殺菌/通透性增強蛋白功能區變構肽的製作方法

2023-09-19 14:58:10

專利名稱：殺菌/通透性增強蛋白功能區變構肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於用於治療人體細菌感染和內毒素血症的活性多肽分子，具體涉及殺菌/通透性增強蛋白質(BPI)功能區生物活性肽--BPI變構肽。
革蘭氏陰性(G-)細菌引起的膿毒症是導致臨床病人死亡的重要原因之一，其中存在於G-細菌外膜的脂多糖(內毒素，LPS)起著重要的作用。針對G-菌的治療主要是採用抗生素來殺滅細菌。但是抗生素在殺滅細菌的同時導致內毒素的大量釋放，其結果往往是病人死於嚴重的內毒素血症，這一直是臨床亟待解決的難題。
目前已有一些或具有中和內毒素能力或具有殺菌作用的多肽分子，如從鱟血細胞提取的抗內毒素因子(LALF)，從多粘菌中提取的多粘菌素B1。和LALF一樣，多粘菌素的類似物由於缺乏脂肪酸基因，雖然可以和LPS結合但無殺菌能力。又如Cecropins和magainins是兩種具有殺菌功能的肽類化合物，此類肽的胺基酸長度多在20-40之間，殺菌能力最強的Cecropin是Cecropin A，但它們的中和內毒素作用卻不強。為此尋找一種既能殺滅細菌又能中和細菌死亡後釋放的內毒素的活性多肽分子，將是一項非常有意義的工作。
人體存在許多抵禦外來微生物侵襲的防禦機制，其中白細胞是一重要環節，殺菌/通透性增強蛋白(Bactericidal/permeability-increasingprotein，BPI)就是從哺乳類動物白細胞嗜天青顆粒中分離出的蛋白質。人源BPI已由weiss(Weiss J.et al.1987.Blood 69652)在1987年利用酸抽提及親合層分析分離成功，其分子量為55KD，其cDNA及胺基酸序列已由Gray(Gray PW.Et al.1989.J.Bio.Chem.2649505)證實。研究結果表明其具有強大而廣譜的殺滅G-細菌及中和內毒素的能力。
BPI特異殺滅G-細菌的機制可能與帶正電的BPI與帶負電脂多糖相互吸引，細菌表面電位發生變化，從而導致細菌外膜通透性的改變有關。同時，BPI還具有中和LPS毒性的能力，因此BPI可應用於治療由G-細胞引起的感染性疾病，包括菌血症、內毒素血症、膿毒症等。不僅全序列的BPI具有殺菌和中和內毒素的能力，而且N末端的199個胺基酸(rBPI23)也具有完整BPI的全部生物學功能，不過C末端僅有輕微或無殺菌能力(Ooi CE.et al.1991 J.Exp.Med.174649)。但是rBPI23在對細菌感染和LPS血症的治療時，需要絕對的量才能達到殺滅細菌和中和LPS的目的，存在用量較大、成本較高等問題。據文獻報導(J5 Study Group.1992 J.Infect Dis.165695，Ziegler EJ.et al.1991 New Eng J.Med.324429)，BPI功能區主要由三大部分組成，①BPI 17-45胺基酸序列，②BPI 65-99胺基酸序列，③BPI 142-169胺基酸序列，也就是說BPI殺菌和中和LPS的生物活性區域分別存在於這三個胺基酸序列的區域內。
能否尋找出更小的既能殺滅細菌又能中和內毒素的BPI功能區結構，以及在此基礎上尋找到新的殺菌和中和LPS活性更強、生產成本更低的多肽分子，並能產業化生產以滿足臨床治療的需要，是一個十分重要的研究課題。
本發明的目的在於利用現今公知的合成方法提供一種可穩定重複生產的、包括全部或部分BPI生物功能如殺菌、中和內毒素活性的、小分子量多肽分子--BPI變構肽。
本發明所提供的BPI變構肽是一種具有與BPI同樣功能的活性短肽，是基於在BPI功能區的一個位點置換不同的胺基酸，或在2個以上不同位置置換同一胺基酸或不同胺基酸所得的線性的BPI功能區片段變構體。
上述本發明所定義的這種BPI變構肽，具有以下特徵(一)SEQ ID NO1(BPI A)(1)序列特徵(A)長度10胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性
(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO1A. N』---RRAFVFIHKM---C』或Arg Arg Ala Phe Val Phe Ile His Lys Met(二)SEQ ID NO2(BPI B)(1)序列特徵(A)長度16胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO2B. N』--RHKRRVGILLQLVRKR--C』或Arg His Lys Arg Arg Val Gly Ile Leu Leu Gln Leu ValArg Lys Arg。
(三)SEQ ID NO3(BPI C)(1)序列特徵(A)長度14胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO3C. N』--KTKVGWLIQLFHKK--C』或Lys Thr Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys。
