兔抗人smn全長多克隆抗體的優選與提取法的製作方法

2023-09-19 21:26:40

專利名稱：兔抗人smn全長多克隆抗體的優選與提取法的製作方法
技術領域：
本發明涉及早期基因診斷疾病、SMN蛋白功能研究及疾病預後判斷的方法，具體的說是對脊髓性肌萎縮症的兔抗人SMN全長多克隆抗體的優選與提取法。
背景技術：
脊髓性肌萎縮症(spinal muscular atrophy，SMA)是一類以脊髓前角α-運動神經元退行性變、肢體近端無力、萎縮為主要特徵的遺傳性疾病，臨床表現為進行性對稱性肌無力及肌萎縮，近端重於遠端，下肢重於上肢。兒童期起病的SMA呈常染色體隱性遺傳，群體發病率為1/6000-1/10000，攜帶者頻率為1/40-1/60。根據發病年齡和病情的輕重，臨床上將兒童期起病的SMA分為3型I型患兒多在2歲內死於呼吸肌麻痺；II、III型雖然病情相對較輕，但晚期嚴重致殘，生活自理能力差，給社會和家庭帶來極大負擔。
運動神經元生存蛋白基因(survival of motor neuron，SMN)為兒童型SMA的致病基因，該基因定位於5q11.2-13.3區域，編碼含294個胺基酸的SMN蛋白，SMN蛋白在哺乳動物組織中廣泛表達，與其它多種蛋白相結合形成蛋白複合體，參與機體mRNA的剪接過程，是維持機體正常生命活動的必須成份，完全缺失SMN的個體將在胚胎期即死亡。在病人中進行SMN蛋白表達研究發現，SMN蛋白下降水平與疾病嚴重程度相關，即患者病情越重，其外周血及肌肉組織中SMN蛋白含量越低，病情較輕者其SMN蛋白含量較高。多年來本病在治療上一直未取得突破，其主要原因在於SMN蛋白功能及SMN表達調控機制未闡明。因此只有進行SMN蛋白功能的研究，從而揭示SMA發病機制，才能從根本上解決SMA的早期診斷、預後判斷和治療等問題。
研究SMN蛋白的功能及其致病機制，高質量的SMN抗體是必備條件。由於SMN蛋白不同區域其功能不同，如氨基端主要與蛋白在細胞內正確定位有關，中間的核心區域是剪接體蛋白裝配與合成的關鍵，而羧基端則與SMN蛋白自身聚積和穩定性有關。
從包括中國專利在內的有關資料檢索表明，目前國內尚無現成的SMN抗體，而國外學者製備的SMN抗體均為羧基端或氨基端多肽抗體，此類抗體製備時僅需合成數十個胺基酸的多態去免疫家兔，製備工藝較為簡單、快速，但由於無法同時涵蓋SMN蛋白的三個不同的關鍵區域，因此這類抗體的敏感性及特異性均較低，限制了抗體使用的深度和廣度，如僅能用於細胞免疫螢光染色或僅能用於免疫組化，並且容易導致假陽性或假陰性結果，因此不是最佳的SMN抗體。

發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明的目的是在SMN基因中擴增出其全長編碼序列，並進行兔抗人SMN全長多克隆抗體的優選與提取法。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是製備抗體，首先必須合成製備抗體所需的蛋白。選用哪一段蛋白來製備抗體及如何合成正確序列的蛋白是本發明的關鍵。如果僅合成羧基端或氨基端數十個胺基酸的蛋白來製備抗體，將導致抗體的特異性和敏感性均不夠高。由於SMN基因全長編碼區僅882bp，編碼的蛋白序列為294個胺基酸，因此完全可製備全長編碼區的SMN蛋白。兔抗人SMN全長多克隆抗體的優選，其特徵是選用涵蓋1至294位胺基酸的全長SMN蛋白來製備抗體，針對SMN蛋白的所有功能區。
直接通過合成多肽來製備這麼大片段且編碼正確的蛋白十分昂貴，也是不現實的，因此本發明選擇誘導大腸桿菌表達His基因融合蛋白的方法來製備該H的蛋白片段。所述的His基因融合蛋白，必須自行設計引物擴增SMN基因全長編碼區，與表達載體連接後構建His基因融合載體。
本發明的兔抗人SMN全長多克隆抗體的具體提取方法1、製備正常人全長編碼區cDNA片段新鮮腦組織來源於急性顱腦外傷手術患者，組織一經離體，迅速放置液氮中；稱取50mg腦組織，加入1ml TRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻後轉移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩動，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴5～10分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～30分鐘；小心吸取上清移至一個新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl異丙醇，輕輕翻轉Ep管5～15次，置冰浴5～15分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～15分鐘，見管底有白色沉澱；去上清，往沉澱中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振蕩，4～10℃7000～10000rpm離心3～8分鐘；去上清，翻轉Ep管，室溫乾燥沉澱15～30分鐘。溶解沉澱後即得總核糖核酸(RNA)，-80℃保存備用。將此RNA用逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)逆轉錄成cDNA，即為正常人腦組織全長編碼區cDNA片段。
