膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑的聯合應用的製作方法

2023-09-20 02:29:25 1

膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑的聯合應用的製作方法
【專利摘要】膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備在肝切除術後促進肝再生的藥物中的用途。在進行肝切除術後聯合給予膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑，具有明顯的促進肝再生作用，減輕肝小葉內腫脹和空泡變性的肝細胞數量，進而促進肝功能的恢復，且無明顯毒副作用。
【專利說明】膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑的聯合應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備促進肝再生的藥物中的用途。

【背景技術】
[0002]複雜的大範圍肝切除術等易出現肝細胞損害、小肝綜合症、肝功能衰竭等併發症，嚴重時可導致患者死亡。這些併發症在術前伴有阻塞性黃疸和肝硬化的患者中發生率較聞。
[0003]肝細胞再生能補償手術切除和肝組織損傷導致的肝細胞減少，恢復肝臟的生理功能，對防治小肝綜合症、肝功能衰竭等有非常重要的作用。
[0004]膽鹼酯酶抑制劑是一類能與膽鹼酯酶(ChE)結合，並抑制膽鹼酯酶活性的藥物，其作用是使膽鹼能神經末梢釋放的Ach堆積，表現M樣及N樣作用增強而發揮興奮膽鹼受體的作用。
[0005]毒蕈鹼型受體阻斷劑能阻斷節後膽鹼能神經所支配的效應器細胞上的毒蕈鹼型受體，具有鬆弛內臟平滑肌、解除平滑肌痙攣、抑制唾液腺、汗腺、胃腸腺等的分泌、解除迷走神經對心臟的抑制、鬆弛虹膜刮約肌、興奮呼吸中樞等作用。
[0006]專利文獻CN102580099A報導了毒蕈鹼受體阻斷劑和膽鹼酯酶抑制劑用於抗肝臟缺血再灌注損傷的用途。
[0007]迄今為止，沒有關於毒蕈鹼受體阻斷劑和膽鹼酯酶抑制劑聯用促進肝再生的報導。


【發明內容】

[0008]本發明人發現，膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合應用能夠促進肝的再生，特別是在大範圍肝切除術後能夠促進肝的再生，減輕肝小葉內腫脹和空泡變性的肝細胞數量，促進肝功能的恢復，且無明顯毒副作用。
[0009]鑑於此，本發明提供膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備促進肝再生的藥物中的用途，特別是用於製備在肝切除術後促進肝再生的藥物中的用途。
[0010]本發明進而提供膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備治療或預防因肝細胞數量不足引起的肝功能障礙的藥物中的用途，特別是用於製備治療或預防肝切除術後因肝細胞數量不足引起的肝功能障礙的藥物中的用途。
[0011]本發明進而提供膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備預防或治療小肝綜合症的藥物的用途，特別是用於製備預防或治療肝切除術後小肝綜合症的藥物的用途。
[0012]所述膽鹼酯酶抑制劑優選為選自新斯的明、溴化新斯的明、毒扁豆鹼、吡啶斯的明、溴化吡啶斯的明、加蘭他敏、依酚氯銨、安貝氯銨、地美溴銨、他克林中的一種或多種。更優選為新斯的明。
[0013]所述毒蕈鹼受體阻斷劑優選為選自山莨菪鹼、東莨菪鹼、阿託品、後馬託品、託吡卡胺或普魯本辛中的一種或多種。更優選為山莨菪鹼。
[0014]在本發明的用途中，膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑的重量比例優選為1:50-800，更優選為 1:200-600，最優選為 1:500。
[0015]本發明的藥物可以是膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑混合的藥物，也可以是膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑分裝的藥物。
[0016]本發明中所述藥物可以是膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑與藥學上可接受的載體組成的任何合適的劑型。例如，可以列舉片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、顆粒劑、懸浮齊U、丸劑、滴丸劑、靜脈注射液、皮下注射液等。本發明的製劑可以是緩釋製劑。
[0017]本發明的用途在針對人體給藥時，膽鹼酯酶抑制劑(優選新斯的明)的給藥劑量為1.25?60 μ g/kg,優選為1.7-15 μ g/kg,更優選為4 μ g/kg。毒蕈鹼受體阻斷劑(優選山莨菪鹼)的給藥劑量為lmg-3mg/kg,優選為1.7mg-2.3mg/kg,更優選為2mg/kg。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1顯示治療組和對照組中梗阻性黃疸肝切除大鼠的肝再生率。
[0019]圖2顯示治療組和對照組中肝臟增生指數檢測結果。
[0020]圖3顯示治療組和對照組中梗阻性黃疸肝切除餘肝的肝細胞K1-67表達情況。
[0021]圖4顯示治療組和對照組ICG PDR的檢測結果。
[0022]圖5顯示假手術組(圖5A)、對照組(圖5B)和治療組(圖5C)大鼠的肝臟組織病理學變化。
[0023]圖6是顯示治療組和對照組中梗阻性黃疸肝切除餘肝的肝細胞K1-67表達情況。
[0024]圖7顯示假手術組、對照組和治療組大鼠的肝臟組織病理學變化。

