用於治療疾病的b亞組腺病毒載體的製作方法

2023-09-19 16:46:50 1

專利名稱：用於治療疾病的b亞組腺病毒載體的製作方法
技術領域：
本文描述的發明涉及使用人類B亞組腺病毒治療疾病的領域。
背景技術：
條件複製型病毒代表了一種新型的、有前途的抗癌劑。已開發出人5型腺病毒(Ad5)衍生物，它們選擇性的在癌症細胞中複製並將其殺死。這種病毒的原型，ONYX-015，一種C亞組腺病毒，已在I期和II期臨床試驗中被證實對復發性頭頸癌患者和肝轉移性疾病患者具有令人鼓舞的效果。
為了使腺病毒在細胞內有效複製，腺病毒的E1b基因產物p55與宿主細胞p53蛋白形成複合物，從而隔離和/或滅活p53並產生p53功能缺陷的細胞。這樣的p53功能缺陷的細胞可支持腺病毒的複製。以此方式，野生型腺病毒能在含p53的細胞內複製，因為腺病毒p55蛋白滅活和/或隔離了宿主細胞p53蛋白。Onyx-015是含有編碼突變p55蛋白的E1b位點的重組腺病毒，當將它被施用於含有能被該重組腺病毒感染的腫瘤細胞的個體或細胞群時，所述的突變p55蛋白基本上不能與感染細胞內的p53蛋白形成功能性複合物。在被感染的非腫瘤細胞中重組腺病毒基本上不能有效地隔離p53蛋白導致所引入的重組腺病毒多核苷酸在非腫瘤細胞中不能表達複製表型。相反，缺乏功能性p53蛋白的腫瘤細胞可支持所引入的重組腺病毒的複製表型表達，所述的重組腺病毒通過腺病毒細胞病變效應和/或與複製表型相關的負選擇基因的表達導致腫瘤細胞的消除。
從正在進行的Onyx-015臨床試驗中得到的一個經驗是，似乎效力比毒性更局限了它的治療效益。迄今為止，未觀察到劑量限制性的毒性。增強腫瘤消解性病毒臨床效力的一個策略是將它們與其它療法相結合，例如標準的化療，或者使它們具有抗癌基因，諸如抗血管形成因子、細胞毒性劑、前藥轉換酶或細胞因子等。可與化療和抗癌基因相結合的另一種方法是從遺傳學上改造病毒使其更有效，即複製更快，產生更多的病毒後代，以及增強組織和/或細胞類型特異性等。此處的目的是產生更迅速、更有選擇性殺死癌症細胞、並最終根除癌症的治療用病毒。
所述治療策略的關鍵點取決於腺病毒進入靶細胞的能力。此過程包括多個步驟，現認為是從所述病毒通過腺病毒纖維絲-結節蛋白與其細胞受體CAR結合而附著於細胞上開始的(Bergelson et al.(1997)Science 2751320-1323)。在第二步中，通過αvβ3和αvβ5整合素與腺病毒五鄰體基底的RGD-結構域相互作用介導病毒的內化(Wickham et al.(1993)Cell 73309-319；Mathiaset al.(1994)J.Virol.686811-6814)。內化後，病毒顆粒向核膜轉移。在此過程中，衣殼被去除且病毒DNA最後釋放入病毒DNA起始複製的核中。細胞上CAR的存在看來是腺病毒感染效力的主要決定因素。相反，與包括avβ3和avβ5整合素在內的二級腺病毒受體的表達無關(Hemmi等(1998)Hum Gene Ther.92363-2373)。
利用C亞組腺病毒治療癌症的可能缺點有兩個。
首先，最近的實驗工作已顯示，在患有某些形式癌症的患者中，與體外和體內的正常細胞相比，腫瘤細胞中的CAR表達都有所減少。RT-PCR和Western印跡分析發現，CAR表達水平和腺病毒轉染效力之間有良好的相關性。(Jee YS，Lee SG，Lee JC，Kim MJ，Lee JJ，KimDY，Park SW，Sung MW，Heo DS.Anticancer Res 2002 Sep-Oct；22(5)2629-34)。此外，將CAR轉染入無內源性CAR表達的人膀胱癌細胞使這些細胞的感染能力顯著提高(Li et al.(1999)Cancer Res.59325-330)。
與利用C亞組腺病毒進行癌症治療相關的第二個缺點是在肝細胞中存在CAR，它具有促進病毒在肝臟中積聚的不良副作用。屬於B體系和最佳串聯纖維體系的B亞組病毒顯示出肝轉導較Ad5纖維載體低兩個數量級以上(Schoggins JW，Gall JG，Falck-PedersenE.JVirol 2003 Jan；77(2)1039-48)。
如上所述，腫瘤消解性腺病毒原型是Onyx 015，它是C亞組病毒。由於上述原因，從C亞組病毒構建得到的腺病毒載體具有某些限制其腫瘤消解潛能的特性。為了給醫師提供另一種腫瘤消解病毒，生產具有Onyx 015特性和B亞組腺病毒特性的腺病毒將會是有益的。
科學和專利文獻方面均有報導描述了B亞組腺病毒的遺傳特性，包括這些病毒某些區域的核苷酸序列。
WO0240693A1顯示了腺病毒複製子，包含具有來自Ad5的DNA和B亞組腺病毒DNA之間的融合體的重組腺病毒。
WO0240665顯示了能夠與基於來自B亞組、優選腺病毒第35型的血清型的重組腺病毒互補的包裝細胞系。
WO0227006顯示了用對骨骼肌細胞具有向性的衍生自腺病毒的基因投遞載體轉導所述細胞的手段和方法。該基因投遞載體至少包含B亞組腺病毒纖維蛋白的向性決定部分。
WO0052186描述了對成纖維細胞樣或巨噬細胞樣細胞具有組織向性的腺病毒B亞組核酸投遞載體。
WO0031285提供了對平滑肌細胞和/或內皮細胞具有組織向性的核酸投遞載體。在一個方面，核酸投遞載體是B亞組腺病毒的病毒衣殼。
WO8906282描述了具有經修飾的自抑制功能結構域的人類腺病毒B1亞組功能突變型E1A基因。
美國專利號6,492,169展現了與基於來自B亞組、優選腺病毒第35型的血清型的重組腺病毒互補的包裝細胞系。
美國專利號5,770,442顯示了包含B亞組腺病毒嵌合纖維蛋白的重組腺病毒。
美國專利號4,920,211顯示了具有經修飾的自抑制功能結構域的人類腺病毒B1亞組的功能突變型E1A基因，它對表達可刺激而不淨抑制控制E1A突變基因的啟動子的E1A產物是有效的。
