生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法和工具的製作方法

2023-09-19 15:00:05 3

專利名稱：：生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法和工具的製作方法生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法和工具本發明涉及澱粉的生成和應用領域。本發明尤其涉及生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法和工具，其包含將澱粉蔗糖酶編碼序列導入產澱粉的植物中。澱粉是植物中最豐富的儲備碳水化合物。澱粉以晶體顆粒狀貯存，通常包括兩種多糖，直鏈澱粉和支鏈澱粉。在植物存儲器官中，澱粉生物合成發生在澱粉形成體中。蔗糖是澱粉生物合成的起點。已知許多不同的反應和酶進一步參與澱粉生物合成。儘管近年來已對澱粉結構進行了深入研究，但是一些澱粉生物合成的機制仍然令人困惑。還未十分清楚的機制之一是確定澱粉顆粒大小的機制。澱粉是不同食品和工業應用的重要原料。工業應用的一些例子是用作食品增稠劑，用於造紙表面上膠，以及用於生成其中分散治療化合物的緩釋基質。澱粉是否適合特定應用是由其特性，如例如其顆粒大小、理化性質和非澱粉成分如蛋白質和脂肪的存在決定的。澱粉的特性例如影響澱粉的選擇和加工，因此對於澱粉加工企業有重要意義。因此該行業對具有不同特性的澱粉表現出相當大的興趣。由於澱粉行業對具有不同特性的澱粉感興趣，因而對生成具有改變特性的澱粉的方法和工具有需求。本發明現在提供生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法和工具。本文提供的發明一方面是根據將澱粉蔗糖酶編碼序列導入產澱粉植物的澱粉生成體，使所述植物生成的澱粉至少一種特性改變的研究結果。本發明在一個實施方案中提供改良產澱粉植物的方法，其包含將包含與顆粒靶向序列功能性連接，並與所述植物澱粉貯存器官中活性啟動子序列功能性連接的澱粉蔗糖酶編碼序列的核酸導入所述植物的合適植物材料中。在另一實施方案中，本發明提供生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法，其包含將包含與顆粒耙向序列功能性連接，並與植物澱粉貯存器官中活性啟動子序列功能性連接的澱粉蔗糖酶編碼序列的核酸導入所述植物的合適植物材料中，並從所述材料生成植物，還包含使所述植物生長，並從所述植物收集澱粉。當與其中還未導入澱粉蔗糖酶編碼序列的相同種植物的澱粉相比，澱粉特性改變時，應理解澱粉具有改變的特性。特性指澱粉的任何參數，因此所述特性例如指結構和/或物理性質和/或化學性質。對於本發明而言，植物和/或產澱粉植物被定義為其中生成澱粉，優選所述澱粉在專門質體，即澱粉生成體中生成的任何植物。產澱粉植物的非限制性例子為根用作物，如木薯、馬鈴薯、紅薯、芋頭、山藥、甜菜或蘿蔔；穀物如玉米、小麥、水稻、高梁、大麥；產水果的物種，如香蕉、蘋果、番茄或梨；膳食作物，如大豆或豌豆；油籽作物，如油菜籽、油菜、向日葵、油椋、椰子、亞麻籽或落花生。優選產澱粉的植物為馬鈴薯植物，更優選含直鏈澱粉的馬鈴薯植物，如Kardal品種。對於本發明而言，適合的植物材料指其中可導入澱粉蔗糖酶編碼序列和進一步的序列的任何植物材料。適合的植物材料或是天然產生的物質或是人工合成的物質。自然產生的植物材料例如非常早期的植物材料，如種子或小芽的材料。優選的合適植物材料是原生質體。對本發明而言，原生質體指-使用機械的或化學的，如酶的方法完全或部分去除細胞壁的植物細胞。原生質體可以例如使用微組織增殖法再生整個植林。使植林生長應理解為使所述植物保持/或置於其能生長的的環境中。對本發明而言，澱粉蔗糖酶指包括生物體，優選細菌生成的任何澱粉蔗糖酶，和/或任何天然、合成或重組的具有澱粉蔗糖酶活性的化合物。具有澱粉蔗糖酶活性的化合物例如已被截短的澱粉蔗糖酶。這樣截短的澱粉蔗糖酶例如由提供帶有編碼所述澱粉蔗糖酶的截短基因的生物體生成。所述截短的基因編碼至少一種功能性澱粉蔗糖酶和任選的另外序列。澱粉蔗糖酶是葡糖苷水解酶GH13家族的成員。更具體地說，它是例如由不同細菌，如奈瑟氏菌、趨磁球菌和聚球藍細菌的非致病菌生成的己糖基轉移酶。根據本發明的澱粉蔗糖酶編碼序列優選編碼與奈瑟氏菌產生的澱粉蔗糖酶優選至少70%，更優選至少80%,更優選至少90%，更優選至少95%,最優選95%以上同源或一致性的澱粉蔗糖酶，其中所述奈瑟氏菌優選多糖奈瑟球菌(DeMontalketal.1999)。優選地，根據本發明的澱粉蔗糖酶編碼序列編碼與圖12中所示的澱粉蔗糖酶序列至少70%,更優選至少80%，更優選至少90%，更優選至少95%,最優選95%以上同源或一致性的澱粉蔗糖酶。在本發明的一個實施方案中，所述澱粉蔗糖酶編碼序列中的一個或多個核酸被保守取代。澱粉蔗糖酶編碼序列通常是核酸序列。對本發明而言，核酸一般包括但不一定包括DNA或RNA。核酸優選包含核苷酸A、C、G、T和/或U。這些核普酸或者是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和/或其他核苷酸類似物，如合成的核苷酸類似物。對本發明而言，其中核芬酸類似物指包括肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA),或者骨架或糖修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核酸。此外，本發明核酸序列中的核苷酸任選被相應的能與互補核酸序列形成類似氫鍵的核苷酸取代。這種取代的例子是U被T取代。產澱粉植物中導入澱粉蔗糖酶編碼序列是指向所述植物提供澱粉蔗糖酶編碼序列，這樣所述序列在所述植物的細胞中內化。本文包括其中所述植物在導入澱粉蔗糖酶編碼序列前最初不包含澱粉蔗糖酶編碼序列，以及其中所述植物最初包含澱粉蔗糖酶編碼序列的情況。功能性連接於其他序列，例如顆粒靶向序列和啟動子序列的澱粉蔗糖酶編碼序列的導入，可通過將核酸導入本領域技術人員可獲得的細胞中的任何方法實現。將核酸導入細胞的方法包括基因轉移和轉化方法。基因轉移和轉化方法的例子是通過4丐、聚乙二醇(PEG)或電穿孔介導的DNA攝入、植物組織電穿孔、微注射、碳化矽介導的DNA攝入和微粒轟擊的原生質體轉化。優選轉化方法是載體介導的轉化和/或農桿菌介導的轉化方法。