(四)SEQ ID NO4(BPI D)(1)序列特徵(A)長度14胺基酸(B)類型胺基酸
(C)拓撲結構線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO4D. N』--KGKVGWLIQLFHKK--C』或Lys Gly Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His LysLys。
本發明的這些短肽--BPI變構肽，可按照Merrifield等(Merrifield RB.1963 J Am Chem Soc.852149)報告的公知的合成方法合成，這種公知的固相化學合成技術，是胺基酸為Fmoc保護的胺基酸，合成用樹脂為HMP樹脂，以水楊醛法測總胺來監控縮合率。合成時按多肽順序由C端逐個向N端延伸，縮合劑為DCCI，加HOBT以活化胺基酸的羧基，每輪循環用六氫吡啶除去Fmoc。本發明物是在PE公司的433A多肽自動合成儀上進行合成，根據給定的BPI變構肽胺基酸序列，多肽自動合成儀能自動完成各種反應程序而得到所需的BPI變構肽片段，最後用三氟醋酸法將多肽從樹脂上切割並除去所有的保護基團，合成得到的多肽須經過高壓液相(HPLC)純化純化柱C-18反相柱，流動相A 0.1％三氟醋酸(TEA)，流動相B 100％乙晴/0.1％TFA，0-30min.10-100％流動相B線性梯度，檢測波長 220nm，流速 2.0ml/分。
計算主峰面積佔整個峰面積的比例即為純度。經Sephadex G-25脫鹽，冷凍乾燥後作質譜鑑定和N端胺基酸序列分析測定分子量並確認其胺基酸序列。
實施例1.取HMR樹脂294mg，根據給定的BPI C胺基酸序列採用PE公司433A多肽自動合成儀合成得到825mg BPI C樹脂；
2.取上述合成的乾燥BPI C樹脂，加入到一個50ml的圓底燒瓶中，並放入攪拌子，在冰浴冷卻20分鐘；另取事先在冰浴冷卻30分鐘的裂解試劑B(無苯酚，含0.25ml EDT、0.5ml Anisole、0.5ml D.I.H2O、10ml TFA)加入圓底燒瓶中，磁力攪拌15分鐘後，移去冰浴，在室溫下反應1.5小時，過濾除去樹脂，經減壓蒸溜去除裂解試劑，再用醋酸乙酯洗滌7次，每次30ml，然後加入D.I.H2O使其溶解，再用無水乙醚萃取3次，以去除殘餘的裂解試劑，最後減壓蒸溜去除殘餘的乙醚，濃縮得到粗肽溶液。
3.上述粗肽溶液按以下純化條件下純化柱C-18反相柱，流動相A 0.1％三氟醋酸(TFA)，流動相B 100％乙晴/0.1％TFA，0-30min.10-100％流動相B線性梯度，檢測波長 220nm，流速 2.0ml/分，進行純化，收集主峰溶液，再經Sephadex C-25脫鹽，溶液冷凍乾燥，得到77.38mg純度(HPLC百分面積)為78.33％的BPI C變構肽。
經質譜鑑定和N端胺基酸序列分析測定分子量並確認其胺基酸序列。如表1所示，本發明的BPI變構肽的實測分子量和N端胺基酸序列分析結果與理論分子量及理論序列完全相符。
表1編號 理論分子量 實測分子量 理論序列 序列分析BPI A1305 1306.37 RRAFVFIHKM 與理論序列相符BPI B2028 2029.71 RHKRRVGILLQLVRKR與理論序列相符BPI C1726 1727.65 KTKVGWLIQLFHKK 與理論序列相符BPI D 16821681.83KGKVGWLIQLFHKK 與理論序列相符這些短肽--BPI變構肽，及其2個或3個相同或不同的肽相連成的肽，或這些肽作為稀釋劑、佐劑及載體，都具有殺滅G-、G+及真菌和中和LPS的多種功效，可用於細菌性感染疾病的治療，包括對傳統抗生素耐藥的細菌性感染的治療，也可應用於治療內毒素血症。
本發明的BPI變構肽的問世，由於其分子量小，治療劑量小，成本低，而且可通過化學合成法合成，因而可實現工業化生產。
BPI變構肽生物活性的檢測1.中和內毒素活性

圖1是本發明的BPI變構肽中和LPS能力的測試圖。將各種BPI變構肽與內毒素O111B4混勻，37℃孵育30分鐘，間斷搖晃，然後加入pH8.0磷酸鹽緩衝液(PBS)，使內毒素終濃度為200pg/ml，最後採用基質顯色法鱟試劑盒檢測內毒素含量，以多粘菌素B為陽性對照。如圖1所示，BPI變構肽在體外均有中和LPS的作用，其中以BPI B的活性最高。
2.殺菌活性檢測圖2是本發明的BPI變構肽殺菌活性的測試圖。檢測細菌為大腸桿菌J5，O111B4，先將細菌復甦於普通瓊脂平板，挑取單個菌落接種於5ml M-H肉湯，37℃，3-4h至細菌生長於對數期。1000rpm/min離心5分鐘，棄上清，沉澱用5mlPBS衝洗，離心後用M-H肉湯稀釋至2×106cfu/ml，加入BPI變構肽，按200μg/ml倍比稀釋至每管，37℃振蕩孵育20小時，於590nm處讀取吸光度；另取50μl菌液於血晾脂平板上，過夜培養計數，如圖2所示，幾種BPI變構肽在體外有殺菌作用，BPI B效果最好。