【具體實施方式】
[0025]實驗動物與試劑
[0026]雄性Wistar大鼠，體重240?260g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。
[0027]實驗用藥為甲硫酸新斯的明注射液(上海信宜金朱藥業有限公司)和鹽酸消旋山莨菪鹼注射液(天津金耀胺基酸有限公司)。
[0028]阻塞性黃疸模型的製作
[0029]大鼠術前12小時禁食，不禁水。該手術方法是在使用外科手術顯微鏡及乙醚麻醉下進行。麻醉成功後，將大鼠仰臥位固定，腹部皮膚碘伏消毒，取上腹正中切口，游離膽總管，用5-0絲線遠、近端雙重結紮後中間剪斷，以防止膽管再通，然後關腹。
[0030]膽道引流和部分肝切除
[0031]膽管結紮七天後，乙醚麻醉下進行第二次開腹手術。膽道引流是通過插入一段8毫米長的由無菌血管內導管(上海浦東金環醫療有限公司，中國，上海)製作的支架重新連接近端和遠端膽總管，在用荷包縫合將支架進行適當固定。然後參照文獻方法(HigginsGMj Anderson RM.Experimental pathology of liver resect1n.Arch Pathol.1931 ；12:186-197)進行68%肝切除，並立即將切除的肝葉進行稱重以計算總的肝臟重量。
[0032]藥物處理和樣品收集
[0033]將阻塞性黃疸I周的大鼠進行膽道引流和部分肝切除後隨機分為兩組:聯合山莨菪鹼和新斯的明組(治療組)和生理鹽水組(對照組)，每組6隻大鼠。山莨菪鹼以25mg/kg、新斯的明以50μ g/kg混合後腹腔注射給藥。在肝切除後立即開始給藥並持續兩天，每天給藥兩次。對照組大鼠注射等量生理鹽水。另外設假手術組大鼠6隻。
[0034]在二次手術48小時後將大鼠乙醚麻醉並開腹。取殘餘再生肝葉進行稱重。10%福馬林-磷酸鹽緩衝液(PH7.4)中進行固定，用於組織病理學分析用。
[0035]吲哚菁綠(ICG)排洩試驗
[0036]將ICG(遼寧丹東醫療有限公司生產)按2.5mg/ml溶解於無菌注射用水。測定時首先將新鮮製備的ICG溶液快速注入大鼠一側股靜脈(2.5mg/kg),於注射後1、3和5分鐘時從下腔靜脈進行血液採樣，每次150-200 μ 1，並加入肝素抗凝。離心後取50 μ L血漿樣品與950 μ L I %重量/體積比的牛血清白蛋白和0.9 %重量/體積比的NaCl水溶液混合，然後於805nm處進行分光光度計比色。PDR為1、3和5分鐘時稀釋血漿的OD值的半對數衰減曲線的斜率。
[0037]肝再生的評估
[0038]肝臟再生的評估的採用兩個獨立的檢測指標:肝臟質量的再生以動物處死時殘餘再生肝臟重量佔肝切除時估計總肝重的百分比表示，並使用以下公式計算:肝再生(％)=Α/ΒΧ0.68X100，其中A代表在處死動物時的殘餘再生肝重量，B代表切除肝臟重量，約佔整個肝臟重量的68%。評估肝細胞增殖的K1-67標記指數利用免疫組織化學方法測定:將福馬林固定的肝組織進行石蠟包埋、製成5 μ m厚切片，脫蠟復水後按照說明書要求以小鼠抗K1-67的單克隆抗體(BD Pharmingen公司)進行免疫組織化學染色，蘇木素復染。光學顯微鏡下隨機選取10個高倍視野(400X)，計數K1-67標記陽性的肝細胞數佔肝細胞總數的百分比作為K1-67標記指數。
[0039]形態學檢測
[0040]大鼠肝組織標本經10%福馬林固定後，常規石蠟包埋，5 μ m切片，蘇木素伊紅(HE)染色。光鏡觀察進行肝臟損傷的病理分析，對膽管增生和肝細胞損傷情況進行比較。
[0041]統計學分析
[0042]所有數據採用均數土標準差表示。t_檢驗用於兩組間比較。2組以上的比較採用單因素方差分析(ANOVA)，利用SPSS17.0進行統計分析，取P〈0.05為有統計學意義。
[0043]實驗結果
[0044]聯合應用山莨菪鹼和新斯的明可促進肝切除術後肝臟再生