非常優選的轉化方法是根癌農桿菌介導的轉化方法。導入的序列優選在所述植物中穩定表達的。因此，本發明的方法優選包含所述序列整合到所述植物細胞的基因組中。整合確保長期、可再現和確定的基因表達。下面更詳細討論的是，沒有與顆粒靶向序列連接的澱粉蔗糖酶編碼序列對一些澱粉特性也有影響。在優選實施方案中，根據本發明的澱粉蔗糖酶編碼序列功能性地連接顆粒靶向序列。顆粒靶向序列是靶向澱粉顆粒，即選擇性針對和/或結合澱粉顆粒的任何序列。所述顆粒耙向序列優選的例子包含馬鈴薯顆粒結合澱粉合酶(GBSSI)和澱粉結合域(SBD)。可以使用的顆粒靶向序列進一步的例子為生物條件下連接澱粉的酶的那些部分，和/或已知降解澱粉的酶的結合域。在本發明的優選實施方案中，所述顆粒靶向序列包含SBD編碼序列。SBD屬於碳水化合物結合組件(CBMs)家族。CBM通常指帶有具有碳水化合物結合活性的恰當摺疊的碳水化合物活性酶中的連續胺基酸序列。此定義的個別例外為纖維素體支架蛋白中的CBMs和獨立的推定CBMs。CBMs作為更大酶中組件存在的要求使此類碳水化合物結合蛋白有別於其他非催化糖結合蛋白，如凝集素和糖轉運蛋白。對本發明而言，SBD優選阿爾法葡聚糖結合域家族的成員，更優選阿爾法葡聚糖結合域家族20、21、25、26、34或41的成員。SBD編碼序列通常是核酸序列。由於SBD性質上一般與降解酶結合，所以SBD實際上主要涉及澱粉降解的情形。但是本發明的方法在不同情形即在澱粉生物合成中使用SBD。SBD通常約IOO個胺基酸長度。雖然由於其摺疊和推定的3D結構，SBD的胺基酸序列在不同酶和不同種中不是非常保守，但仍被歸為相似的(Machovic，2005)。對本發明而言，SBD例如來自a-澱粉酶、P-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或CGT酶。生成包含SBD的酶的種例如黑麴黴、環狀芽孢桿菌、淤泥鏈黴菌、熱產硫磺梭菌、施氏假單胞菌或肺炎克氏桿菌。根據本發明的SBD編碼序列編碼與芽孢桿菌生成的SBD優選至少70。/。，更優選至少80%,更優選至少90%，更優選至少95%,最優選95%以上同源或一致的SBD,其中所述芽孢桿菌優選環狀芽孢桿菌，其中所述SBD編碼序列優選環糊精葡萄糖基轉移酶(Lawsoneta1.1994)。優選地，根據本發明的SBD編碼序列編碼與圖11所示SBD至少70%、更優選至少80%、更優選至少90%、更優選至少95%、最優選95%以上同源或一致的SBD。本發明的一個實施方案中，所述SBD編碼序列中一個或多個核酸被保守取代。在優選實施方案中，SBD是環糊精葡萄糖基轉移酶的SBD和/或來自環狀芽孢桿菌的SBD。在另一優選實施方案中，根據本發明的SBD或其他顆粒靶向序列與環狀芽孢桿菌環糊精葡萄糖基轉移酶的SBD的大小近似或完全相同，即IO-14kDa,優選12kDa。在本發明的一個實施方案中核酸包含超過一個顆粒耙向序列，例如兩個、三個、四個或五個。文中定義為使基因轉錄的序列，優選核酸序列，其中所述轉錄將至少發生在所述澱粉儲存器官中和/或毗鄰所述澱粉儲存器官。所述啟動子在本發明的一個實施方案中是所述澱粉儲存器官特異性的。所述啟動子的所述特異性是僅對所述澱粉儲存具特異性，或對於所述澱粉儲存器官和所述植物的其他組成部分而言是特異性的。或者所述啟動子是一般性啟動子(即優選植物所有部分中活性的和/或優選所有條件下活性的啟動子)。在本發明一個實施方案中，所述啟動子是誘導啟動子。對本發明而言，澱粉儲存器官指其中積累澱粉的植物的一部分。這樣的部分的例子包括塊莖、莖、根、種子或種子胚乳。優選的部分是塊莖，優選的塊莖是馬鈴薯。組織特異性啟動子的例子列於表2，優選的啟動子是馬鈴薯的馬鈴薯塊莖蛋白啟動子。在優選實施方案中，本發明提供根據本發明的方法，其中所述核酸進一步功能性連接於澱粉形成體靶向序列。在本發明的另一優選實施方案中，提供根據本發明的方法，其中所述澱粉形成體耙向序列包含轉運肽編碼序列。對本發明而言，包含轉運肽編碼序列的澱粉形成體靶向序列指至少對澱粉形成體具特異性的序列，其中所述轉運肽編碼序列將所述序列特異性地導向澱粉形成體。澱粉形成體靶向序列的優選例子是鐵氧還蛋白轉運肽編碼序列。轉運肽的進一步例子是馬鈴薯GBSSI轉運肽、分支酶(BEI和/或BEII)的轉運肽、R-酶(水二激酶)和可溶性澱粉合酶I、11和/或III，和/或異澱粉酶的不同同工型(Stisal、Stisa2和Stisa3)。對本發明而言，功能性連接的序列指包括連接的序列，這樣所有涉及的序列導入生成澱粉的植物時定向同樣的位置，這樣所有涉及的序列能互相配合發揮其特有功能。所述功能性連接可通過不同類型的結合實現。進一步地，所述序列可直接互相連接，或間接連接。直接連接的序列的例子為一個核酸構建物中臨近相互連接的序列。或者序列是間接連接的，例如所述序列在相同的核酸構建物中，但一個或多個其他序列(例如框內接頭序歹'j(inframelinkersequence))在功能性連接的序列之間，或者例如所述序列在不同的核酸構建物中，並功能性連接。在本發明方法的一個實施方案中，另外的序列被導入生成澱粉的植物中。所述另外的序列或者功能性連接前述核酸序列，或者沒有功能性連接但在導入所述前述序列的同時和/或之前和/或之後被導入。所述另外的序列例如編碼在所述澱粉和/或植物中形成進一步修飾的化合物。所述化合物例如酶，如澱粉分支酶、乙醯轉移酶、曱基化酶和R-酶。所述R-酶是參與澱粉磷酸化的葡聚糖酶水二激酶GWD。由於細胞的澱粉儲存器官可有利地用於生成蛋白質，所以在本發明的一個實施方案中所述化合物是蛋白。其他另外的序列是導入序列的表達中必須和/或有幫助的序列，所述另外的序列優選功能性連接所述導入序列。這樣的另外的序列的例子為啟動子或終止子序列。在優選實施方案中，本發明提供改良生成澱粉的植物的方法，其包含將包含澱粉蔗糖酶編碼序列的核酸導入本發明所述植物的合適植物材料中，該澱4分蔗糖酶編碼序列功能性連接於顆粒輩巴向序列，並功能性連接於所述植物的澱粉儲存器官中的活性啟動子序列，或本發明提供了生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法，其包含將包含澱粉蔗糖酶編碼序列的核酸導入所述植物的合適植物材料中，並從所述材料生成植物，所述澱粉嚴糖酶編碼序列功能性連接於顆粒靶向序列，並功能性連接於植物澱粉儲存器官中活性啟動子序列，其進一步包含使所述植物生長，並從所述植物收集澱粉，其中假如所述另外的序列不是分支酶和/或假如之前尚未向所述合適植物材料提供編碼分支酶序列，則任一所述方法進一步包含導入另外的序列。