附圖簡述

圖1顯示了人類B亞組腺病毒第3型的完整核苷酸序列以及編碼E1B 55K蛋白質的區域。
圖2顯示了人類B亞組腺病毒第34型的完整核苷酸序列以及編碼E1B 55K蛋白質的區域。
圖3顯示了人類B亞組腺病毒第3型的E1A區的cDNA核苷酸序列。
圖4顯示了人類B亞組腺病毒第3型的cDNA編碼的E1A區的胺基酸序列。
圖5顯示了人類B亞組腺病毒第34型E1A區的cDNA核苷酸序列。
圖6顯示了人類B亞組腺病毒第34型的cDNA所編碼的的E1A區的胺基酸序列。
圖7顯示了人類B亞組腺病毒第3型的開放讀碼框6的DNA序列。
發明概述本發明的一項特色是對重組溶瘤人類B亞組腺病毒的描述。
本發明還展現了人類B亞組腺病毒第3型和第34型的全長基因組序列。
在另一個方面，本發明包括重組人類B亞組腺病毒以及由它衍生的重組病毒載體用於表達異源DNA序列的用途。
本發明的另一個實施方案涉及基於B亞組第3型和第34型的人類腺病毒表達載體系統，其中E1和E3基因區之一或二者的部分或全部被缺失。
本發明的一項特色是對重組溶瘤人類B亞組腺病毒的描述，所述腺病毒缺乏能夠結合功能性腫瘤抑制基因產物的病毒癌蛋白的表達，而且主要通過不依賴CAR的機制感染細胞。
本發明的另一項特色是對溶瘤人類B亞組腺病毒的描述，所述腺病毒缺乏能夠結合功能性腫瘤抑制基因產物的病毒癌蛋白的表達。
本發明的另一個方面涉及人類B亞組腺病毒，所述腺病毒缺乏編碼功能性E1A或E1B 55K病毒癌蛋白的能力。
本發明的還有一個方面是對使用重組人類B亞組腺病毒治療疾病的描述。
在充分考慮下文後，本發明的這些和其它方面對於本領域熟練從業人員而言將是顯而易見的。
發明詳述收錄本專利全文引用的所有出版物和專利申請書作為參考，其程度與專門和個別地指示完整收錄每一出版物或專利/專利申請書相同。
除非另有說明，本發明的實踐將採用常規微生物學、免疫學、病毒學、分子生物學、和重組DNA技術，它們屬於本領域的技術範圍之內。這些技術在文獻中有充分說明。參閱，例如，Maniatis等，《分子克隆實驗室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(1982年)；《DNA克隆實用方法》(DNA CloningA PracticalApproach)，第1卷和第2卷(D.Glover編)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait編(1984年))；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.Hames和S.Higgins編(1985年))；《轉錄和翻譯》(Transcription and Translation)(B.Hames和S.Higgins編(1984))；《動物細胞培養》(AnimalCell Culture)(R.Freshney編(1986年))；Perbal，《分子克隆實用指導》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984年)；Sambrook等，《分子克隆實驗室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第2版)；第1卷、第2卷、和第3卷。還可參閱Hermiston T.等，《分子醫學方法腺病毒方法和方案》(Methodsin Molecular MedicineAdenovirus Methods and Protocols)，W.S.M.Wold編，Humana出版社，1999年。
A.定義除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。儘管與本文所述相似或相當的任何方法和材料都可用於本發明的實踐或測試，然而本文描述的方法和材料是優選的。
美國專利號5,677,178和5,801,029中列出的定義可用於本文，而且包括下列術語。
「複製缺陷型病毒」指優先抑制支持病毒複製表型表達的預定細胞群(例如本質上缺乏p53和/或RB功能的細胞)中的細胞增殖且在包含非複製性未轉化細胞特徵性的正常p53或RB水平的細胞中本質上不能抑制細胞增殖、誘導凋亡、或表達複製表型的病毒。通常，複製缺陷型病毒在包含正常p53或RB功能的細胞中展示噬斑形成效率實質性降低。
在用於本文時，術語「p53功能」指具有基本正常水平的p53基因所編碼多肽的特性(即，相對於同一組織類型的非腫瘤細胞而言)，其中p53多肽能夠結合C亞組野生型腺病毒第34型的E1b p55蛋白質。例如，p53功能可通過生成無活性(即突變體)形式的p53或者通過p53多肽表達的大量降低或完全失去而喪失。此外，在含編碼野生型p53蛋白質的p53等位基因的腫瘤細胞中，p53功能也可能基本上缺失，例如，在p53位點之外的遺傳變異，諸如導致p53異常亞細胞加工或定位的突變(例如，導致p53定位主要在細胞質而非細胞核中的突變)，或者p53作用分子的喪失或失活，可導致p53功能的喪失。也就是說，p53作用的生化途徑可能有所變化，也會引起p53功能的喪失。
在用於本文時，術語「複製表型」指受到病毒(諸如複製缺陷型腺病毒)感染的細胞的下列表型特徵中的一項或多項(1)實質性表達由病毒晚期基因啟動子啟動的晚期基因產物，諸如衣殼蛋白(例如腺病毒五鄰體基底多肽)或RNA轉錄本；(2)病毒基因組的複製或複製中間物的形成；(3)病毒衣殼的裝配或包裝好的病毒粒子；(4)受感染細胞中細胞病理效應(CPE)的出現；(5)病毒裂解周期的完成；和(6)在受到編碼功能性癌蛋白的野生型可複製DNA病毒感染的非腫瘤細胞中消除p53功能後常常偶發的其它表型變化。複製表型包括至少一種所列表型特徵，優選超過一種上述表型特徵。