2、引物設計及His基因融合載體的選擇要保證長達882bp的PCR擴增產物片段(目的基因片段)正確無誤，引物的設計至關重要。為了保證目的基因片段(SMN基因1-294胺基酸片段)與His基因融合載體連接後，胺基酸編碼不發生移碼改變，我們選擇了pET-28a-c(+)載體，並選用限制性內切酶EcoRI和XhoI做為連接點。之所以選擇這2種內切酶，是因為SMN基因片段上沒有這2個切點，而且它們也是比較常見的限制性內切酶。根據引物設計原則自行設計引物，做到同一條引物沒有回文髮夾結構，5』端與3』端的4個鹼基不互補，正反向引物序列不互補，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共設計了4條引物，序列如下1F 5』-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3』(含EcoRI切點)1R 5』-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3』(含XhoI切點)442F 5』-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3』486R 5』-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC 3』1F和1R用於PCR擴增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用來測序證實所擴增的目的基因片段序列。
3、製備目的基因片段並連接到pET-28a-c(+)表達載體上以正常人全長編碼區cDNA片段為模板，採用引物1F、1R和高保真PCR擴增試劑盒擴增SMN基因1～882cDNA序列。應用TA克隆試劑盒將PCR產物連接到pMD18-T載體上，轉化DH5α大腸桿菌並挑取陽性TA克隆，搖菌並採用質粒抽提純化試劑盒抽提純化質粒。EcoRI和XhoI雙酶切證實陽性TA克隆並採用引物442F、486R及ABI PRISMR3730 DNA序列分析儀測序鑑定連接在pMD18-T載體上的目的基因片段序列的正確性。共挑取了30個陽性TA克隆才挑到了一個序列完全正確的克隆。應用EcoRI和XhoI雙酶切正確的TA克隆，用膠回收試劑盒回收目的基因片段並連接到經過EcoRI和XhoI雙酶切回收的pET-28a-c(+)載體上並轉化大腸桿菌E.coli BL21。
4、含目的基因片段的His基因融合載體的表達鑑定挑取1粒轉化好的His基因融合載體克隆，用5ml LB培養基搖菌，離心收集細菌並製備小量的His基因融合蛋白，採用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結果顯示His基因融合蛋白片段大小正確，表達產量高。
5、製備並純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白大量製備His基因融合蛋白，PAGE-SDS膠電泳分離並回收目的蛋白片段。
6、製備並純化兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)SMN目的蛋白與完全弗氏佐劑勻漿後皮下多點注射免疫紐西蘭大白兔，此後每7～14天加強免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，凝固後離心取血清，Western Blot方法檢測SMN多克隆抗體的滴度及特異性。加強免疫4次後，Western Blot方法檢測抗體的效價達1∶2000，且具有高度特異性，無非特異性條帶。上述結果提示該抗體的敏感性和特異性均很高。此時，從紐西蘭大白兔頸總動脈放血，離心收集抗體血清分裝，採用ImmobilizedProteinA Column(Pierce公司)純化抗體，檢測濃度並分裝，保存於-80℃。我們將該抗體命名為兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMN full-lengthpolyclonal antibody)。
7、兔抗人SMN多克隆抗體的應用(1)免疫印跡2.5～10％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉膜30～60分種；兔抗人SMN全長多克隆抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶500～1∶1000稀釋，室溫搖育2～6小時或4～8℃搖育過夜，1XTBST緩衝液搖洗3次，每次5～15分種；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000～1∶10000稀釋，室溫搖育45～90分鐘，1XTBST緩衝液搖洗3次，每次5～15分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片並衝片(請參閱圖1的結果)。
(2)免疫螢光染色pcDNA3.1mycHisBSMN表達質粒轉染CHO細胞，4～8％多聚甲醛固定細胞，5～10％山羊血清室溫封閉細胞30～60分鐘；兔抗人SMN抗體(濃度為5μg/μl)1∶50～1∶150稀釋，室溫反應1～3小時，1XPBS搖洗3次，每次5～10分種；帶綠色螢光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶100～1∶300稀釋，室溫反應30～60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5～10分鐘；封片鏡下觀察，結果見圖2。