本發明的方法優選包含篩選步驟。所述篩選步驟在導入根據本發明的序列後進行，並包含植物的篩選，其中所述導入的序列被表達，優選穩定表達。篩選其中序列被導入和/或表達的植物和/或細胞的各種體系對本領技術人員而言是可獲得的。為了便於所述篩選，在本發明的方法中核酸優選功能性連接篩選標記。或者篩選標記沒有功能性連接所述核酸，但與所述核酸同時導入，例如在第二共同轉染的載體上共同表達。篩選標記包含有助於確定是否序列已導入和/或在植物和/或細胞中穩定表達的序列。篩選標記優選包含賦予抗性的序列，例如賦予抗生素抗性的序列。這樣的賦予抗性的序列的例子是編碼新黴素磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)，或穀氨醯胺合成酶的序列。在一個實施方案中，所述賦予抗性的序列作為篩選盒導入，即包含至少對誘導所述賦予抗性的序列的表達具特異性的啟動子序列，並進一步包含至少終止所述導入的賦予抗性的序列的終止子序列而導入。在本發明方法的優選實施方案中，載體用於將序列導入產澱粉的植物中。在此實施方案中，所述賦予抗生素抗性的序列優選包含在所述載體中。所述載體進一步優選包含其他序列，其中所述其他序列優選用於噬菌體克隆，例如多接頭序列。載體優選的例子為商業上可獲得的載體pBlueScript。在本發明的另一實施方案中，本發明的方法無需《吏用篩選標記即可進行。在此實施方案中，優選使用無標記轉化的方法，例如在WO03/010319中有描述。在優選實施方案中，本發明提供根據本發明的方法，其中包含功能性連接於顆粒靶向序列並功能性連接啟動子序列的所述核酸編碼融合蛋白。對本發明而言，融合蛋白指通過基因工程從兩個或多個蛋白/肽創造的。這是通過創造融合序列實現的。為創造融合序列，優選除去第一蛋白核酸序列的終止密碼子，隨後第二蛋白的核酸序列框內附接。當兩個序列為蛋白和/或肽編碼序列時，優選加入接頭或間隔肽編碼序列，以促進得到的融合蛋白中所述序列編碼的蛋白和/或肽部分的獨立摺疊。因此在一個實施方案中，本發明提供包含澱粉蔗糖酶編碼序列、澱粉結合域(SBD)編碼序列和啟動子序列的核酸。優選地，所述核酸不包含另外的編碼分支酶的另外的核酸序列。在本發明的一個實施方案中，所述核酸中包含的所述啟動子為塊莖專一性啟動子。在另一實施方案中，本發明提供包含澱粉蔗糖酶和澱粉結合域(SBD)的融合蛋白。優選地，所述融合蛋白不包含分支酶。所述核酸或所述融合蛋白的澱粉結合域優選與圖ll中所示SBD序列至少70。/。，更優選至少80%,更優選至少90%，更優選至少95%,最優選超過95%同源或一致。本發明進一步提供根據本發明的融合蛋白，其進一步包含澱粉形成體轉運肽。在優選實施方案中，本發明提供根據本發明的融合蛋白，其中所述澱粉結合域包含環糊精葡萄糖基轉移酶的澱粉結合域。在優選實施方案中，本發明提供融合蛋白，其中顆粒靶向序列編碼的序列位於澱粉蔗糖酶的N或C端側。所述顆粒靶向序列優選澱粉結合域。在本發明的優選實施方案中，所述顆粒靶向序列位於澱粉蔗糖酶的N端側，即順序為N-(顆粒靶向序列)-(澱粉蔗糖酶)-C。因此在本發明的優選實施方案中，糹艮據本發明的方法包含將核酸導入產澱粉的植物中，該核酸包含功能性連接於顆粒靶向序列，並功能其中所述功能性連接的顆粒靶向序列導入比所述澱粉蔗糖酶編碼序列更靠近啟動子的位置。在本發明一個實施方案的例子中闡明，此例子中為SBD的顆粒靶向序列的位置對得到的融合蛋白的特性有顯著影響。本發明此實施方案中所述位置例如影響植物中融合蛋白的積累水平。此實施方案中所述積累水平進一步與改變的澱粉顆粒百分比有關。在本發明的此實施方案中，更高水平的積累產生更高百分比的改變的澱粉顆粒。被本發明提供的方法和工具改變的重要特性是澱粉顆粒大小。顆粒大小對澱粉應用而言是重要因素。取決於生物來源，澱粉顆粒大小變化可從小於lpm至大於100fxm。以馬鈴薯為例，澱粉顆粒大小變化範圍5至10(im。由於顆粒大小在許多工業應用中是如此重要的因素，因而工業界對改變澱粉顆粒大小感興趣。通過分離技術得到具有特定所需大小的澱粉顆粒是可能的，例如作為澱粉加工過程一部分的氣流篩分(windshifting)、千或溼篩或通過旋液分離器分離。但是這樣的分離需要加工中額外的步驟，導致效率損失。因此，如果能通過改變植物中澱粉的生成控制澱粉顆粒大小，這樣植物生成的澱粉顆粒大小被改變，則是有利的。本發明提供通過提供生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法來提供這樣的控制方法，其包含向產澱粉的植物導入澱粉蔗糖酶編碼序列。澱粉蔗糖酶的生物學功能是來自蔗糖的直鏈澱粉樣聚合物的合成。本領域技術人員應預期，產澱粉植物中導入澱粉蔗糖酶編碼序列會對澱粉顆粒的直鏈澱粉含量有影響。然而本發明公開了其中產澱粉植物中導入澱粉蔗糖酶編碼序列後，未導致直鏈澱粉含量的明顯變化的試驗。另一方面，顆粒大小沒有明顯變化。因此，本發明在一個實施方案中提供生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法，其包含將包含功能性連接於顆粒靶向序列，並功能性連接於植物澱粉儲存器官中活性啟動子序列的澱粉蔗糖酶編碼序列的核酸導入所述植物的合適植物材料中，並從所述材料生成植物，其進一步包含使所述植物生長，並從所述植物收集澱粉，其中所述改變包含澱粉顆粒大小的增加。在另一實施方案中，本發明提供改良產澱粉植物的方法，其包含將包含功能性連接於顆粒靶向序列，並功能性連接於所述植物澱粉儲存器官中活性啟動子序列的澱粉蔗糖酶編碼序列的核酸導入所述植物的合適植物材料中，其中所述改變包含澱粉顆粒大小的增加。澱粉顆粒大小的所述增加指與未導入澱粉蔗糖酶編碼序列的同種和/或類似種的植物，即與對照植物的澱粉顆粒大小相比的增加。所述增加可以是絕對增加，即所述對照植物沒有或一般沒有生成具有所述增加的顆粒大小澱粉的澱粉顆粒，和/或所述增加可以是平均顆粒大小的增加。本發明的方法優選澱粉顆粒大小增加1.5，更優選增加1.6，更優選增加1.7，更優選增加1.8，更優選增加1.9，最優選增加2.0或更多。本發明的實施例表明澱粉蔗糖酶融合蛋白表達的顆粒大小增加。馬鈴薯植物中包含澱粉蔗糖酶和澱粉結合域的融合蛋白的表達導致澱粉顆粒大小增加大約兩倍。因為澱粉顆粒大小的增加例如改善溼磨效率，並因此改善澱粉得率，所以澱粉顆粒大小的增加例如對於更小的澱粉，如玉米、芋頭和木薯澱粉通常是所需的。