術語「抗腫瘤複製缺陷型病毒」在用於本文時指具有在人體中通過相對於受感染的相同組織學細胞類型的非複製、非腫瘤細胞而言優先殺死受感染的腫瘤細胞來抑制腫瘤發展或進展的功能特性的重組病毒。
在用於本文時，「癌」或「腫瘤」指展示相對自主生長、因而展示異常生長表型(其特徵是顯著喪失對細胞增殖的控制)的細胞。
在用於本文時，術語「可操作連接」指處於功能關聯的多核苷酸的連接。在將核酸置於另一種核酸序列的功能關聯中時，它與後者是「可操作連接的」。例如，若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與編碼序列是可操作連接的。可操作連接意味著相連的DNA序列通常是毗鄰的，而且，對於連接兩個蛋白質編碼區時應該是毗鄰且處於同一讀碼框。然而，由於增強子通常在與啟動子相隔數千鹼基時仍發揮功能，而且內含子序列的長度可變，因此有些多核苷酸元件可以是可操作相連的、但並不毗鄰。
在用於本文時，「生理學條件」指具有與完整哺乳動物細胞或者存活哺乳動物的組織間隙或器官中的條件基本相似的離子強度、pH、和溫度的水性環境。通常，生理學條件包括含有大約150mM NaCl(或可選地KCl)、pH 6.5-8.1、且溫度大約20-45℃的水性溶液。通常，生理學條件是適合於生物學大分子的分子間結合的結合條件。例如，150mM NaCl、pH 7.4、37℃的生理學條件通常是合適的。
DNA「編碼序列」指處於合適調控序列的控制下時在體內轉錄並翻譯成多肽的DNA序列。編碼序列的邊界是由位於5′(氨基)末端的起始密碼子和位於3′(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定的。編碼序列可以包括但不限於原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核生物(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列、病毒DNA、甚至合成的DNA序列。多聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常位於編碼序列的3′端。
「轉錄啟動子序列」指能夠在細胞中結合RNA聚合酶並啟動下遊(3′方向)編碼序列轉錄的DNA調控區。為了定義本發明，啟動子序列在3′端連接編碼序列的翻譯起始密碼子(ATG)，並且向上遊(5′方向)延伸至包括啟動高於背景的可檢測水平轉錄所必需的最小數目鹼基或元件。
DNA「控制序列」是啟動子序列、核糖體結合位點、剪接信號、多聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上遊調控結構域、增強子、翻譯終止序列等的總稱，它們在宿主細胞中共同提供編碼序列的轉錄和翻譯。
當細胞中RNA聚合酶將結合啟動子序列並將編碼序列轉錄成mRNA、後者繼而翻譯成由編碼序列編碼的多肽時，則編碼序列「可操作連接」控制序列或受其控制。
「宿主細胞」指已經過外源DNA序列的轉化或者能夠轉化的細胞。
當兩種多肽序列在確定的長度中至少大約80％(優選至少大約90％，且最優選至少大約95％)的胺基酸相匹配時，則兩種多肽序列是「本質上同源的」。
若兩種DNA序列是相同的或不超過40％的核苷酸、優選不超過大約30％的核苷酸(即至少大約70％同源)、更優選大約20％的核苷酸、且最優選大約10％的核苷酸是不同的，則它們是「本質上同源的」。
可以在例如針對特定系統定義的嚴謹條件下在Southern雜交實驗中鑑定本質上同源的DNA序列。高度嚴謹條件將包括在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中於65℃與結合在濾膜上的DNA雜交，並在0.1×SSC/0.1％SDS中於68℃清洗(Ausubel，F.M.等編，1989年，分子生物學通用方案Current Protocols inMolecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates公司，和John Wiley Sons公司，紐約，第2.10.3頁)。確定合適的雜交條件屬於本領域技術範圍之內。參閱，例如，Maniatis等，見上文；DNA Cloning，第1卷和第2卷，見上文；核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)，見上文。
DNA構建體的「異源」區指位於另一種DNA分子內或附著於另一種DNA分子上且在自然界中沒有發現與該另一種分子相關聯的可識別DNA區段。
「融合蛋白」常常定義為包含編碼前導序列或穩定多肽的第一區域和編碼異源蛋白質的第二區域的基因的表達產物。它包括包含抗原性蛋白片段或全長腺病毒蛋白序列以及異源序列的多肽，所述異源序列通常是前導序列，其功能是實現胞內表達多肽在重組宿主中的分泌。抗原性蛋白片段的長度常常是大約5-7個胺基酸。
「重組」多肽指通過重組DNA技術生成的多肽。
「本質上純的」蛋白質將不含其它蛋白質，優選至少10％均一，更優選60％均一，且最優選95％均一。
「傳染性」指具有將腺病毒基因組投遞到細胞中的能力。
「CAR」指感染和進入宿主細胞的過程中C亞組腺病毒相結合的細胞上的受體。它是Coksakie腺病毒受體的首字母縮略詞。
「溶瘤」指本發明人類B亞組腺病毒以相對於正常細胞的實質選擇性殺死腫瘤細胞、即同時基本上不傷害正常細胞的能力。
