一種能提高植物光合效率的萊茵衣藻蛋白e6及其編碼基因與應用的製作方法

2023-09-19 18:24:40 1

一種能提高植物光合效率的萊茵衣藻蛋白e6及其編碼基因與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有提高植物光合效率的萊茵衣藻蛋白E6及其編碼基因與應用。該蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質：(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物光合效率的蛋白質。結果表明：E6蛋白在光合作用中有重要功能，為高光效工程藻株的改造提供了一個很好的靶標基因，也為作物改良提供良好的備選目標基因。
【專利說明】一種能提高植物光合效率的萊茵衣藻蛋白E6及其編碼基 因與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種能提高植物光合效率的萊茵衣藻蛋白E6 及其編碼基因與應用。

【背景技術】
[0002] 光合作用是生物界賴以生存的基礎。它直接或間接地為地球上的生物提供能量， 與人類面臨的糧食、能源問題等密切相關。隨著世界人口的增加，糧食、能源和資源問題日 益嚴峻，提高包括藻類等在內的光合生物的光能利用效率，已經成為一項日益緊迫的任務。
[0003] 萊茵衣藻是單細胞真核綠藻，是研究光合作用、光合產氫和細胞逆境適應機制的 模式物種。通過科學研究挖掘重要的可以提高光能利用效率的新基因，不僅可為高放氫工 程藻株設計提供可利用的基因元件，也對發現衣藻高效率低成本制氫的新思路和新方法有 重要價值。


【發明內容】

[0004] 本發明的一個目的是提供一種具有提高植物光合效率的萊茵衣藻蛋白E6及其編 碼基因。
[0005] 本發明所提供的蛋白質，是如下a)或b)的蛋白質：
[0006] a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；
[0007] b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物光合效率相關的蛋白質。
[0008] 本發明所提供的所述蛋白質相關的生物材料，為下述BI)至B5)中的任一種：
[0009] BI)編碼權利要求1所述蛋白質的核酸分子；
[0010] B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒；
[0011] B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0012] B4)含有BI)所述核酸分子的重組質粒、或含有B2)所述表達盒的重組質粒；
[0013] B5)含有BI)所述核酸分子的重組藻株、或含有B2)所述表達盒的重組藻株、或含 有B3)所述重組載體的重組藻株。
[0014] 上述相關生物材料中，BI)所述的核酸分子如序列表中序列1的第1-579位核苷 酸分子所不。
[0015] 上述蛋白質或相關生物材料在提高植物光合效率中的應用也是本發明的保護範 圍。
[0016] 上述應用中，所述植物為藻類，具體為萊茵綠藻。
[0017] 本發明的另一個目的是一種構建光合能力提高的轉基因植物的方法。
[0018] 本發明所提供的構建光合能力提高的轉基因植物的方法包括如下步驟：將上述所 述蛋白質的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物；轉基因植物與出發植物相比，光合 能力提1?。
[0019] 上述方法中，所述蛋白質的編碼基因為序列表中序列1的第1-579位核苷酸的DNA 分子。
[0020] 上述方法中，所述光合能力提1?為光合效率提1?。
[0021] 上述方法中，所述植物為藻類，具體為萊茵衣藻。
[0022] 實驗表明：E6基因與E6的光合表型是相關的，E6基因在光合作用中有重要功能， 為高光效工程藻株的改造提供了一個很好的靶標基因，也為作物改良提供良好的備選目標 基因。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為e6突變體互補藻株篩選。