除絕對增加外，所述增加為相對增加，例如顆粒大小分布的改變，其中所述分布向更大顆粒移動。因此，本發明在一個實施方案中提供了根據本發明的方法，其中所述改變和/或變化包含所述植物生成的澱粉顆粒大小分布向更大顆粒移動。產澱粉的植物生成不同大小的澱粉顆粒。植物生成的每種澱粉類型有其特有的大小分布。因此澱粉顆粒大小被有利地表示為大小的分布。所述大小的分布例如表明澱粉顆粒大小的一致性。本發明的方法在一個實施方案中增加澱粉顆粒大小的所述一致性，例如實施例的圖9表示的。工業應用中使用的澱粉例如優選澱粉顆粒大小一致。例如包含具有更一致大'J、顆粒的澱粉有更一致的凝膠化作用特性，這在許多加工過程中是有利的。在另一實施方案中，本發明提供根據本發明的生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法，其中所述改良和/或改變進一步包含澱粉顆粒形態學的改變。所述澱粉顆粒形態學指所述澱粉顆粒的形狀或形式。所述形狀或形式的外在方面例如通過光學和/或掃描電鏡(SEM)可見。澱粉顆粒形態學的所述改良例如包含澱粉顆粒表面加上多糖。所述澱粉顆粒形態學的所述改良優選使澱粉顆粒與對照植物的澱粉顆粒相比外形粗糙的改良。所述粗糙的外形例如包括所述澱粉顆粒表面突出和壓痕都更多。進一步地，澱粉形態學的所述改變包括相對於對照植物生成的澱粉顆粒有更多的孔隙。所述更多孔隙的澱;盼顆粒至少外層孔隙更多。由於更多孔隙的特性改善例如工業應用的衍生化過程，所以更多孔隙的澱粉顆粒是有利的。所述衍生化過程包括所有衍生化過程，但優選化學衍生化過程。本發明公開了澱粉蔗糖酶的表達，甚至沒有導入顆粒靶向序列即可影響澱粉顆粒形態學。因此，本發明在一個實施方案中提供了製備具有至少一種根據本發明的改變特性的澱粉的方法，其中所述改變包含澱粉顆粒形態學的改變。在另一實施方案中，本發明提供改良根據本發明的產澱粉的植物的方法，其中所述改良包含澱粉顆粒形態學的改變。但是優選地，本發明提供改良生成澱粉的植物和/或生成具有至少一種根據本發明的改變特性的澱粉的方法，其包含向生成澱粉的植物導入核酸，該核酸包含功能性連接於顆粒靶向序列，並進一步糖酶編碼序列。基於沒有顆粒靶向序列的澱粉蔗糖酶也影響顆粒形態學的事實，本發明在另一實施方案中提供改良產澱粉的植物的方法，其包含將核酸導入所述植物的合適植物材料中，該核酸包含功能性連接"蔗糖酶編碼序列，或生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法，其包含將核酸導入所述植物的合適植物材料中，該核酸包含功能性連接於所述植物澱粉儲存器官中活性啟動子序列的澱粉蔗糖酶編碼序列，並從所述材料生成植物，進一步包含使所述植物生長，並從所述植物收集澱粉。正如試驗部分中本文所述的，與澱粉蔗糖酶的N端偶聯的顆粒靶向序列以及僅澱粉蔗糖酶得到可消化性增加，尤其是被Ot-澱粉酶消化的可消化性增加的澱粉。一般a-澱粉酶對馬鈴薯澱粉消化得不是非常好，因此改善澱粉可接近性必需的oc-澱粉酶量多。本發明現在提供具有提高的可消化性的澱粉，這意味著釋放了更多的糖，因此可得到更高的熱量值。因此，本發明還提供改良產澱粉植物的方法，其包含將核酸導入所述植物的合適植物材料中，該核酸包含功能性連接於所述植物澱粉儲存器官中活性的啟動子序列，並任選地N端功能性連接於顆粒耙向序列的澱粉蔗糖酶編碼序列，或提供生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法，其包含將核酸導入所述植物的合適植物材料中，並從所述材料生成植物，所述核酸包含功能性連接於所述植物澱粉儲存器官中活性的啟動子序列，並任選地N端功能性連接於顆粒耙向序列的澱粉蔗糖酶編碼序列，進一步包含使所述植物生長並從所述植物收集澱粉。優選地，所述改良或改變包含可消化性增加，甚至更優選a-澱粉酶可消化性增加。優選改變的澱粉和/或澱粉顆粒的特性是澱粉黏性。所述澱粉黏性例如通過澱粉黏性分布作圖測量。改變的澱粉黏性參數的例子是峰黏度、糊化起始溫度和澱粉糊黏度。本發明因此在一個實施方案中提供根據本發明的生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法，其中所述改變的特性是澱粉韻度。本發明在另一實施方案中提供根據本發明的澱粉，其中與對照植物的澱粉顆粒相比至少改變了一種澱粉顆粒的一種特性，其中所述特性為澱粉都度。在優選實施方案中，澱粉黏度降低。這意味著當應用於工業體系或加工時，此澱粉不必用氫氧化鈉大規模降解。因而可降低使用的NaOH的量。本發明在一個實施方案中提供包含根據本發明的核酸和/或融合蛋白的細胞。進一步地，本發明提供包含根據本發明細胞的植物或其部分，或根據本發明的方法製備的植物或其部分。植物的所述部分可以是植物的任何部分，但優選澱粉儲存器官。因此，本發明在優選實施方案中提供根據本發明的植物的部分，其中所述部分為澱粉儲存器官。在本發明的優選實施方案中，所述植物為馬鈴薯植物。本發明因此在優選實施方案中提供根據本發明的植物或其部分，其中所述植物是馬鈴薯植物。在另一優選實施方案中，本發明提供根據本發明的植物或其部分，其中所述部分是塊莖。在本發明的優選實施方案中，所述塊莖是馬鈴薯。儘管本發明適合任何產澱粉的植物，但所述植物優選含直鏈澱粉的植物。因此本發明在優選實施方案中提供根據本發明的植物或其部分，其中所述植物為含直鏈澱粉的馬鈴薯植物。本發明提供生成澱粉的新方法和工具。本發明因此提供通過根據本發明的方法可獲得和/或獲得，和/或從根據本發明的植物和/或其部分可獲得和/或獲得的澱粉。在本發明的一個實施方案中，相對於未導入澱粉蔗糖酶編碼序列的相同種植物，即對照植物生成的澱粉顆粒，澱粉顆粒的特性改變。本發明因此提供根據本發明的澱粉，其中與對照植物的澱粉顆粒相比，一種澱粉顆粒的至少一種特性改變。優選改變的特性為澱粉顆粒大小。本發明因此提供根據本發明的澱粉，其中所述特性為澱粉顆粒大小。與對照植物相比，所述顆粒大小優選增加的。本發明因此在優選實施方案中提供根據本發明的澱粉，其中所述澱粉顆粒大小是增加的。優選改變的另一特性為澱粉顆粒形態學。本發明因此在一個實施方案中提供根據本發明的澱粉，其中進一步地澱粉顆粒形態學改變。本發明還提供根據本發明的澱粉和/或澱粉顆粒的衍生物。這樣的衍生物的例子為加工的澱粉，澱粉的支鏈澱粉組分和衍自澱粉顆粒的蛋白組分，其中編碼蛋白的至少一種另外的序列被導入產澱粉的植物。優選地，當與不包含澱粉蔗糖酶的植物生成的澱粉相比，平均澱粉顆粒大小更大。