B.通用方法B亞組腺病毒基因組/編碼區人B亞組腺病毒基因組可獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。病毒，優選來自B亞組第3和34型的病毒，可用本領域眾所周知的材料和方法增殖，包括A549細胞和標準的感染和培養技術。Hermiston，T.等，分子醫學方法腺病毒方法及流程(Methods in Molecular MedicineAdenovirus Methods andProtocols)，W.S.M.Wold編輯，Humana Press，1999。病毒可用一種或多種技術進行純化，包括氯化銫梯度條帶離心。例如可參閱美國專利5,837,520和美國專利6,008,036。
通過在裂解溶液中裂解病毒顆粒可以製備供測序的病毒DNA，該裂解溶液優選包括10mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，0.6％SDS和1.5mg/ml鏈黴蛋白酶(Sigma Corporation)。該溶液優選是37℃。
用酚/氯仿提取裂解的病毒顆粒，並用乙醇沉澱病毒DNA。將純化的病毒DNA溶於重蒸水中並用於DNA測序。
然後，用適當的限制性酶對來自B亞組腺病毒第3或34型的病毒DNA進行限制性酶切，優選用Sau 3AI，隨後用1％的瓊脂糖凝膠分離酶切後的DNA。用商品化的DNA凝膠提取試劑盒(Qiagen Corporation)純化大小在0.8kb和1.2kb之間的片段，並隨後克隆入預先用相匹配的限制性酶消化的適當載體中。如實施例中所進一步描述的，可用BamHI消化載體pGem-7zf(+)(Promega Corporation)。
接著，用自動測序儀CEQ20000XL(Beckman)和標準的T7和SP6測序引物對數百個單獨克隆進行測序。用SeqMan軟體(DNAStar Inc.)建立毗連序列群(contigs)。基於已建立的序列，合成寡核苷酸並可進行引物步行法直至所有的毗連序列群都連接起來。如下所述，至少進行兩次獨立的測序以覆蓋大部分區域。
本發明公布了人B亞組第3和34型的完整核苷酸基因組序列。分別參閱圖1和圖2。
此外，還顯示了這些病毒的某些區域的核苷酸序列，包括E1A(圖3和5分別對應於第3和34型)以及E1A區域的胺基酸序列(圖4和6分別對應於第3和34型)。對於腺病毒第3和34型而言，也對編碼55K蛋白的E1B區的核苷酸編碼序列以及它們的胺基酸序列分別如圖1和圖2所示。
除了人B亞組腺病毒第3和34型的基因組序列之外，也對這些病毒的多個區域進行測序並確定了胺基酸序列。如圖3。
重組子在某一實施方案中，本發明確定並提供了一種缺失人B亞組腺病毒部分或全部核苷酸序列(包括E1區域，尤其是E1B區域和/或E3區域)的方式。如果需要，可插入編碼外源基因或其片段的異源或同源核苷酸序列以產生人腺病毒重組體。所謂「缺失部分核苷酸序列」是指利用常規的遺傳工程技術缺失E1和/或E3區域部分的核苷酸序列。
利用本領域公認的技術完成插入，包括但不局限於，限制性酶切、核酸酶消化、連接、激酶和磷酸酶處理、DNA聚合酶處理、逆轉錄酶處理和化學寡核苷酸合成。將目的外源核酸序列克隆入質粒載體，從而使外源序列兩側連接與其待定向插入的腺病毒基因組區域基本上同源的序列。然後將這些構建體引入被目的B亞組病毒共感染的宿主細胞中。在感染期間，這些構建體和腺病毒基因組之間將發生同源重組，從而產生重組腺病毒載體。如果插入發生在腺病毒基因組的必需區，則重組腺病毒載體將在補充由於該插入而喪失的病毒功能的輔助細胞系中增殖。
優選的腺病毒缺失是編碼癌蛋白55K的E1B區域全部或部分被去除的缺失。此缺失導致產生複製缺陷的B亞組腺病毒。類似的，通過在E1B區進行選擇突變，有可能產生複製缺陷的B亞組腺病毒。參閱美國專利6,080,578。所述的複製缺陷型B亞組腺病毒對於缺乏p53功能的腫瘤細胞而言將具有腫瘤消退的作用，且主要通過非CAR機制感染腫瘤細胞。因為CAR高水平的存在於肝細胞中且在腫瘤細胞中常常有所減少，因此與例如C亞組腺病毒相比較而言，B亞組複製缺陷型腺病毒將具有增強的全身活性，不易被肝所攝取。因此，當與C亞組腺病毒相比較時，它將同時呈現出較高水平的腫瘤消退活性。
在本發明的備選實施方案中，可以構建這樣的重組B亞組腺病毒，其中包含在編碼E1a癌蛋白的E1a位點中的缺失或突變，這會造成E1a蛋白質基本上不能與被感染細胞中的RB蛋白形成複合物。參閱，例如，美國專利5,801,029。
此類型重組B亞組病毒的優勢在於它基本上不能有效隔離被感染的非腫瘤細胞中的RB蛋白，這導致所引入的重組腺病毒不能在非腫瘤細胞中表達複製表型。相反，缺乏功能性RB蛋白質的腫瘤細胞則通過引入的重組腺病毒而支持複製表型的表達，從而通過腺病毒的致細胞病變效應導致腫瘤細胞的消融。
在這些實施方案的優選變化方案中，重組B亞組腺病毒包含編碼突變E1a蛋白的E1a位點，此突變的E1a蛋白缺乏能結合pRB(和/或300kD多肽和/或107kD多肽)的結構域，但包含能反式激活腺病毒早期基因的功能性E1a結構域。有關這些實施方案的其它變化形式包括重組腺病毒包含基本上不能表達可結合併滅活pRB的蛋白質的非功能性E1a位點。
在另一實施方案中，本發明提供了高效構建、分離和增殖E3缺陷型重組B亞組腺病毒(有或無異源序列插入)的組合物和方法。這包括在適當的細胞系中分離重組病毒，表達腺病毒E1功能或相應的細胞系，以及在適當的宿主細胞中通過同源重組構建重組基因組、將由此獲得的重組基因組轉染入適當的細胞系中以及從被轉染的細胞中分離重組病毒的方法，參閱，例如，美國專利6,492,169。
在本發明的某一實施方案中，重組腺病毒B亞組表達盒可通過用一種或多種適當的限制性酶切割野生型基因組產生病毒限制性片段而獲得，所述的病毒限制性片段分別包括，例如E1，優選編碼結合pRB的癌蛋白的E1A、或者編碼結合p53的55K蛋白的E1B，或者E3區序列。病毒限制性酶切片段可插入諸如質粒等克隆載體中，然後可將至少一種異源序列(可以編碼或不編碼外源蛋白質)插入攜帶或未攜帶可操作性連接的真核轉錄調控序列的選定病毒區中。使重組表達盒與B亞組腺病毒基因組接觸，並通過在適當的宿主細胞中進行同源重組或其它常規遺傳工程方法獲得預期的重組體。
