)等具有與靶基因同源的鹼基序列、不能作為基因 發揮功能的DNA導入細胞中，進行同源重組、使其不活化的方法(日本特開2001-46053號 公報)。當進行無法目測表達的基因的突變時，需要導入標記基因，以能夠通過細胞的藥物 (抗生素等)感受性試驗、細胞的繁殖速度、酶活性試驗、光學方法或營養缺陷試驗來進行 觀察。如上述那樣，作為使用了 FLO基因表達盒的本發明的酵母製備方法，所述FLO基因 表達盒含有營養缺陷型標記基因序列和源於釀酒酵母的FLO基因序列，且可利用上述表達 啟動子控制上述FLO基因的表達這樣來進行設計，可以列舉下述製備方法，其依次含有下 述工序(A) (C) =(A)在釀酒酵母的內源性FLO基因的上遊導入營養缺陷型標記基因序列 和表達啟動子序列來製備釀酒酵母轉化株的工序；(B)由染色體DNA得到含有營養缺陷型 標記基因序列、表達啟動子序列和FLO基因序列的DNA片段的工序，所述染色體DNA源於工 序㈧中製備的釀酒酵母轉化株；(C)將工序⑶中得到的DNA片段作為FLO基因表達盒 導入營養缺陷型基因具有突變的馬克斯克魯維酵母突變體，來製備馬克斯克魯維酵母轉化 株的工序，所述營養缺陷型基因對應於在上述DNA片段中含有的營養缺陷型標記基因。在上述工序(A)中，釀酒酵母轉化株，可以通過在營養缺陷型基因發生突變的釀 酒酵母菌株中導入含有營養缺陷型標記基因序列、源於釀酒酵母的FLO基因序列的轉化用 DNA片段來製備，作為上述營養缺陷型基因發生突變的釀酒酵母菌株，可以使用市售的尿 嘧啶缺陷型基因突變的釀酒酵母BY4700株；尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸的缺陷型基因突變的 釀酒酵母BY4740株；組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶的缺陷型基因突變的釀酒酵母BY4743株；或 I^ig Hashimoto ^ ^iTj ^ (Applied and EnvironmentalMicrobiology, 71(1) 312-319, 2005)製備的尿嘧啶要求性缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母RAK3605等。另外，在上 述轉化用DNA片段的製備中，基於釀酒酵母FLO基因的序列信息，可以使用由從起始密碼子 ATG起、由含有ATG在內、直至第40個鹼基的序列構成的DNA片段，例如，作為包含40個鹼 基的DNA片段的鹼基序列，源於FLOl基因時可以列舉atgacaatgcctcatcgctatatgtttttgg cagtcttta(Seq. No.序歹丨J編號 1),源於 FL05 基因時可以歹丨」舉 atgacaattgcacaccactgcatat ttttggtaatcttgg(Seq. No. 2),源於 FL09 基因時可以歹丨」舉 atgtctctggcacattattgtttactac tagccatcgtca (Seq. No. 3),源於 FL010 基因時可以歹Ij 舉 atgcctgtggctgctcgatatatattttt gaccggcctat(Seq. No. 4)等。將基於這些FLO基因的鹼基序列信息製備的DNA片段退火， 插入到具有表達啟動子序列和營養缺陷型標記基因序列的質粒中，通過利用PCR擴增所需 區域，可以得到FLO基因表達盒用的DNA序列。上述具有表達啟動子序列和營養缺陷型標 記基因序列的質粒沒有特別限制，可以優選列舉質粒URA3-TDH3p (稱為「pST106」)，其根據Turgeon等的方法(Plasmid51 =24-36,2004)製備，具有TDH3p作為表達啟動子，並具有尿
嘧啶缺陷型基因作為營養缺陷型基因。在基因突變株中導入轉化用DNA片段的方法，可以使用導入DNA片段的一般的轉 化方法。可以使用例如接合法、電穿孔法、感受態細胞法、微注射法、粒子炮法等任意的方 法。另外，也可以利用赤田等的方法(特開2005-269920號公報)，在含有鹼金屬離子和聚 乙二醇的培養基中進行熱休克，而導入轉化用DNA片段。在上述工序(A)中，作為使用了尿嘧啶缺陷型基因突變的釀酒酵母BY4700株的 釀酒酵母轉化株的例子，可以列舉導入了 URA3-TDH3p-FL0401的釀酒酵母RAK3977株、導 入了 URA3-TDH3p-FL0405 的釀酒酵母 RAK3979 株、導入了 URA3_TDH3p-FL0409 的釀酒酵母 RAK3981株、或導入了 URA3-TDH3p-FL04010的釀酒酵母RAK3983株等利用以下實施例製備 的轉化株。