本發明的有益效果是由於本發明設計並製備了兔抗人SMN全長多克隆抗體，保證了抗體的高度特異性，有助於進行SMN蛋白功能及發病機制研究，有助於兒童型脊髓性肌萎縮症的早期快速診斷及預後判斷。同時本發明在優選的基礎上提出了其製備及提取的方法，對於脊髓性肌萎縮症今後的治療方面的研究有著極積的作用。


圖1是本發明抗體用於免疫印跡的結果照片。標記1為不表達SMN蛋白的空CHO細胞；2為轉染pcDNA3.1mycHisBSMN表達質粒的CHO細胞；3為正常人外傷手術後的肌肉組織。3所示片段大小為38KD，而2由於所表達的是SMN-His融合蛋白，故約39KD。
圖2是本發明抗體檢測轉染質粒的CHO細胞的結果。1為轉染pcDNA3.1mycHisBSMN的CHO細胞(帶綠色螢光)，2為未轉染質粒的空CHO細胞。
具體實施例方式
實施例1針對SMN全長蛋白來製備抗體。
選擇His基因融合蛋白的方法來製備該目的蛋白片段，His基因融合蛋白，必須構建含SMN基因1至294位胺基酸(882bp)目的片段的His基因融合載體；根據引物設計原則自行設計引物。
具體提取方法1、製備正常人全長編碼區cDNA片段新鮮腦組織來源於急性顱腦外傷手術患者，組織一經離體，迅速放置液氮中；稱取50mg腦組織，加入1ml TRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻後轉移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩動，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴10分鐘，4℃12000rpm離心15分鐘；小心吸取上清移至一個新的1.5ml Ep管中，加入500μl異內醇，輕輕翻轉Ep管15次，置冰浴10分鐘，4℃12000rpm離心15分鐘，見管底有白色沉澱；去上清，往沉澱中加入1ml 75％乙醇，振蕩，4℃7500rpm離心5分鐘；去上清，翻轉Ep管，室溫乾燥沉澱20分鐘。溶解沉澱後即得總核糖核酸(RNA)，-80℃保存備用。將此RNA用逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)逆轉錄成cDNA，即為正常人腦組織全長編碼區cDNA片段。
2、引物設計及His基因融合載體的選擇為了保證目的基因片段(SMN基因1-294胺基酸片段)與His基因融合載體連接後，胺基酸編碼不發生移碼改變，我們選擇pET-28a-c(+)載體，並選用限制性內切酶EcoRI和XhoI做為連接點。之所以選擇這2種內切酶，是因為SMN基因片段上沒有這2個切點。根據引物設計原則自行設計引物，做到同一條引物沒有回文髮夾結構，5』端與3』端的4個鹼基不互補，正反向引物序列不互補，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共設計了4條引物，序列如下1F 5』-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3』(含EcoRI切點)1R 5』-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3』(含XhoI切點)442F 5』-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3』486R 5』-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC-3』
1F和1R用於PCR擴增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用來測序證實所擴增的目的基因片段序列。對於1F和1R引物設計是有一定技巧的，在1F的5』端添加了EcoRI切點序列gAATTC，其後的鹼基序列與SMN基因胺基酸片段一致，1R為反向序列，在其5』端添加了XhoI切點序列CTCgAg，其後的鹼基序列與SMN基因胺基酸片段一致，使目的基因片段可通過EcoRI和XhoI雙酶切連到pET-28a-c(+)載體上。442F和486R引物設計遵從常規引物設計原則即可。
3、製備目的基因片段並連接到pET-28a-c(+)表達載體上以正常人全長編碼區cDNA片段為模板，採用引物1F、1R和高保真PCR擴增試劑盒擴增SMN基因1～882cDNA序列。應用TA克隆試劑盒將PCR產物連接到pMD18-T載體上，轉化DH5α大腸桿菌並挑取陽性TA克隆，搖菌並採用質粒抽提純化試劑盒抽提純化質粒。EcoRI和XhoI雙酶切證實陽性TA克隆並採用引物442F、486R及ABI PRISMR3730DNA序列分析儀測序鑑定連接在pMD18-T載體上的目的基因片段序列的正確性。共挑取了30個陽性TA克隆才挑到了一個序列完全正確的克隆。應用EcoRI和XhoI雙酶切正確的TA克隆，用膠回收試劑盒回收目的基因片段並連接到經過EcoRI和XhoI雙酶切回收的pET-28a-c(+)載體上並轉化大腸桿菌E.coli BL21。
4、含目的基因片段的His基因融合載體的表達鑑定挑取1粒轉化好的His基因融合載體克隆，用5ml LB培養基搖菌，離心收集細菌並製備小量的His基因融合蛋白，採用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結果顯示His基因融合蛋白片段大小正確，表達產量高。