適當的宿主細胞包括會支持B亞組腺病毒基因組和含病毒序列的質粒之間、或者各自包含病毒序列的兩個或多個質粒之間進行重組的任何細胞。重組可在諸如大腸桿菌等原核細胞中進行，而為了產生病毒顆粒而進行的含病毒基因組的質粒轉染則在真核細胞中完成，優選哺乳動物細胞，更優選293細胞及它們的同等物。細菌細胞培養物的生長以及真核細胞和哺乳動物細胞系的培養和維持方法是本領域技術人員眾所周知的。
可將一種或多種異源序列插入腺病毒B亞組基因組的一個或多個區域以產生重組病毒載體，這隻受病毒基因組插入容量以及重組病毒載體表達所插入的異源序列的能力所限制。以此方式可產生融合蛋白質。通常，腺病毒基因組可接受大約為5％基因組長度的插入片段而仍能被包裝入病毒顆粒中。通過缺失非必需區和/或缺失其功能可由輔助細胞系提供的必需區，可增加插入的容量。
在本發明的某一實施方案中，通過構建質粒完成插入，該質粒中含有插入片段預期插入的B亞組腺病毒基因組區域。然後將所述質粒用在質粒的病毒部分具有識別序列的限制性酶消化，並將異源序列在該限制性酶消化位點插入。將含有攜帶已插入異源序列之病毒基因組部分的質粒與腺病毒基因組或含腺病毒基因組的線性化質粒一起共轉化入細菌細胞(諸如，大腸桿菌)中，其中的腺病毒基因組可以是全長的基因組或者可以含有一個或多個缺失。質粒之間的同源重組產生了含有已插入的異源序列的重組腺病毒基因組。
為了提供異源序列插入的位點或者為了獲得在不同位點進行插入的額外能力，可通過本領域技術人員眾所周知的方法完成腺病毒B亞組序列的缺失。例如，為了將序列克隆入質粒中，可用一種或多種限制性酶(在病毒插入片段中具有至少一個識別序列)消化並隨後連接，在某些情況下這會導致限制酶識別位點之間序列的缺失。
或者，在病毒插入片段內單一限制酶識別位點處的消化，隨後用核酸外切酶處理後再連接，會導致鄰近限制位點的病毒序列被缺失。如上所述構建的包含具有一個或多個缺失的一個或多個腺病毒基因組部分的質粒可與腺病毒B亞組基因組(全長或缺失型)或含有全長或部分缺失型病毒基因組的質粒一起共轉染入細菌細胞中，通過同源重組產生含有在一個或多個特異位點具有缺失的病毒基因組的質粒。然後，通過用含有重組病毒基因組的質粒轉染哺乳動物細胞，可以獲得包含缺失的B亞組病毒。
在本發明的某一實施方案中，插入位點可鄰近腺病毒啟動子或在其下遊(在轉錄意義上)。本領域技術人員可很容易的從此處所提供的B亞組腺病毒核苷酸序列中確定啟動子的位置和用作插入位點的限制性酶識別序列。或者，可利用各種體外技術在特殊位點插入限制酶識別序列或者在不含限制酶識別序列的位點處插入異源序列。所述方法包括，但不局限於，用於插入一個或多個限制酶識別序列的寡核苷酸介導的異源雙鏈核酸分子形成(參閱，例如，Zoller等(1982)Nucleic Acids Res.106487-6500；Brennan等(1990)Roux′s Arch.Dev.Biol.19989-96；和Kunkel等(1987)Meth.Enzymology 154367-382)以及用於插入較長序列的PCR-介導的方法。參閱，例如Zheng等，(1994)Virus Research 31163-186。
如果異源序列另外包含在真核細胞中有活性的轉錄調控序列，也可能獲得插入在並非腺病毒B亞組啟動子下遊的位點處的異源序列的表達。
本發明還提供了可用於調控異源基因表達的腺病毒B亞組調控序列。調控序列可以是，例如，轉錄調控序列、啟動子、增強子、上遊調控結構域、剪接信號、聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、翻譯調控序列、核糖體結合位點和翻譯終止序列。
在另一實施方案中，本發明鑑定並提供了B亞組腺病毒基因組(和其片段)的其它區域，其適於插入編碼外源基因或其片段的異源或同源核苷酸序列，以產生病毒重組體。在另一實施方案中，B亞組腺病毒基因組克隆可作為質粒增殖，並且可從含質粒的細胞中收穫傳染性病毒。
腺病毒核酸的存在可用本領域技術人員已知的技術檢測，包括但不局限於，雜交試驗、聚合酶鏈式反應以及其它類型的擴增反應。類似的，蛋白質檢測的方法也是本領域技術人員眾所周知的，包括但不局限於，各種類型的免疫檢測法、ELISA、Western印跡、酶促檢測法、免疫組化等。各種外源基因或核苷酸序列或編碼序列(原核和真核的)可依照本發明插入腺病毒核苷酸序列中，例如DNA。
異源核苷酸序列可由一種或多種目的基因組成，優選有治療效用的基因。在本發明的上下文中，目的基因可編碼諸如幹擾素和白介素等細胞因子；淋巴因子；負選擇劑(例如，胸苷激酶)；諸如被致病生物體(病毒、細菌或寄生蟲)所識別的受體等膜受體，優選被HIV病毒(人免疫缺陷病毒)識別的受體；或編碼生長因子的基因。此名單並非限制性的，其它目的基因也可用於本發明的上下文中。
目的基因可以是基因組形式、互補DNA(cDNA)形式或混合形式(微型基因，其中至少一個內含子被缺失)。它可編碼成熟的蛋白質、成熟蛋白質的前體、特別是意圖被分泌並因此含有信號肽的前體、由多種來源的序列相融合所產生的嵌合蛋白質或者展示改良或修飾的生物學特性的天然蛋白質突變體。所述的突變體可通過天然蛋白質編碼基因中一個或多個核苷酸的缺失、取代和/或添加，或者諸如轉座或倒置等天然蛋白質編碼序列中任何其它類型的變化來獲得。