而且大小分布更小。此外，本發明提供包含根據本發明的植物或其部分，和/或根據本發明的澱粉和/或澱粉顆粒的任何產物。根據本發明的產物例如為食品和/或工業產品。工業品的例子為紙產品、織物經紗添加劑和粘合劑化合物。食品的例子例如炸馬鈴薯片、麵包或穀類食物。本發明因此在一個實施方案中提供食品和/或工業品，其包含根據本發明的植物或其部分，和/或根據本發明的澱粉。本發明進一步在一個實施方案中提供細菌，優選農桿菌，更優選根癌農桿菌，其包含功能性連接於顆粒靶向序列，並功能性連接澱粉儲存器官中活性啟動子序列的澱粉蔗糖酶編碼序列，和/或包含根據本發明的融合蛋白。本發明進一步提供本發明提供的所有工具的用途。本發明因此例如提供用功能性連接於顆粒靶向序列，並功能性連接澱粉儲存器官中活性啟動子序列的澱粉蔗糖酶編碼序列，生成具有至少一種改變特性的澱粉的用途。本發明還提供根據本發明的融合蛋白、細胞、植物或其部分、澱粉和/或產物的用途。本發明將在下面的非限制性實施例中更詳細地解釋。實施例材料和方法種建輛餅在此研究中製備了三個不同的構建物，pBIN20/AS-SBD和pBIN20/SBD-AS質粒用於在含有直鏈澱粉的馬鈴薯植物(Kardal)中分別表達AS-SBD和SBD-AS融合蛋白。pBIN20/AS質粒用作對照，其中澱粉蔗糖酶在沒有顆粒(SBD)靶向序列的情況下導向澱粉形成體。pBIN20/AS-SBD質粒如下構建AS-SBD基因的表達盒首先在pBlueScript載體中由三個DNA片段裝配(1)塊莖特異性馬鈴薯塊莖蛋白啟動子和鐵氧還蛋白信號序列(XhoI-BamHI)，(2)AS-SBD片段(Bamffl-Pstl)，以及(3)NOS終止子序列(EcoRV-KpnI)。AS-SBD片段(BamHI-PstI)由pTrcHisB/AS-SBD質粒，通過PCR,使用下列引物擴增5'-CGAAAAGGATCCCCCGAAT-3'和5'-TCTCTGCAGCGCCAAAACA-3',所述引物分別含有BamHI和Pstl位點。pBlueScript/AS-SBD用Xhol和Kpnl消化，片段(XhoI-Kpnl)插入pBIN20載體的相應位點，得到質粒pBIN20/AS-SBD(圖1)。馬鈴薯塊莖中累積的期望AS-SBD融合蛋白的大小預計分子量為86,468Da,不包括轉運肽。為製備pBIN20/SBD-AS質粒，SBD-AS片段(Bamffl-Pstl)由pTrcHisB/SBD-AS質粒，通過PCR,用引物5'-TGACGAAAAGGATCCATTGTC-3'和5'-TACTGCAGGCATTTGGGAA-3'擴增，所述引物分別含有BamHI和Pstl位點。擴增的SBD-AS片段(BamHI-Pstl)用於取代pBlueScript/AS-SBD質粒中的AS-SBD片段，生成質粒pBlueScript/SBD-AS。其餘過程與pBIN20/AS-SBD所述的同樣進行。得到的質粒稱為pBIN20/SBD-AS(圖1)。馬鈴薯塊莖中累積的SBD-AS融合蛋白預期分子量為86,110Da，不包括轉運肽。為製備pBIN20/AS質粒，通過PCR擴增，使用pGSTAS質粒為模板，用引物5'-CGAAAAGGATCCCCCGAAT-3'和5'-TACTGCAGGCATTTGGGAA-3'得到澱粉蔗糖酶編碼片段，所述引物分別含有BamHI和Pstl位點。植物表達的AS預期分子量為72,466Da,不包括轉運肽。所有構建物由DNA測序證實。一i參/一^，存^根據Visseretal(1991)所述的三元雜交方案，pBIN20/AS、pBIN20/AS-SBD和pBIN20/SBD-AS質粒轉化到根癌農桿菌中。含有直鏈澱粉(Kardal)的馬鈴薯節間莖部分用於含所述質粒的農桿菌介導的轉化(Visseretal,1991)。收集每種構建物的超過50個獨立的苗。檢測苗在含有卡那黴素(IOOmg/L)的MS30培養基中的根部生長(MurashigeandSkoog，1962)。繁殖每種構建物的三十林轉基因形成根的苗，轉移到溫室進行塊莖發育。此外10林未轉化的對照在溫室中生長。此研究中得到的轉化體系列稱作KDAxx、KDAS:o:和KDSA，其中A、AS和SA分別代表澱粉蔗糖酶、澱粉蔗糖酶-SBD和SBD-澱粉蔗糖酶融合蛋白，xx代表克隆號。此研究中KD-UT表示未轉化的對照植林。AS差^脊z夷參^"fW確定總RNA根據Kuipers"fl/.(1994)使用5g(鮮重)馬鈴薯塊莖材料，從水凍植物材料製備。電泳(1.5%(w/v)瓊脂糖、15%曱醛(w/v))後,RNA轉移到尼龍膜Hybond-N(Amersham,Amersham，UK)上過夜。膜在pH-7.2，含7%(w/v)SDS、0.5。/。磷酸鈉(w/v)緩衝液和lmMEDTA的改良church緩沖液中65。C雜交過夜。膜用["P]標記的澱粉蔗糖酶DNA片段(BamHI-Pstl)為探針進行雜交；用ra^primeTMlI試劑盒(Amersham，Amersham,England)根據製造商操作指南進行標記。膜於65。C用2xSSC洗滌一次5分鐘，用lxSSC洗滌30分鐘，每種都含0.1%(w/v)SDS。塊敘婦為、庠合併來自每種溫室生長克隆的五棵植抹的所有塊莖，用/MC屍^/er去皮器(Spangenberg，TheNetherlands)除去植抹的皮去皮的塊莖用S朋am^Aotor(Spangenberg)勻漿，經篩過濾去掉顆粒物質。得到的勻漿4。C使其沉降至少20分鐘至過夜，收集塊莖汁備用，-20。C保存。澱粉沉澱物水洗三次，最後室溫風乾(JiW"/.,2003)。蛋^#,《伊遂々#確;€餘差^/定粉的^^^1)^S5D-AS蛋^含#12.5。/。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺(SDS-PAGE)凝膠(50x50x3mm)，帶9個等間距的孔(0=9mm)，與類似大小HybondECL硝酸纖維素膜(AmershamPharmaciaBiotech,UK)接觸。20mg(轉基因)澱粉力。200iliL2xSDS樣品緩沖液(MurashigeandSkoog,1962)加熱煮沸5分鐘。冷卻至室溫，澱粉凝膠轉入其中一個孔中。轉基因澱並分凝膠的蛋白用PhastSystem(Pharmacia,Uppsala,Sweden;20V，25mA,15。C,45min)(JiWfl/.，2003)印跡到膜上。