在上述工序(B)中，作為由源於工序(A)製備的釀酒酵母轉化株的染色體DNA、來 得到編碼FLO基因表達盒的DNA片段的方法，可以列舉下述方法，即，對於上述釀酒酵母轉 化株的染色體DNA，用使用了 SDS(月桂基硫酸鈉)溶液等的通常的方法進行裂解 攪拌 提 取 離心分離的操作，由此進行純化，將經純化的染色體DNA作為模板進行PCR反應的方法。 在上述PCR反應時，通過使用為了擴增含有FLO基因表達盒序列的DNA序列而設計的引物， 可以得到編碼FLO基因表達盒的DNA片段，所述FLO基因表達盒序列含有營養缺陷型標記 基因序列、表達啟動子序列、和FLO基因序列。在上述(C)中，只要是在染色體基因上具有突變的馬克斯克魯維酵母營養缺陷型 突變體，所述染色體基因對應於在上述FLO基因表達盒中含有的營養缺陷型標記基因，則 可以使用任意的營養缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母突變體，可以選擇組氨酸、亮氨 酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸等營養缺陷型基因突變的馬克斯克魯 維酵母突變體。例如，如以下實施例所示，當使用URA3-TDH3p-FL0基因片段作為FLO基因 表達盒時，可以使用尿嘧啶缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母菌株的馬克斯克魯維酵母 RAK3605株來製備。作為使用本發明的製備方法製備的、具有凝集性和耐熱性的酵母，沒有特別限制， 具體可以列舉例如，在尿嘧啶缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母RAK3605株中，導入源 於釀酒酵母RAK3977株的FLO基因表達盒(URA3_TDH3p-FL01)而成的馬克斯克魯維酵 母RAK4299株(保藏號NITE BP-514)，導入源於釀酒酵母RAK3979株的FLO基因表達盒 (URA3-TDH3p-FL05)而成的馬克斯克魯維酵母RAK4300株(保藏號NITE BP-515)，導入 源於釀酒酵母RAK3981株的FLO基因表達盒(URA3_TDH3p-FL09)而成的馬克斯克魯維酵 母RAK4301株(保藏號NITE BP-516)，導入源於釀酒酵母RAK3983株的FLO基因表達盒 (URA3-TDH3p-FL010)而成的馬克斯克魯維酵母RAK4302株(保藏號NITE BP-517)等。並 且，上述4種馬克斯克魯維酵母突變株保藏於獨立行政法人製品評價技術基礎機構(獨立 行政法人製品評価技術基盤機構)專利微生物保藏中心(地址千葉縣木更津市上總鐮足 2-5-8，千葉県木更津市如Τ ^鎌足2-5-8)。在本發明中，作為用於選釋轉化的菌株的培養基，可以是通常使用的酵母培養用 培養基，例如可以使用實施例中列舉的YPD培養基(1%酵母提取物、2%腖、2%葡萄糖)、ΥΜ 培養基(0.3%酵母提取物、0.3%麥芽提取物、0.5%腖、葡萄糖)。對於培養基的碳源、氮源的種類、鹼金屬離子等在培養基中的添加物，只要能夠有效地進行轉化株的選擇，則可 以是任何培養基。對於培養，在25 33°C、優選28 30°C的溫度下進行1 5天、優選 2 3天。下面，列舉實施例來更詳細地說明本發明，但本發明不受這些實施例的限制。實施例1A. URA3-TDH3p 片段的擴增以具有作為標記基因的URA3基因序列、和作為表達啟動子序列的TDH3的pST106 質粒作為模板，使用表1所示的引物進行PCR反應，製備釀酒酵母轉化用的DNA片段。上 述引物以插入PST106質粒的URA3-TDH3p序列的方式進行設計，此外，將釀酒酵母的FL01、 FL05、FL09或FL010基因上遊序列分別以含有40個鹼基的方式進行設計。PCR反應液是 用各自為0. 2μ 1的1對0. 2μΜ的引物、KOD plus緩衝液1. 0 μ 1 (Τ0Υ0Β0社制)、0. 2mM dNTPsl. 0 μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、0· 2mMMgS040. 8 μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、0· 4ng/ μ 1 pST106 質粒 0. 4μ 1、K0D Plus DNA聚合酶0. 2 μ 1 (Τ0Υ0Β0社制)、滅菌水6. 2 μ 1製成的、總體積為10 μ 1 的溶液。反應首先在94°C下加熱1分鐘，然後在94°C下進行20秒的熱變性，在55°C下退 火30秒鐘，在68°C下進行3分鐘的延伸反應，以上反應過程進行30個循環。結果得到分 別具有FLOl、FL05、FL09或FL010基因上遊的同源序列的DNA片段URA3_TDH3p-FL0401、 URA3-TDH3p-FL0405、URA3_TDH3p-FL0409、URA3_TDH3p-FL04010 (以下，有時將這些 DNA 片段統稱為 URA3-TDH3p-FL040s)(圖 1、2)。[表 1]