5、製備並純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白大量製備His基因融合蛋白，PAGE-SDS膠電泳分離並回收目的蛋白片段。
6、製備並純化兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)SMN目的蛋白與完全弗氏佐劑勻漿後皮下多點注射免疫紐西蘭大白兔，此後每14天加強免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，凝固後離心取血清，Western Blot方法檢測SMN多克隆抗體的滴度及特異性。加強免疫4次後，Western Blot方法檢測抗體的效價達1∶2000，且具有高度特異性，無非特異性條帶。上述結果提示該抗體的敏感性和特異性均很高。此時，從紐西蘭大白兔頸總動脈放血，離心收集抗體血清分裝，採用ImmobilizedProteinA Column(Pierce公司)純化抗體，檢測濃度並分裝，保存於-80℃。
7、兔抗人SMN多克隆抗體的應用(1)免疫印跡(請參閱圖1)5％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉膜60分種；兔抗人SMN全長多克隆抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶1000稀釋，室溫搖育3小時，1XTBST緩衝液搖洗3次，每次5分種；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000稀釋，室溫搖育60分鐘，1XTBST緩衝液搖洗3次，每次10分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片並衝片。
(2)免疫螢光染色(請參閱圖2)pcDNA3.1mycHisBSMN表達質粒轉染CHO細胞，4％多聚甲醛固定細胞，10％山羊血清室溫封閉細胞60分鐘；兔抗人SMN抗體(濃度為5μg/μl)1∶100稀釋，室溫反應3小時，1XPBS搖洗3次，每次5分種；帶綠色螢光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶200稀釋，室溫反應60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5分鐘；封片鏡下觀察。
權利要求
1.兔抗人SMN全長多克隆抗體的優選，其特徵是選用涵蓋1至294位胺基酸的全長SMN蛋白來製備抗體，針對SMN蛋白的所有功能區。
2.本發明根據引物設計原則設計的引物，其特徵是共設計了4條引物，序列如下1F 5』-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3』(含EcoRI切點)1R 5』-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3』(含XhoI切點)442F 5』-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3』486R 5』-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC-3』。
3.根據權利要求2所述的引物，其特徵是1F和1R用於PCR擴增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用來測序證實所擴增的目的基因片段序列。
4.根據權利要求2所述的引物，其特徵是同一條引物沒有回文髮夾結構，5』端與3』端的4個鹼基不互補，正反向引物序列不互補，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。
5.本發明的兔抗人SMN全長多克隆抗體的具體提取方法，其特徵是(1)製備正常人全長編碼區cDNA片段新鮮腦組織來源於急性顱腦外傷手術患者，組織一經離體，迅速放置液氮中；稱取50mg腦組織，加入1ml TRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻後轉移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中；加入200μl氯仿，上下甩動，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴5～10分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～30分鐘；吸取上清移至一個新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl異丙醇，輕輕翻轉Ep管5～15次，置冰浴5～15分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～15分鐘，見管底有白色沉澱；去上清，往沉澱中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振蕩，4～10℃7000～10000rpm離心3～8分鐘；去上清，翻轉Ep管，室溫乾燥沉澱15～30分鐘。