[0045]對梗阻性黃疸7天的大鼠進行膽汁引流和部分肝切除，術後48小時對肝再生程度進行評估。結果表明對照組和治療組的肝再生率分別為57.7±7.8%和68.9±4.3% (圖1)，兩組間差異顯著(P〈0.05)。肝細胞K1-67標記指數的檢測結果表明，治療組的肝細胞增生情況明顯好於對照組(P〈0.05)(圖2，圖3)。這些結果表明，山莨菪鹼/新斯的明聯合治療可改善阻塞性黃疸大鼠肝切除術後的肝再生。
[0046]ICG檢測結果表明聯合應用山莨菪鹼和新斯的明可促進肝切除術後肝功能恢復
[0047]ICG常用來評估肝臟的最大清除能力，對於阻塞性黃疸大鼠部分肝切除後的ICGPDR的檢測結果如圖4所示(其中K值表示ICG在血漿中的清除速率)，治療組的ICG PDR顯著高於對照組(p〈0.05)，這表明肝細胞的清除能力和膽道系統獲得明顯改善。
[0048]進一步對治療組和對照組大鼠的肝臟組織病理學改變進行觀察並與假手術組進行比較。結果表明假手術組大鼠肝組織小葉結構清晰，肝索完整，沒有明顯的膽管增生和肝細胞損傷(圖5A)。治療組(圖5C)和對照組(圖5B)均存在一定程度的肝細胞損傷，但是治療組的腫脹和空泡變性的肝細胞數量明顯少於對照組。
[0049]按照與以上相同的方法進行實驗，其中僅將新斯的明的給藥量分別改為500μ g/kg、32y g/kg。結果均顯示，山莨菪鹼和新斯的明聯合應用具有明顯的促進肝再生作用，減輕肝小葉內腫脹和空泡變性的肝細胞數量，促進肝功能的恢復。
[0050]由此可見，山莨菪鹼和新斯的明聯合應用可促進肝切除大鼠的肝再生，顯著提高梗阻性黃疸肝切除術後殘餘肝的肝細胞分裂增生，從而能有效防治肝切除術後小肝綜合症和肝功能衰竭的發生。
[0051]山莨菪鹼和新斯的明聯合應用可促進梗阻性黃疸肝切除後肝臟的功能恢復，表現為藥物治療組的ICG血漿清除率顯著高於生理鹽水對照組，而且血清白蛋白水平亦顯著高於生理鹽水對照組。因此山莨菪鹼和新斯的明聯合應用可促進肝切除術後患者肝功能的恢復。
[0052]山莨菪鹼和新斯的明聯合應用可減輕梗阻性黃疸肝切除術後肝細胞的損傷程度，減輕肝小葉內腫脹和空泡變性的肝細胞數量。
[0053]以上僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍並不局限於此，本領域的技術人員在本發明揭露的技術方案的基礎上，可容易想到的變化或替換，都應理解為落在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備促進肝再生的藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備在肝切除術後促進肝再生的藥物中的用途。
3.根據權利要求1所述的用途，其中膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備治療或預防因肝細胞數量不足引起的肝功能障礙的藥物中的用途。
4.根據權利要求3所述的用途，其中膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備治療或預防肝切除術後因肝細胞數量不足引起的肝功能障礙的藥物中的用途。
5.根據權利要求1所述的用途，其中膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備預防或治療小肝綜合症的藥物。
6.根據權利要求5所述的用途，其中膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑聯合用於製備預防或治療肝切除術後小肝綜合症的藥物。
7.根據權利要求1?6任一項的用途，其中所述的膽鹼酯酶抑制劑為新斯的明。
8.根據權利要求1?7任一項所述的用途，其中所述的毒蕈鹼受體阻斷劑為山莨菪鹼。
9.根據權利要求1?8任一項所述的用途，其中膽鹼酯酶抑制劑和毒蕈鹼受體阻斷劑的重量比例為1:50-800，優選為1:200-600，更優選為1:500。
【文檔編號】A61K45/06GK104288772SQ201410461187
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月11日 優先權日:2014年9月11日
【發明者】顧萬清 申請人:顧萬清