可將目的基因置於適於其在宿主細胞中表達的元件(DNA調控序列)控制下。合適的DNA調控序列被認為是指將基因轉錄成RNA(反義RNA或mRNA)以及mRNA翻譯成蛋白質所需的一套元件。在轉錄所需的元件中，啟動子被認為特別重要。它可以是組成型啟動子或調控型啟動子，且可分離自真核、原核或病毒來源及甚至腺病毒來源的任何基因。或者，它可以是目的基因的天然啟動子。通常，可對用於本發明的啟動子進行修飾以便包含調控序列。可以使用例如允許在大量細胞類型中表達的各種啟動子，包括HSV-1TK(1型皰疹病毒胸苷激酶)基因啟動子、腺病毒MLP(主要的晚期啟動子)、尤其是人2型腺病毒的啟動子、RSV(勞氏肉瘤病毒)LTR(長末端重複片段)、CMV(巨細胞病毒)早期啟動子和PGK(磷酸甘油酸激酶)基因啟動子。
可有效用於調控B亞組腺病毒重組體複製或其基因表達的啟動子是E2F啟動子，如美國專利09/714,409或EPA 1230378中所述。
通過構建重組六鄰體和/或纖維基因可將重組B亞組腺病毒載體定向於特定的細胞類型。這些基因的蛋白質產物涉及宿主細胞的識別；因此，可將所述基因修飾成含有允許病毒識別備選宿主細胞的肽序列。
也可能只可使用基因核苷酸序列的片段(其中這些片段足以產生保護性免疫反應或特異的生物學效應)而非在野生型生物體中所發現的完整序列。
如果有可能，可以使用合成的基因或其片段。無論如何，本發明可利用廣泛類型的基因、片段等，而並不局限於上文所提出的那些基因。
在某些情況下，特定抗原的基因可包含大量的內含子，或者可來自RNA病毒，在這些情況下可使用互補DNA拷貝(cDNA)。
為了使基因能成功的表達，可將其與合適啟動子(包括增強子元件和多聚腺苷酸化序列)一起插入表達載體中。使得外源基因得以在哺乳動物細胞中成功表達的許多真核啟動子和聚腺苷酸化序列以及如何構建表達盒的方法都是本領域所已知的，例如在美國專利5,151,267中有所描述，其內容在此收編作為參考。依照已知的標準選擇啟動子，以使免疫原性蛋白質得到最佳表達，並隨之成功的產生體液型、細胞介導型和黏膜型免疫反應。
本發明還包括藥物組合物，其中含有治療有效量的重組人腺病毒B亞組病毒或依照本發明方法製備的來源於它的載體，並且與藥用可接受載體和/或佐劑相聯合。可依照本領域眾所周知的技術製備所述的藥物組合物並確定劑量。本發明的藥物組合物可通過任何已知的施用途徑施用，包括但不局限於，全身性的(例如，靜脈內、氣管內、血管內、肺內、腹膜內、鼻內、腸胃外的、經腸道、肌肉內、皮下、腫瘤內或顱內)施用或氣霧化施用或肺內灌輸。可單劑量施用或在某些時間間隔後一次或多次重複施藥。適當的施用途徑和劑量將隨條件而變化(例如，被處理的個體、待治療的病症或者目的基因或多肽)，但可由本領域技術人員決定。
在本發明的另一實施方案中，通過用表達所述載體所缺乏的功能的病毒共感染細胞，可補充(提供互補細胞系)E1功能(或在任一具體病毒載體中可能突變或缺失的其它病毒區域的功能)。
本發明還包括含有B亞組腺病毒表達載體的表達體系，其中例如DNA等異源核苷酸序列取代了部分或全部E3區、部分或全部E1或E1B區、部分或全部E2區、部分或全部E4區、E4和基因組右末端之間的部分或全部區域、部分或全部晚期區域(L1-L7)以及/或者部分或全部被五鄰體基因所佔據的區域。其中DNA等外源核苷酸序列受到或未受到任何其它異源啟動子調控的表達體系都可使用。
本發明在人類基因治療方面的實施旨在預防或治療包括癌症、心血管疾病等病患，但不局限於這些疾病。當應用於治療癌症時，腺病毒載體可與化學療法聯合使用。就本發明的目的而言，用本發明方法製備的載體、細胞和病毒顆粒可離體引入受試者中(即，在取自患者的一個或多個細胞中)，或者直接引入待治療的個體體內。優選地，宿主細胞是人細胞，更優選是肺細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞或淋巴細胞或者造血系統細胞。
本發明的腺病毒可配製成針對患者進行治療和診斷性應用。就治療或預防應用而言，可將含藥理學有效量的腺病毒的無菌組合物施用於待治療的人類患者或非人類患病牲畜，例如患癌症的人類患者或牲畜。通常，組合物在水性懸浮液中將包含大約103-1015個或更多的腺病毒顆粒。藥用可接受載體或賦形劑常常在這種無菌組合物中應用。可以使用各種水性溶液，例如，水、緩衝水溶液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等等。這些溶液是無菌的，並且通常除了所需的腺病毒載體之外不含其它微粒物質。組合物中可包含達到生理學條件所需的藥用可接受輔助物質，諸如pH調節和緩衝試劑、毒性調節試劑等等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。可包括增強腺病毒的細胞感染能力的賦形劑。
本發明的B亞組腺病毒或其中所含的DNA也可通過脂質體或免疫脂質體投遞方法投遞至腫瘤細胞中；所述的投遞可基於腫瘤細胞群中存在的細胞表面特性(例如，存在與免疫脂質體中的免疫球蛋白可結合的細胞表面蛋白質)選擇性的靶向腫瘤細胞。通常，含病毒粒子的水性懸浮液被封裝於脂質體或免疫脂質體中。
例如，腺病毒病毒粒子懸浮液可用常規方法包裹在微團中以形成免疫脂質體(美國專利5,043,164、美國專利4,957,735、美國專利4,925,661；Connor和Huang(1985)J.Cell Biol.101582；LasicDD(1992)Nature 355279；新的藥物傳送方法(Novel DrugDelivery)(Prescott LF和Nimmo WS編Wiley，New York，1989)；Reddy等(1992)J.Immunol.148第1585頁)。
可利用含有能與個體的癌細胞上所存在的癌細胞抗原(例如CALLA、CEA)特異結合的抗體的免疫脂質體來將病毒粒子或病毒粒子DNA靶向於那些細胞。