溶解沉澱後即得總核糖核酸(RNA)，-80℃保存備用；將此RNA用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，即為正常人腦組織全長編碼區cDNA片段；(2)His基因融合載體的選擇保證長達882bp的PCR擴增產物片段的目的基因片段SMN基因1-294胺基酸片段與His基因融合載體連接後，胺基酸編碼不發生移碼改變，選擇了pET-28a-c(+)載體，並選用限制性內切酶EcoRI和XhoI做為連接點；(3)製備目的基因片段並連接到pET-28a-c(+)表達載體上以正常人全長編碼區cDNA片段為模板，採用引物1F、1R和高保真PCR擴增試劑盒擴增SMN基因1～882cDNA序列；應用TA克隆試劑盒將PCR產物連接到pMD18-T載體上，轉化DH5α大腸桿菌並挑取陽性TA克隆，搖菌並採用質粒抽提純化試劑盒抽提純化質粒；EcoRI和XhoI雙酶切證實陽性TA克隆並採用引物442F、486R及ABI PRISMR3730 DNA序列分析儀測序鑑定連接在pMD18-T載體上的目的基因片段序列的正確性；應用EcoRI和XhoI雙酶切正確的TA克隆，用膠回收試劑盒回收目的基因片段並連接到經過EcoRI和XhoI雙酶切回收的pET-28a-c(+)載體上並轉化大腸桿菌E.coli BL21；(4)含目的基因片段的His基因融合載體的表達鑑定挑取1粒轉化好的His基因融合載體克隆，用5ml LB培養基搖菌，離心收集細菌並製備小量的His基因融合蛋白，採用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結果顯示His基因融合蛋白片段大小正確，表達產量高；(5)製備並純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白製備His基因融合蛋白，PAGE-SDS膠電泳分離並回收目的蛋白片段；(6)製備並純化兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)SMN目的蛋白與完全弗氏佐劑勻漿後皮下多點注射免疫紐西蘭大白兔，此後每7～14天加強免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，凝固後離心取血清，Western Blot方法檢測SMN多克隆抗體的滴度及特異性；加強免疫4次後，Western Blot方法檢測抗體的效價達1∶2000，且具有高度特異性，無非特異性條帶；從紐西蘭大白兔頸總動脈放血，離心收集抗體血清分裝，採用Immobilized ProteinAColumn純化抗體，檢測濃度並分裝，保存於-80℃。
6.兔抗人SMN多克隆抗體的應用，其特徵是(1)免疫印跡2.5～10％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉膜30～60分種；兔抗人SMN全長多克隆抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶500～1∶1000稀釋，室溫搖育2～6小時或4～8℃搖育過夜，1XTBST緩衝液搖洗3次，每次5～15分種；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000～1∶10000稀釋，室溫搖育45～90分鐘，1XTBST緩衝液搖洗3次，每次5～15分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片並衝片；(2)免疫螢光染色pcDNA3.1mycHisBSMN表達質粒轉染CHO細胞，4～8％多聚甲醛固定細胞，5～10％山羊血清室溫封閉細胞30～60分鐘；兔抗人SMN抗體(濃度為5μg/μl)1∶50～1∶150稀釋，室溫反應1～3小時，1XPBS搖洗3次，每次5～10分種；帶綠色螢光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶100～1∶300稀釋，室溫反應30～60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5～10分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種兔抗人SMN全長多克隆抗體的優選與提取法，屬對脊髓性肌萎縮症的早期基因診斷疾病、SMN蛋白功能研究及疾病預後判斷的方法。兔抗人SMN全長多克隆抗體選用涵蓋1至294位胺基酸的全長SMN蛋白來製備抗體，針對SMN蛋白的所有功能區。採用製備正常人全長編碼區cDNA片段，引物設計及His基因融合載體的選擇，製備目的基因片段，並純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白，最終製備並純化兔抗人SMN全長多克隆抗體，並使兔抗人SMN多克隆抗體得以應用。本發明抗體的特異性和敏感性，有助於SMN蛋白功能及發病機制研究，早期快速診斷及預後判斷，對於脊髓性肌萎縮症今後的治療方面的研究有著極積的作用。
文檔編號G01N33/577GK1810835SQ20061000806
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月27日 優先權日2006年2月27日
發明者王檸, 陳萬金, 吳志英 申請人:福建醫科大學附屬第一醫院