製備的轉化用DNA片段 (URA3-TDH3p-FL040s)引物-I引物-IIURA3-TDH3p-FL0401FL01-401 ( Seq.No.5) tatttltaattcllglcaccagtaa acagaacalccaaaaggcgcgcccgFL01-402 ( Seq.No.6) taaagactgccaaaaacatatagcg atgaggcaltgtcattttatgtgatURA3-TDH3p-FL0405FL05-401 ( Seq.No.7) caaatgattttclttaaattgatta gcac cac1aaaaaaaggcgcgcccgFL05-402 (Seq.No.8) ccaagattaccaaaaatatgcagtg gtgtgcaattgtcattttatgtgatURA3-TDH3p-FL0409FL09-401 (Seq.No.9) gcaatttaaaaagaacaattgtaca ataaaagccccaaaaggcgcgcccgFL09-402 (Seq.No.10) tgacgatggclaglagtaaacaati atgtgccagagacat1丨tatgtgaURA3-TDH3p-FL04010FL010-401 (Seq.No.ll) tttgttttagggtgcttaatcaaag aacaacaaataaaaaggcgcgcccgFL010-402 (Seq.No.12) ataggccggtcaaaaatatatatci agcagccacaggcattt tatgtgat B. URA3-TDH3p序列向釀酒酵母中的導入
將釀酒酵母BY4700株在放入了 2ml YPD培養基(1 %酵母提取物、2%聚腖、2%葡 萄糖)的試管中接種，在28°C、150rpm的條件下培養一夜。將培養液Iml移入加入了 YPD 培養基9ml的培養皿，在28°C、150rpm的條件下培養5小時。培養液以8500rpm的轉速進 行3分鐘的離心分離，收集細胞，用滅菌蒸餾水清洗一次。殘渣用滅菌蒸餾水100 μ 1溶解。 轉化用的溶液通過將115μ 1 60%的PEG3350、5y 1 4M的醋酸鋰、15μ 1蒸餾水混合來制 備。將細胞裂解液50 μ 1移入加入了轉化用緩衝液135 μ 1的微型離心分離用管中，加入鮭 魚DNAlO μ 1和上述A製備的4種DNA片段(URA3_TDH3p-FL040s)各5 μ 1，使用攪拌機充 分攪拌30秒鐘。將管在42°C下進行40分鐘的熱處理。將轉化後的細胞溶液200 μ 1在選 擇培養基上攤開，在28°C下培養2-3天。隨機採集在缺少尿嘧啶的培養基上生長的細胞菌 落，將轉化細胞分離。使轉化細胞在YPD培養基上生長，並在4°C下保存。C.利用了 PCR的釀酒酵母轉化株的確認l.PCR 用 DNA 的製備將上述B製備的轉化細胞，在放入了 Iml YPD培養基的12孔板的孔中接種，在 28°C下培養20小時。培養後，添加YPD培養基1ml，再在28°C下培養4小時。採集培養液 1. 5ml，轉移至微型離心分離用管中，以12000rpm的轉速進行3分鐘的離心分離後，除去上 清液，用滅菌蒸餾水將殘渣清洗一次。除去蒸餾水，將7. 5 μ 1的細胞轉移至含有2. 5 μ 1 1% SDS的微型離心分離用管中，使用攪拌機充分攪拌30秒。以12000rpm的轉速進行3分 鐘的離心分離，取上清液。上清液用於菌落PCR。2.菌落 PCR菌落PCR使用如表2所示的引物進行。PCR反應液包括0.4μΜ的1對引物各 0. 4 μ 1、KOD Dash 緩衝液 1. 0 μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、0· 2mMdNTPsl. 0μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、KOD Dash DNA聚合酶0. 2 μ 1 (Τ0Υ0Β0社制)、滅菌水4. 0 μ 1，以上述製備的轉化細胞的染色體 DNA5. 0 μ 1作為模板，在總體積為10 μ 1的液體中進行PCR。反應首先在94°C下加熱1分 鍾，然後在94°C下進行20秒鐘的熱變性，在60°C下退火2秒鐘，在74°C下進行4分鐘的延 伸反應，上述反應過程進行30次循環。結果確認，如圖3所示，可製備在釀酒酵母BY4700 株中導入了 URA3-TDH3p-FL040s的轉化株。這裡製備的4種釀酒酵母的轉化株，是在內源 性的？11)1111)5、？11)9或？11)10基因的上遊含有作為選擇標記的URA3基因序列、和TDH3啟 動子序列的轉化株。[表 2]