可施用含本發明腺病毒的組合物或它們的混合物來治療腫瘤性疾病。在治療性應用中，將組合物施用於受某具體腫瘤疾病影響的患者，施用劑量足以治癒或至少部分緩解病情及其併發症。足以達到此目的的劑量被定義為「治療有效劑量」或「有效劑量」。就此應用而言的有效量取決於疾病的嚴重程度、患者的總體狀況以及施用途徑。
下文所述的是本發明的實施例。這些實施例只供說明，而不希望以任何方式局限本發明的範圍。根據本發明的內容，在本發明權利要求範圍內的許多實施方案對於本領域技術人員而言是明白清楚的。說明書中所引用的參考文獻的內容在此收編作為參考。
實施例實施例1腺病毒第3型和第34型的基因組序列人類B亞組腺病毒第3型和第34型(下文也分別稱為Ad3或Ad34)由美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得。使用標準的感染和培養技術，在同樣可由ATCC獲得的A549細胞中繁殖病毒。通過氯化銫梯度條帶離心純化這兩種病毒。
由氯化銫梯度成帶病毒顆粒通過在含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、0.6％SDS、和1.5mg/ml鏈黴蛋白酶(Sigma公司)的溶液中裂解病毒顆粒獲得病毒DNA。溶液處於37℃。將裂解後的顆粒用酚/氯仿抽提兩次，並用乙醇沉澱病毒DNA。將純化後的病毒DNA溶於蒸餾水並用於DNA測序。
接著，將病毒DNA用Sau3A I進行有限消化，隨後在1％瓊脂糖凝膠中拆分消化後的DNA。使用商品化DNA凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)純化大小在0.8kb和1.2kb之間的片段，隨後克隆到經過BamH I消化的載體pGem-7zf(+)(Promega公司)中。
使用自動化測序儀CEQ20000XL(Beckman)，用T7和SP6測序引物，對200個單克隆測序。使用SeqMan軟體(DNAStar公司)構建毗連序列群。根據構建的序列，合成寡核苷酸並進行引物行走，直至將所有毗連序列群連接起來。大多數區域被至少2次獨立測序所覆蓋。
實施例2Ad34主鏈上E1B 55K缺失病毒的構建質粒構建對基於pGEM(Promega公司)的載體進行修飾，並用於克隆、亞克隆相關核苷酸序列。質粒構建基於以下事實Ad34基因組中距左末端6.5kb處存在唯一的Nhe I限制位點。質粒構建由用HindIII消化Ad34基因組(15ug)開始。在1％瓊脂糖凝膠上分離大小為2.2kb和3.4kb的兩個片段，並使用Bio101基因清潔試劑盒純化。將該2.2kb片段連接到事先用HindIII消化過的pGEM-7Z(Promega)中。通過限制性作圖對構建體評估正確片段和定向。將此構建體稱為2.2/pGEM-7Z。接著，通過用Nhe I和Cla I消化除去2.2/pGEM7Z構建體中Nhe I位點附近的HindIII位點，然後用Klenow補平，並重連。使用PCR引物P04 Fwd(5′CATGAGCTCGCGGCCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGA-3′)和Ad34-1370B(5′GGCTTAAGCTTCACAGGAA-3′)、lng基因組模板DNA、和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)通過PCR(美國專利號4,683,202)生成Ad34基因組的前1.4kb。使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR產物，用Sac I和Hind III進行消化，在1％瓊脂糖凝膠上進行分離，並用Bio101基因清潔試劑盒進行純化。將純化後的1.4kb片段連接到用Sac I和Hind III消化過的2.2/pGEM-7Z中，生成1.4/2.2/pGEM-7Z構建體。將3.4kb片段連接到事先用Hind III消化過的pGEM-9Z(Promega)中。通過限制性作圖對構建體評估正確片段和定向。
由於E1B19K和E1B55K基因存在交疊，通過在E1B55K起始位點的後面引入終止密碼子並缺失E1B19K終點與剩餘E1B55K基因之間的序列而實現了E1B55K基因的滅活。
缺失的區域以Pme I位點取代。E1B55K的誘變使用兩步PCR過程對3.4/pGEM9Z構建體進行。來自第一步PCR的產物是使用PCR引物P02 fwd(5′-CCCTCCAGTGGAGGAGGCGGAGTAGGTTTAAACGGTGAGTATTGGGAAAACTTGGGGT-3′)、P03 Rev(5′-TAGCATAGGTCAGCGTTGAAGAAT-3′)、10ng 3.4/pGEM-9Z模板DNA、和Faststart DNA聚合酶(Roche)生成的。第二步PCR是使用PCR引物P01 fwd(5′-ATAAATGGATCCCGCAGACTCATTTTAGCAGGGGATACGTTTTGGATTTCG-3′)和來自第一個PCR反應的產物、10ng 3.4/pGEM9Z模板DNA、和Faststart DNA聚合酶(Roche)生成的。將PCR產物用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化、用BsmB I和BamH I消化、在2％瓊脂糖凝膠上分離、並用Bio101基因清潔試劑盒純化。將純化後的E1B55K缺失片段連接到事先用BsmB I和BamH I消化過的3.4/pGEM9Z中，生成3.4Δ55K/pGEM-9Z。為了裝配1.4kb、2.2kb片段、和3.4Δ55K片段，用Hind III消化3.4Δ55K/pGEM-9Z構建體，在1％瓊脂糖凝膠上分離3.4Δ55K片段，並用Bio101基因清潔試劑盒純化。將純化後的3.4Δ55K片段連接到用Hind III消化過並用CIP處理過的1.4/2.2/pGEM-7Z構建體中，生成穿梭載體SV13。