AS-SBD和SBD-AS融合蛋白根據Ji"a/.(2003)所述的方法，用抗SBD抗體鑑別。蛋^,乂伊遂為V/f確定塊JV/^AS-幼"和幼Z)"S蛋冷舍量可溶組分中的AS-SBD和SBD-AS融合蛋白如下確定。500^L塊莖汁冷凍乾燥。乾燥的材料溶解在200pL2xSDS樣品緩沖液中，在有20mg對照樣品的澱粉存在下煮沸5分鐘。現有的澱^f分凝膠加到SDS-PAGE凝膠的其中一個孔裡。其餘過程與顆粒結合蛋白質中所述的同樣方式進行。鵬潛合凝合蛋《伊遂》Vf澱粉顆粒結合蛋白的免疫印跡如Nazarian"(2006b)所述，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行。50毫克的KDAS2和KDSA2幹澱粉樣品溶解在1mLSDS樣品緩衝液(終濃度1MTris-HCL，pH6.8,2%SDS(w/v),10。/。甘油(w/v),3%卩陽巰基乙醇(w/v))中煮沸2分鐘，然後進行凝膠分析。25微升上樣到12%聚丙烯醯胺凝膠凝膠的泳道上(145mmx95mmx3mm,BioRad,UK)。蛋白轉移到HybondECL硝酸纖維素膜(AmershamPharmaciaBiotech,Amersham，UK)上，如之前部分所述用抗SBD進行免疫印跡。澱為、微辦/緒#》、#澱粉平均顆粒大小和顆粒大小分布用配有IOO]um孔管(Beckman-Coulter，HighWycombe,UK)的CoulterMuldsizerII確定。大約10mg澱粉分散在160mL的IsotonII中。顆粒大小分布通過計數記錄為約50,500(±500)個顆粒。重合(兩個顆粒同時進入管的頻率，因此被計為一個)設為10%。澱粉顆粒形態學用光學顯微鏡(LM,Axiophot,Oberkochen，Germany)和掃描電鏡(SEM,JEOL6300F,Tokyo,Japan)研究。使用LM時，澱粉顆粒用20x稀釋的Lugol，s溶液(1。/。12/KI)染色。使用SEM時，乾燥澱粉顆粒用雙面的粘性碳月交帶(EMS,Washington,U.S.A.)封固在黃銅架上，濺射包被金(EdwardsS150B,Crawley,England),隨後轉移到FESEM(JEOLJSM-6300F，Tokyo,Japan)。用SE^r測分析樣品並記錄，於5kV、工作距離15mm。所有圖{象以掃描速率100秒(全幀)、2855x2154，8比特大小，數字記錄(Orion，6E丄丄sprl,Belgium)。表觀直鏈澱粉含量根據Hovenkamp-Hermelink"(1989)所述的方法確定。澱粉顆粒開始膠凝的溫度用差示掃描量熱法(DSC)，使用配有NeslabRTE-140glyco-冷卻器的Perkin-ElmerPyris1(Perkin-Elmer,Vlaardingen，TheNetherlands)確定(Ji"a/"2003)。澱粉凌佔度參數使用ThermoHaakerheoscope(ThermoHaake，Karlsruhe,Germany),由5%(w/v)和2。/。(w/v)澱粉混懸液測量。該機器配有平行板機構(類型C70/1Ti),縫隙大小0.1mm。記錄振蕩剪切應變，頻率為lHz。將澱粉混懸液(5%和2%)每分鐘2°C，由40。C升至90。C，90。C保持15分鐘，以2。C/分鐘冷卻至20。C，恆定溫度20。C保持15min,得到所述澱粉混懸液的糊化分布圖。測量澱粉特性，如Tg(開始膠凝溫度)、Tp(峰值溫度)和相應溫度。隨後為檢查線性粘彈性區域的測量線性，將樣品置于振幅掃描區域，其中應力和應變振幅互成比例。/定為、含f^確定大約50mg馬鈴薯塊莖材料於60。C溶解在0.5mL25%HC1和2mL二曱亞碸(DMSO)中1小時。孵育後混合物用5MNaOH中和，並用O.lM檸檬酸鹽緩衝液(pH4.6)稀釋至終體積10mL。20pL的水解澱4分才羊品用測試試劑盒(Boehringer-Mannheim，Mannheim,Germany),根據製造商的說明酶解測定。脊J:^/定粉鏈長為、有為測試鏈長分布，5mg轉基因馬鈴薯澱粉混懸在250^DMSO中，沸騰溫度下膠凝化10分鐘。冷卻至環境溫度，加入PH4.0的700^150mMNaAc緩衝液。往混合物加入足量的使澱粉聚合物完全去分支的月夷澱淨分酶(HayashibaraBiochemicallaboratories,Okayama,Japan;59,000U/mg蛋白)，混合物40。C培養2小時。沸騰溫度下酶失活10分鐘後，加入lml25%DMSO。照這樣使用樣品，進行高效尺寸排阻色譜(HPSEC)。HPSEC在配有串聯的三個TSKgdSWXL柱(一個G3000,兩個G2000:300mmx7.5mm;Montgomeryville,USA)和TSKgelSWX1保護柱(40mmx6mm)的p680HPLC泵系統(Dionex，Sunnyvale,Cal.USA)上，於35。C下進行。使用戴安ASI-IOO自動進樣器進樣IOOfxl等分，隨後用IOmMNaAc緩衝液(ph5.0),流速0.35ml/min洗脫(3h運行)。流出物用RID-6A折射計(Shimadzu,theNetherlands)監測。系統用葡聚糖標準(10,40,70,500kDa;Pharmacia)校準。用Dionexchromelon軟體版本6.50SP4BuildIOOO控制HPLC系統並進行數據處理。HPAEC用來更好地分離更小的支鏈澱粉側鏈(245個葡萄糖殘疾範圍內)。HPAEC在配有carboPacPA100柱(4mmx250mm;Dionex)的GP40梯度泵系統(Dionex)上，於35。C進行。流速為1.0mL/min,用DionexAS3500自動進樣器進樣20pl。使用兩種洗脫液，洗脫液A(100mmNaOH)和洗脫液B(1MNaAc的100mmNaOH溶液)，混合以下梯度0—5分鐘，100%洗脫液B(淋洗階段)；5—20分鐘，100%洗脫液A(調節階段)；20—25分鐘，線性梯度0—20%洗脫液B(100—80。/。洗脫液A);25—50分鐘，線性梯度20—35。/。洗脫液B(80—65。/。洗脫液A);50—55分鐘，線性梯度35—50。/。洗脫液B(65—50。/。洗脫液A);55—60分鐘，50。/。洗脫液B(50。/。洗脫液A)。樣品在20分鐘時進樣。洗脫液用脈衝安培計模式的ED40電化學檢測器(Dionex)監測。