【具體實施方式】
[0024] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0025] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0026] 植物材料：萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)藻種 CC400 (mt+)，購自美國 杜克大學萊茵衣藻中心（Chlamy center, http: //www. chlamy. org/)〇
[0027] 菌株和質粒：pSI103質粒購自美國杜克大學萊茵衣藻中心（Chlamy center http://www. chlamy. org/) ;pJR38質粒由馬普協會分子生理研究所Ralph Bock教授提 供，在文獻 "Generation of Chlamydomonas strains that efficiently express nuclear transgenes, Neupert et al·，The Plant Journal, 2009, 57, 1140-1150" 中公開過，公眾可 從中國科學院植物研究所獲得。PSI103質粒和pJR38質粒中均含有巴龍黴素抗性基因。
[0028] 培養基的配製：
[0029] 1)正常 TAP 培養液：NH4C1 0· 4g/L ;MgS04 · 7H20 0· lg/L ;CaCl2 · 2H20 0· 05g/L ; K2HPO4O. 108g/L ;KH2P040 . 0 56g/L Jrisbase 2. 423g/L ;亨特微量元素（Hunter，s trace elements) lml/L ;冰乙酸 lml/L ;其餘為水。
[0030] 2)固體TAP培養基：在正常TAP培養液中加 I. 5%的瓊脂粉。
[0031] 3)亨特微量兀素（Hunter，s trace elements) =H3BO4IL 4g/L ;ZnS04 · 7H20 22. Og/L ；MnCl2 · 4H20 5. 06g/L ；CoC12 · 6H20 1. 61g/L ；CuSO4 · 5H20 I. 57g/L ； (NH4)6Mo7O24 · 4H20L lOg/L ;FeS04 · 7H20 4. 99g/L ;其餘為水。
[0032] 4)用 TAP 固體培養基培養萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii) CC400 (mt+)、 e6突變體及互補藻株：配製TAP液體培養液，121 °C高壓滅菌20分鐘，待培養液溫度降到室 溫後，用接種針從固體培養基上挑取萊茵衣藻單克隆到液體TAP培養液中，置於恆溫光照 培養箱中的搖床上連續光照培養（25°C，60rpm，100 μ Es4HT2)，懸浮培養細胞，固體培養時， 將單克隆轉到TAP固體培養基上劃線培養。
[0033] 實施例I、E6基因的獲得
[0034] 1、萊茵衣藻總RNA的提取：
[0035] 取指數生長期的萊茵衣藻CC400(mt+)細胞（4-6)xl06細胞/毫升，5000rpm離心 5min後，加入ImL裂解液RZ，振蕩混勻。室溫放置5min後，4°C，12000rpm離心5min，取上清， 轉入新的無 RNase的離心管中。加200 μ L氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。 4?，12000rpm離心lOmin。把上層水相轉移到新的無 RNase的離心管中，緩慢加入0. 5倍 體積的無水乙醇，混勻。將得到的溶液和沉澱全部轉入吸附柱中。4°C，12000rpm離心30s， 棄離心管中廢液，加500 μ L去蛋白液，4°C，12000rpm離心30s，棄廢液。加700 μ L漂洗液， 室溫靜置2min，4°C，12000rpm離心30s，棄廢液。再加500 μ L漂洗液，室溫靜置2min，4°C， 12000rpm離心30s，棄廢液。4°C，12000rpm離心2min，去除殘餘液體，開蓋瞭幹。將吸附 柱轉入一個新的無 RNase的離心管中，加50yL RNase-free dd-H20,室溫放置2min，4°C, 12000rpm離心2min。棄上清，獲得萊茵衣藻總RNA。
[0036] 2、cDNA 第一鏈合成：
[0037] 以上述獲得的萊茵衣藻總RNA為模板，使用全式金有限公司cDNA第一鏈合成試劑 盒合成 cDNA 第一鏈。反應體系：2yL IOx TSII mix，lul ΙΟμπιοΙ 01igodT20，l-5yg 總 RNA，補滅菌雙蒸水至20yL。50°C溫浴30min，70°C加熱15min後終止反應。獲得萊茵衣藻 的cDNA第一鏈。
[0038] 3、E6基因的擴增：
[0039] 以上述獲得的萊茵衣藻的cDNA第一鏈為模板，採用表1中的引物序列PCR擴增E6 基因。反應程序：98°C預變性2min，98°C變性10s，55°C退火15s，72°C延伸30s，35個循環， 72°C延伸 5min。反應體系：2XHS GC buffer I 12.5yL，dNTP mixture (各 2.5mM)2yL， 模板 cDNA I μ L，PRMERSTAR(5U/y L)0. 5μ L，F/R各 I μ L，補 ddH20 至 25μ L。以上引物均 在生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見下表1。
[0040] 表I. PCR擴增所用的引物序列
[0041]

【權利要求】
1. E6蛋白質，是如下a)或b)的蛋白質： a) 由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質； b) 將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與植物光合效率相關的蛋白質。
2. 與權利要求1所述蛋白質相關的生物材料，為下述BI)至B5)中的任一種： BI)編碼權利要求1所述蛋白質的核酸分子； B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達盒的重組載體； B4)含有BI)所述核酸分子的重組質粒、或含有B2)所述表達盒的重組質粒； B5)含有BI)所述核酸分子的重組藻株、或含有B2)所述表達盒的重組藻株、或含有 B3)所述重組載體的重組藻株。
3. 根據權利要求2所述的相關生物材料，其特徵在於：B1)所述的核酸分子如序列表中 序列1的第1-579位核苷酸分子所示。
4. 權利要求1所述蛋白質、或權利要求2或3所述相關生物材料在提高植物光合效率 中的應用。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於：所述植物為藻類，具體為萊茵綠藻。
6. -種構建光合能力提高的轉基因植物的方法，包括如下步驟：將權利要求1所述蛋 白質的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物；轉基因植物與出發植物相比，光合能力 提_。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於：所述蛋白質的編碼基因為序列表中序列1 的第1-579位核苷酸的DNA分子。
8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於：所述光合能力提高為光合效率提高。
9. 根據權利要求6-8任一所述的方法，其特徵在於：所述植物為藻類，具體為萊茵衣 藻。
【文檔編號】C07K14/405GK104311649SQ201410490550
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月23日 優先權日:2014年9月23日
【發明者】黃芳, 趙磊, 程冬梅 申請人:中國科學院植物研究所