權利要求
具有凝集性和耐熱性的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)轉化株的製備方法，其特徵在於，依次含有下述工序(A)～(C)(A)在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的內源性FLO基因的上遊導入標記基因序列和表達啟動子序列來製備釀酒酵母轉化株的工序；(B)由染色體DNA得到含有標記基因序列、表達啟動子序列、和FLO基因序列的DNA片段的工序，所述染色體DNA源於工序(A)中製備的釀酒酵母轉化株；(C)將工序(B)中得到的DNA片段作為FLO基因表達盒導入馬克斯克魯維酵母，製備馬克斯克魯維酵母轉化株的工序。
2.根據權利要求1所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵在於，釀酒酵 母的內源性FLO基因是選自FLO1基因、FL05基因、FL09基因、和FLO10基因中的1種以上 的FLO基因。
3.根據權利要求1或2所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵在於，標記 基因為營養缺陷型標記基因。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵 在於，營養缺陷型標記基因是組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精 氨酸的至少1種的營養缺陷型基因。
5.根據權利要求4所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵在於，營養缺 陷型標記基因是URA3基因。
6.根據權利要求1 5中任一項所述的製備方法，其特徵在於，馬克斯克魯維酵母是在 組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1種的營養缺陷型 基因中具有突變的馬克斯克魯維酵母突變體。
7.根據權利要求1 6中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵 在於，表達啟動子是3-磷酸甘油醛脫氫酶(TDH3)啟動子。
8.根據權利要求1 7中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵 在於，將線狀的DNA片段作為FLO基因表達盒導入馬克斯克魯維酵母。
9.根據權利要求1 8中任一項所述的馬克斯克魯維酵母轉化株的製備方法，其特徵 在於，馬克斯克魯維酵母轉化株是RAK4299株(NITEBP-514)、RAK4300株(NITE BP-515)、 RAK4301 株(NITE BP-516)、或者 RAK4302 株(NITE BP-517)。
10.由權利要求1 8中任一項所述的製備方法製備的、具有凝集性和耐熱性的馬克斯 克魯維酵母轉化株。
11.根據權利要求10所述的馬克斯克魯維酵母轉化株，其特徵在於，其是RAK4299株 (NITE BP-514)、RAK4300 株(NITE BP-515)、RAK4301 株(NITE BP-516)、或者 RAK4302 株 (NITE BP-517)。全文摘要
通過將外源的凝集性基因導入馬克斯克魯維酵母菌，提供適於生物乙醇的工業生產的、具有耐熱性和凝集性的新型馬克斯克魯維酵母轉化株，以及該轉化株的有效製備方法。作為用於賦予馬克斯克魯維酵母凝集性的外源基因，本發明釀酒酵母的凝集性基因FLO，製備了含有已知表達啟動子序列和源於釀酒酵母的FLO基因序列的線狀DNA片段。將該線狀DNA片段導入馬克斯克魯維酵母菌，結果，確認能夠高效地得到馬克斯克魯維酵母轉化株，同時作為預料之外的結果，確認上述轉化株的凝集性顯著提高，從而完成了本發明。
文檔編號C12N15/09GK101983240SQ20098010751
公開日2011年3月2日 申請日期2009年3月18日 優先權日2008年3月18日
發明者B·M·A·阿布戴樂-巴納特, S·農克朗, 星田尚司, 赤田倫治 申請人:國立大學法人山口大學