,r絲鰣為、絲潛10mg部分(轉基因)塊莖澱粉在含有10mM蔗糖的1mL50mMTris-HCl(pH7.0)中，於40。C持續混合下孵育48和96(小時)。孵育後，樣品離心(7，500x&10min)，收集上清,根據Nazarian"(2006a)所述，通過HPAEC測量蔗糖、葡萄糖和果糖濃度。澱粉沉澱用水洗三次，室溫風乾。用異澱粉酶去分支後，澱粉用HPAEC和GPC檢測不同鏈長分布。絲棘經a-澱為、麟贈20mg(轉基因)澱粉混懸在lmL50mMNaOAc緩沖液(pH6.9)中，用10uoc-澱粉酶(豬胰臟，Sigma,TheNetherlands),於37°C處理4小時。未加入a-澱粉酶的樣品用作對照。孵育後，樣品離心(13000xg，2min)。根據Dubois通過酚-硫酸分析法分析總的糖含量，包括上清的葡萄糖和麥芽低聚糖(MOS)。結果澱為、^"潛雜^脊差^/定粉覆粒^v,濕邀分農積在此研究中，由多糖奈瑟球菌的成熟澱粉蔗糖酶和環狀芽孢桿菌環糊精葡萄糖基轉移酶的澱粉結合域(SBD)編碼區組成的三個不同的開放閱讀框(ORFs)在pBIN20雙載體中製備。馬鈴薯的馬鈴薯塊莖蛋白啟動子的950個鹼基對片段(Wenzler"a/.,1989)以及葉綠體鐵氧還蛋白信號肽(PilonWa/.,1995)置於ORFs的5'端，分別誘導其塊莖特異性表達和澱粉形成體進入(圖l)。經溫室生長，與對照植物比較，就形態學和表現型而言，植物看上去正常。使用蛋白質點印跡分析，用抗SBD血清，考察A&x和SAxx系列轉基因馬鈴薯植物中融合蛋白的表達(Ji"a/.，2003)。根據突變體flw/系列中SBD2的表達，用從0+至6+的數字，使用打分方法(Jie,a/.,2004)。轉基因馬鈴薯植物分成6個不同的類別，用0+表示無蛋白，用6+表示融合蛋白累積的最高水平(圖2A)。基於蛋白質點印記分析的融合蛋白轉化體的篩選表明，具有更高量融合蛋白累積的轉化體比具有較少融合蛋白累積的轉化體多(圖2B)。從AS-SBD轉化體的30個中的n個(56.70/。)和SBD-AS轉(X2=12.56,PO.OOl)。此外，顆粒靶向序列(SBD)的位置似乎影響融合蛋白的累積水平，即SBD-AS融合蛋白的累積量顯著大於(乂2=9.36,PO.001)AS-SBD融合蛋白，因為差不多所有SBD-AS轉化體(除了0+類中的3個)顯示的強度與4+相當或更高(圖2B),而未衝企測到具有更低蛋白累積的轉化體。對選定轉化體的馬鈴薯汁液可溶性組分部分進行一些蛋白質點印跡分析。選定轉化體的澱粉顆粒及其相應汁液組分中蛋白檢測結果總結於圖3。從圖中可看出，汁液中發現融合蛋白從l+類別起。在這種情況下，顆粒及其相應汁液組分中融合蛋白累積水平有一些相關(圖3)。為確定馬鈴薯塊莖中僅導入的澱粉蔗糖酶的表達水平和轉化體篩選，用從塊莖材料提取的總RNA進行Northem印跡分析(因為缺乏澱粉蔗糖酶抗體)。基於mRNA轉錄物水平(圖4.上方的圖)，使用28rRNA核糖體4笨針為內對照，確認三種不同分類(無、低和高)(圖4.下方的圖)。百分之16、12、16和56的轉化體淨皮分類為高(H)、中(M)、低(L)和無(N)表達體系。脊差弱發郝參敘微封澱為、激凝為測定馬鈴薯植物的澱粉顆粒中累積的融合蛋白的存在，通過SDS-PAGE及隨後的免疫印跡檢測，使用抗SBD分析每種融合蛋白的一種代表的性質不同的澱粉顆粒結合蛋白(圖5)。識別其中與預期86.1kDa的SBD-AS和86.5kDa分子量的AS-SBD分別很好地對應的約85kDa的蛋白。未發現對照植物的澱粉條帶(圖5)。這些結果清楚地顯示，澱粉生物合成過程中，澱粉蔗糖酶已被成功定向澱粉顆粒。澱痴^^^^在這炎澱為、教在攻f轉基因馬鈴薯澱粉的光學顯微鏡和掃描電鏡(SEM)成像顯示，澱粉顆粒形態學受到很明顯的影響。融合蛋白的表達導致不同顆粒形態學改變。C-和N-末端同源的SBD融合蛋白的改變顆粒的外觀是不同的(圖6,比較C和D)。令人驚訝的是，僅澱粉蔗糖酶表達即影響澱粉顆粒形態學。但是改變的澱粉顆粒的外觀與融合蛋白表達系統不同(圖6,將B與C和D比較)。所有三種不同系列轉化體的澱粉顆粒表面是不同的，與其他兩種相比，SA轉化體的額外多糖層更厚。就額外多糖層而言，AS和僅澱粉蔗糖酶表達體系的表面似乎是相同的，但是澱粉蔗糖酶表達體系有小的突出(圖6,比較F和H)。為定量不同種類融合蛋白(圖7)和不同澱粉蔗糖酶表達體系中改變的澱粉顆粒的數量，計數不同轉化體的兩百個顆粒。圖7強調了兩條主要信息。第一、蛋白水平和改變的澱粉顆粒百分比間似乎有相關性，第二、N末端SBD(SBD-AS)似乎對澱粉顆粒作用稍大些。在澱粉蔗糖酶轉化體中發現高(H)和中等(M)澱粉蔗糖酶表達體系的改變的顆粒分別為15%(±1.2)和6%(±2.1)。^"S萬Z)^US射衷i^炎jr在義小增>澱粉顆粒大小通常以大小分布表示，大小分布是特定澱粉類型特有的。雖然僅澱粉蔗糖酶的表達改變了澱粉形態學(圖6F)，但未使顆粒大小改變(表l)。相反地，AS和SA融合蛋白的表達使顆粒大小顯著增加了兩倍，從平均20.8pm增加到47.4(圖9)。在AS和SA系列中，83%(30個中的25個)和70%(23個中的16個)顯示顆粒大小比對照植物大(20.8pm)。就SBD位置而言，兩個系列中最好的轉化體顯示顆粒大小增加相同倍數(圖9)。為比較AS和SA系列的平均顆粒大小，進行單向ANOVA(方差分析)(表l)。就SBD位置而言，AS和SA轉化體系列的澱粉顆粒大小沒有明顯差異(F=1.09，P=0.343)。相關分析顯示，兩個系列的SBD水平(種類)和顆粒大小之間有正相關。但是此相關在AS轉化體中(pO.001)比SA轉化體(p-0.078)更強。^^"《義覆在^#差&孩參^/定#^"不^^參！#V4迄今為止已闡明融合蛋白形式的澱粉蔗糖酶對澱粉顆粒大小的影響。我們的試驗還指出顆粒大小的確與顆粒中累積的蛋白量有關。下一個問題是有更大的顆粒會給澱粉性質帶來什麼影響？澱粉黏度測定分析表明，具有更大顆粒的轉基因澱粉與對照澱粉和小顆粒澱粉的特性不同。如表1所示，具有更大顆粒澱粉的起始溫度(Tonset)稍高。但是，這不像在蛋白質水平中那樣反映相關性。隨其在恆定攪拌方式下加熱並冷卻到初始溫度(20°C)形成的澱粉黏度分布圖在轉化體中各不相同。澱粉峰值黏度(澱粉膠凝過程中達到的最高黏度，通常與所有顆粒膨脹至其最大水平的點相應)在轉基因植物中各不相同。在AS和SA系列中，當顆粒大小增加到約30pm時，峰值熟度降低，但隨後增加(圖IO)。