對穿梭載體SV13測序後，發現1.4kb片段中存在一個點突變，它是由PCR中的錯誤引起的。為了糾正這個錯誤，使用相同PCR條件但使用校正DNA聚合酶(購自Strategene)的Pfu生成新的1.4kb PCR產物。
將純化後的1.4kb片段連接到用Not I和BmgB I消化過的SV13穿梭載體中，生成穿梭載體SV2-5。該構建體通過測序得到了證實。病毒構建和分離如S.Miyake等(PNAS 1996)所述製備B亞組腺病毒第34型(Ad34)(ATCC)TP DNA。為了構建Ad34ΔE1B55K病毒，用Not I和Nhe I消化SV2-5構建體(8.5ug)，在1％瓊脂糖凝膠上分離，並用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN)純化。然後將5ug該片段於室溫O/N連接到0.25ug已用Nhe I於37℃消化6小時的AD34-TP DNA中。使用哺乳動物轉染試劑盒(Stratagene)，依照製造商的方案，將連接混合物轉染到位於60mm培養皿、添加2％FBS的DMEM中的HEK293細胞中。將轉染物於37℃/3％CO2O/N保溫24小時。24小時後停止轉染，即除去培養基，並換入添加了2％FBS、2％L-穀氨醯胺、1％PS的DMEM，然後於37℃/5％CO2保溫24小時。用含有2％FBS、2％L-穀氨醯胺、1％NEAA、1％PS、和1.5％SeaPlaque瓊脂糖的DMEM感染培養基覆蓋細胞，並且每2-3天用新鮮的覆蓋培養基供料。分離噬斑，在HEK293細胞中增殖，並使用QIAamp DNA血液試劑盒(QIAGEN)遵循製造商的建議分離病毒DNA。使用下列引物SV fwd05(5′-GGAAGACCTTAGAAAGACTAGGC-3′)和P03 Rev(5′-TAGCATAGGTCAGCGTTGAAGAAT-3′)，通過PCR對病毒篩選E1B55K缺失區。PCR是使用Faststart DNA聚合酶(Roche)在下列循環條件下進行的1個循環的94℃5分鐘，25-30個循環的94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒-90秒，以及1個循環的72℃7分鐘，最後4℃不限時。將陽性噬斑在293/E4細胞(MicrobixBiosystems公司)上純化4輪。用引物3.4fwd03(5′-GGGATGAAGTTTCTGTATTGC-3′)和3.4rev12(5′-GTCACATCTACACACACCGG-3′)通過PCR對所有病毒分離物篩選EIB55K缺失和內部Ad34野生型E1B55K序列。
Ad34ΔE1B55K病毒、穿梭載體、SV2-5保藏於美國典型培養物保藏中心，編號分別是______和______。
雖然出於清楚理解的目的已經較為詳細的描述了本發明作為例示，但是顯然可以在權利要求的範圍內進行某些改變和修改。
權利要求
1.用於消除細胞群中的腫瘤細胞的方法，包括下列步驟在感染條件下使(1)重組複製缺陷型B亞組腺病毒接觸(2)包含非腫瘤細胞和腫瘤細胞的細胞群，從而產生受感染細胞群；所述腺病毒缺乏能夠與功能性腫瘤抑制基因產物相結合的經表達的病毒癌蛋白，所述非腫瘤細胞包含能夠與病毒癌蛋白形成結合複合物的所述功能性腫瘤抑制基因產物，所述腫瘤細胞缺乏該功能性腫瘤抑制基因產物。
2.權利要求1的方法，其中所述腫瘤抑制基因是p53或pRb。
3.權利要求2的方法，其中所述病毒癌蛋白包含腺病毒E1b或E1A多肽。
4.權利要求3的方法，其中所述B亞組腺病毒選自第3型或第34型。
5.治療患者癌症的方法，包括下列步驟對所述患者施用重組複製缺陷型B亞組腺病毒，所述腺病毒缺乏能夠與功能性腫瘤抑制基因產物相結合的經表達的腺病毒癌蛋白。
6.權利要求5的方法，其中所述B亞組腺病毒選自第3型或第34型。
7.權利要求6的方法，其中所述腺病毒癌蛋白包含E1b或E1A多肽。
8.包含圖1中所示核苷酸序列的重組B亞組第3型人類腺病毒。
9.在嚴謹條件下與圖1中所示核苷酸序列發生雜交的核苷酸序列。
10.包含圖2中所示核苷酸序列的重組B亞組第34型人類腺病毒。
11.在嚴謹條件下與圖2中所示核苷酸序列發生雜交的核苷酸序列。
12.權利要求8的重組B亞組第3型人類腺病毒，其在編碼分別與pRb或p53相結合的癌蛋白的E1A和/或E1B區域中包含突變，所述突變可分別減輕或消除所述癌蛋白與pRb或p53的結合。
13.權利要求12的重組人類腺病毒，其中所述突變是缺失或點突變。
14.權利要求10的重組B亞組第34型人類腺病毒，其在編碼分別與pRb或p53結合的癌蛋白的E1A和/或B1B區中包含突變，所述突變分別減輕或消除所述癌蛋白與pRb或p53的結合。
15.權利要求14的重組人類腺病毒，其中所述突變是缺失或點突變。
16.圖1或2中顯示的核苷酸序列，其中包含編碼E1B 55K蛋白質的區域，或者在嚴謹條件下與所述序列發生雜交的核苷酸序列。
17.由圖1或2中所示核苷酸序列編碼的E1B 55K蛋白質，或者由在嚴謹條件下與所述序列發生雜交的核苷酸序列編碼的蛋白質。
全文摘要
本發明提供了使用人B亞組腺病毒治療疾病的方法和組合物，由這種病毒衍生的載體，包括其中一個或多個B亞組腺病毒基因被外源基因所替代的表達載體系統。
文檔編號C12N15/86GK1934253SQ200480019901
公開日2007年3月21日 申請日期2004年6月22日 優先權日2003年7月18日
發明者Y·J·沈, A·沈, A·佩雷斯, E·塞維拉, A·阿斯佩倫德 申請人:昂尼克斯藥物公司