3.抑制腫瘤壞死因子(TNF)的產生人單核細胞株(THP-1)受內毒素刺激後可釋放TNF，且有劑量依賴關係，中和內毒素後，TNF必將減少，TNF的量可採用ELISA法檢測(試劑盒由Roch公司提供)。
圖3是本發明的BPI變構肽抑制腫瘤壞死因子能力的測試圖。將THP-1培養於RPMI1640中，細胞懸液離心後用新鮮RPMI1640配成1×105/ml，接種於96孔培養板，加入大腸桿菌O111B4內毒素5μg/ml，37℃培養6小時，每孔中分別加入BPI變構肽0.1μg/ml至100μg/ml，離心，取上清，測TNF含量，如圖3所示，BPI B在濃度為0.1μg/ml時即產生明顯的抑制TNF產生的作用。
4.對小鼠內毒素血症的治療作用小鼠尾靜脈注射大腸桿菌O111B4內毒素，LD90為20mg/kg。然後迅速同途徑注射不同劑量BPI變構肽(劑量為1mg/kg或5mg/kg體重)，用地塞米松為陽性對照，生理鹽水為空白對照，觀察7天後動物死亡率。結果見表2。
表2 BPI變構肽對小鼠內毒素血症模型的保護作用組別 劑量(mg/kg) 實驗動物(只) 死亡動物(只) P值空白對照組0 20 18BPIA 1 20 7 ＜0.05BPIA 5 20 4 ＜0.01BPIB 1 20 4 ＜0.01BPIB 5 20 1 ＜0.01BPIC 1 20 12 ＞0.05BPIC 5 20 8 ＞0.05BPID 1 20 14 ＞0.05BPID 5 20 10 ＞0.05地塞米松 5 20 6 ＜0.05結論BPI變構肽對LPS(20mg/kg體重)攻擊的小鼠有明顯的保護作用。
5.對小鼠腹膜炎的保護作用小鼠腹腔注入活大腸桿菌O111B4，1×107cfu/ml 0.5ml，隨即注入1mlBPI變構肽(劑量為1或5mg/kg體重)，以多粘菌素B為陽性對照，生理鹽水為空白對照，觀察動物7天後的死亡率，結果見表3。
表3 BPI變構肽對小鼠腹膜炎的保護作用組別 劑量(mg/kg) 實驗動物(只)死亡動物(只) p值空白對照組 020 19BPIA120 9 ＞0.05520 5 ＜0.05BPIB120 2 ＜0.01520 0 ＜0.01BPIC120 11 ＞0.05520 7 ＜0.05BPID120 13 ＞0.05520 9 ＞0.05多粘菌素B 10 20 4 ＜0.01結論BPI變構肽對產生腹膜炎的小鼠有較強的保護作用。
權利要求
1.一種由BPI功能區胺基酸序列經置換而來的活性多肽分子--BPI變構肽(BPI-A)，其特徵在於其(1)序列特徵(A)長度10胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO1A. N』---RRAFVFIHKM---C』。
2.一種由BPI功能區胺基酸序列經置換而來的活性多肽分子--BPI變構肽(BPI-B)，其特徵在於其(1)序列特徵(A)長度16胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO2B. N』---RHKRRVGILLQLVRKR---C』。
3.一種由BPI功能區胺基酸序列經置換而來的活性多肽分子--BPI變構肽(BPI-C)，其特徵在於其(1)序列特徵(A)長度14胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO3C. N』---KTK/VGW/LIQ/LFH/KK---C』。
4.一種由BPI功能區胺基酸序列經置換而來的活性多肽分子--BPI變構肽(BPI-D)，其特徵在於其(1)序列特徵(A)長度14胺基酸(B)類型胺基酸(C)拓撲結構線性(2)分子類型肽(3)序列描述SEQ ID NO4D. N』---KGK/VGW/LIQ/LFH/KK---C』。
5.如權利要求1，2，3或4所述的BPI變構肽及其2個或3個相同或不同的肽相連成的肽，其特徵在於用於治療G-細菌感染或內毒素血症。
6.如權利要求1，2，3或4所述的BPI變構肽及其2個或3個相同或不同的肽相連成的肽作為稀釋劑、佐劑及載體，其特徵在於用於治療G-細菌感染或內毒素血症。
全文摘要
一種由BPI功能區胺基酸序列經置換而來的、其胺基酸序列為:A.N』－RRAFVFIHKM－C』,B.N』－RHKRRVGILLQLVRKR－C』C.N』－KTKVGWLIQLFHKK－C』D.N』－KGKVGWLIQLFHKK－C』活性多肽分子及其2個或3個相同或不同的肽相連成的肽,或其作為稀釋劑、佐劑及載體,用於治療G－細菌感染或丙毒素血症,治療劑量小,成本低,而且可通過化學合成法合成,因而可實現工業化生產。
文檔編號A61K38/10GK1270175SQ9910507
公開日2000年10月18日 申請日期1999年4月13日 優先權日1999年4月13日
發明者姚志勇, 沈福泉, 曾少貴 申請人:深圳市翰宇生物工程有限公司