冷卻過程中澱粉漿的黏度也受顆粒大小的影響。進一步黏度試驗的結果在表3中提供。使用3%的最佳澱粉濃度，這樣澱粉顆粒高溫下爆裂開前，可最大程度膨脹。每個值獨立地測定三次。使用的溫度為55至85。C，升幅每分鐘1。C。這些結果顯示，wtKardal馬鈴薯和根據本發明的方法得到的植物之間黏度大不不同。SBD-澱粉蔗糖酶和澱粉蔗糖酶-SBD使澱粉的峰值黏度明顯地下降以及使澱粉顆粒大'J、明顯地提高。一些/定為Vf/^發^"效i^:^還分析了澱粉性質如表觀直鏈澱粉含量(。/。AM)和起始溫度。未觀察到顯著變化。轉化體的澱粉產率與對照植物相同。異澱粉酶完全去分支後，鏈長分布概況圖與未轉化的植物相當(數據未顯示)。為得到不同蔗糖濃度存在下激活的顆粒結合澱粉蔗糖酶，用轉基因澱粉進行的收集後試驗未顯示任何直鏈澱粉樣聚合物合成，或未顯示HPAEC分布圖的任何改變，表明蔗糖分解和葡萄糖消耗(數據未顯示)。"-/定為、凝義^^/定為、>^在W^T^必^W確定還確定了生成的澱粉的可消化性。圖13顯示結果。由此圖明顯可見，澱粉蔗糖酶植物的可消化性增加。表l.顯示了不同澱粉性質的概述。tableseeoriginaldocumentpage28德=蛋白質印跡，d50=顆粒大小中值，AM-表觀直鏈澱粉含量，NcN未檢測到，*、"分別表示a-0.05和a-0.01時顯著，ns-不顯著。表2.組織特異性啟動子(種子和塊莖)tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30DSC=示差掃描量熱法PSD=顆粒大小分布WT=cvKardalPV=以帕秒(Pascalsecond)為單位的峰值黏度d50=以毫米為單位的直徑中值ND=未確定的參考文獻1.BaiimleinH,WobusU,PustdlJ,KafatosF(1986)Thelegumingenefamily:structureofaB-typegeneofViciafabaandapossiblelegumingenespecificregulatoryelement(豆J求蛋白基因家族蠶豆B型基因的結構和可能的豆球蛋白基因特異性調控元件).NucleicAcidsRes14:2707-2720.2.BaiimleinH,BoerjanW,NagyI,BassunerR,VanMontaguM,InzeD,WobusU(1991)AnovelseedproteingenefromViciafabaisdevelopmentallyregulatedintransgenictobaccoandArabidopsisplants(轉基因菸草和擬南芥植物中調節蠶豆新型種子蛋白基因的發育).MolGenGenet225:459-67.3.DeMontalkGP,Remaud-SimeonM,Willemot腿，PlanchotV，MonsanP(1999)SequenceanalysisofthegeneencodingamylosucrasefromNeisseriapolysacchareaandcharacterizationoftherecombinantenzyme(多糖奈瑟球菌的編碼澱粉蔗糖酶的基因的序列分析和重組體酶的表徵).JBacteriol181:375-81.4.GatehouseJA,BownD，EvansIM,GatehouseLN，JobesD,PrestonP，CroyRR(1987)Sequenceoftheseedlectingenefrompea(Pisumsat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變包含澱粉顆粒大小的增加。10.根據權利要求l-9中任一項的方法，其中所述改良或改變包含所述植物生成的澱粉顆粒大小分布向更大顆粒的移動。11.權利要求9或10中任一項的方法，其中所述改良或改變進一步包含澱粉顆粒形態學的改變。12.核酸，其包含澱粉蔗糖酶編碼序列、澱粉結合域(SBD)編碼序列和啟動子序列。13.根據權利要求12的核酸，其中所述啟動子是塊莖特異性啟動子。14.融合蛋白，其包含澱粉蔗糖酶和澱粉結合域(SBD)。15.根據權利要求14的融合蛋白，其進一步包含澱;除形成體轉運肽。16.根據權利要求14-15中任一項所述的融合蛋白，其中所述澱粉結合域包含環糊精葡萄糖基轉移酶的澱粉結合域。17.根據權利要求14-16中任一項的融合蛋白，其中所述澱粉結合域與圖11的SBD序列至少70%同源。18.細胞，其包含權利要求12或13中任一項的核酸，和/或包含根據權利要求14-17中任一項的融合蛋白。19.植物或其部分，其包含根據權利要求18的細胞，或根據權利要求l的方法生成。20.權利要求19的植物的部分，其中所述部分為澱粉儲存器官。21.根據權利要求20的植物或其部分，其中所述植物為馬鈴薯植物。22.根據權利要求19-21中任一項的植物或其部分，其中所述部分是塊莖。23.權利要求19-22中任一項的植物或其部分，其中所述植物為含直鏈澱粉的馬鈴薯植物。24.澱粉，可通過根據權利要求2-ll中任一項的方法獲得，和/或可從根據權利要求19-23中任一項的植物和/或其部分獲得。25.根據權利要求24的澱粉，其中與來自對照植物的澱粉顆粒相比，至少改變了一種澱粉顆粒的一種特性。26.權利要求25的澱粉，其中所述特性為澱粉顆粒大小。27.根據權利26的澱粉，其中所述澱粉顆粒大小是增加的。28.根據權利要求26或27的澱粉，其中改變了進一步的澱粉顆粒形態學。29.食品和/或工業品，其包含根據權利要求19-23中任一項的植物或其部分，和/或才艮據權利要求24-28中任一項的澱粉。全文摘要本發明提供改良產澱粉的植物的方法，以及生成具有至少一種改變特性的澱粉的方法。本發明尤其提供生成澱粉的方法，其包含將包含功能性連接於顆粒靶向序列，並功能性連接於所述植物的澱粉儲存器官中活性啟動子序列的澱粉蔗糖酶編碼序列的核酸導入所述植物的合適植物材料中，並從所述材料生成植物，進一步包含使所述植物生長，並從所述植物收集澱粉。本發明還提供具有改變特性的澱粉，和包含這種澱粉的植物及其部分和產品。此外，本發明提供融合蛋白，以及包含這種融合蛋白的細胞。文檔編號C12N15/82GK101595221SQ200780041799公開日2009年12月2日申請日期2007年8月28日優先權日2006年9月11日發明者F·納扎裡安菲勞扎巴迪,J·-P·文克肯,R·G·F·維瑟申請人:瓦赫寧恩大學