人胚胎幹細胞及其培養方法

2023-09-19 18:24:55

專利名稱：人胚胎幹細胞及其培養方法
技術領域：
本發明涉及生物學領域。更具體地說，本發明涉及一種體外培養獲得人胚胎幹細胞系的方法以及用該方法獲得的人胚胎幹細胞系。
背景技術：
人胚胎幹細胞是一種來源於人類早期胚胎內細胞團的一種具有無限自我更新和多向分化潛能的細胞。利用人胚胎幹細胞可以使人們了解胚胎早期發育規律、細胞分化機制等基本生物學問題。更使人們感興趣的是，人胚胎幹細胞能分化為成人體內任何一種細胞，因此將來可能在實驗室內製造臨床上需要的特殊細胞，這對某些難以根治的疾病如糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、早老性痴呆等都可能產生革命性的影響。若把人胚胎幹細胞和組織工程結合起來，將來可以在實驗室內製造病人所需要的器官，其意義無疑是深遠的。同時，人胚胎幹細胞還能作為藥物篩選、毒物篩查的實驗材料，比動物實驗更接近人體的真實情況。理論上，人胚胎幹細胞系的數量越多越好，這樣能滿足不同病人的需要。而不同的人胚胎建立的人幹細胞系具有不同的MHC基因，因此這些細胞系之間的免疫特性是不同的。這也是國際上要建立幹細胞庫的首要原因。另外，目前發現不同的幹細胞系之間在分化潛能上也有一定的差異，也就是說，雖然幹細胞系之間的基本特點是一致的，但它們之間仍然是有差別的。
因此，本領域仍然迫切需要有人胚胎幹細胞系的建系方案和新的人胚胎幹細胞系。

發明內容
為實現上述目的，本發明一方面提供了一種在體外獲得人胚胎幹細胞系的方法，所述方法包括(1)消化除去囊胚的透明帶，然後將整個囊胚放到由小鼠成纖維細胞製成的飼養層細胞上進行培養，原代培養液的配方是DMEM，20％胎牛血清，0.06-0.2mmol/Lβ-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需胺基酸，1-2mmol/L穀氨醯胺，30-60U/ml青黴素，30-60μg/ml鏈黴素；
(2)在步驟1的細胞培養進行8-10天後，將細胞團塊切成小塊，再接種到新鮮的小鼠成纖維細胞飼養層細胞上進行培養，培養液配方為KO-DMEM，20％血清替代物0.06-0.2mmol/L β-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需胺基酸，1-2mmol/L穀氨醯胺，30-60U/ml青黴素，30-60μg/ml鏈黴素，3-5ng/ml bFGF；(3)在步驟2的細胞生長到第4～8代時，除去培養液，在飽和溼度、37℃、5％CO2下用0.05％胰酶-EDTA進行消化傳代培養，分離得到人胚胎幹細胞系。
在一個較佳的實施方案中，在步驟(3)中人胚胎幹細胞以1∶5～1∶10的比例進行傳代。
在另一較佳的實施方案中，步驟(1)中所用的原代培養液的配方為DMEM，20％胎牛血清，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需胺基酸，1mmol/L穀氨醯胺，50U/ml青黴素和50μg/ml鏈黴素。
在另一較佳的實施方案中，步驟(2)中所用的培養液配方為KO-DMEM，20％血清替代物，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需胺基酸，1mmol/L穀氨醯胺，50U/ml青黴素，50μg/ml鏈黴素和4ng/ml bFGF。
本發明另一方面還提供了一種用上述述方法獲得的人胚胎幹細胞系。較佳的是，所述人胚胎幹細胞系是人胚胎幹細胞系SH-HES1，其保藏號為CCTCC-C200503。
附圖簡述

圖1顯示了在4倍倒置相差顯微鏡觀察的本發明的人胚胎幹細胞系SH-HES1的第66代。
具體實施例方式
下面將結合實施例來具體描述本發明。
1、人胚胎幹細胞原代培養取得生長第5天或第6天的人囊胚(從臨床IVF即體外受精後的剩餘囊胚中獲得)後，用5mg/ml Protease(鏈黴蛋白酶，Sigma)消化透明帶。將整個囊胚放到由小鼠成纖維細胞製備成的飼養層細胞上進行原代培養。原代培養液的配方是DMEM，20％(W/V)胎牛血清(Hyclone)，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需胺基酸，1mmol/L穀氨醯胺，50U/ml青黴素，50μg/ml鏈黴素。原代細胞生長9天左右後，將細胞團塊用巴氏吸管拉成的尖頭切割成若干小塊，再接種到新鮮的飼養層細胞上。此時培養液配方換成KO-DMEM，20％(W/V)血清替代物(Gibco)，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需胺基酸，1mmol/L穀氨醯胺，50U/ml青黴素，50μg/ml鏈黴素，4ng/ml bFGF。在人胚胎幹細胞培養早期階段，都必須用機械切割的方法將細胞團分成小塊後再傳代，直到在一個4孔皿中有足夠的未分化細胞時才能改用消化傳代的方法。
2、人胚胎幹細胞的消化傳代培養(1)當人胚胎幹細胞生長到第4～6天時，吸去培養液，用PBS(無鈣、鎂)洗一遍，吸去PBS。
(2)加預溫過的0.05％(W/V)胰酶-EDTA室溫下消化1～2分鐘，當飼養層細胞出現較大空隙時表示消化較充分，用1ml吸管輕輕吹打細胞幾次，加6ml預熱的飼養層細胞培養液終止消化。
(3)將細胞轉移到15ml離心管中，離心1000rpm，5min。
(4)棄上清，將細胞沉澱用人胚胎幹細胞培養液重懸後按適當比例分配到新的飼養層細胞上，以X和Y軸方向晃動培養皿使細胞均勻分布，最後將細胞放到培養箱中進行培養。人胚胎幹細胞一般的傳代比例是1∶5～1∶10。
人胚胎幹細胞培養條件是飽和溼度、37℃、5％CO2。
3、凍存人胚胎幹細胞(1)將配好的凍存液(90％W/V胎牛血清，10％V/VDMSO)置於冰上備用。
(2)棄去培養液，用PBS(無鈣、酶)洗一遍，吸去PBS。
(3)加預溫過的0.05％W/V胰酶-EDTA室溫下消化1～2分鐘，當飼養層細胞出現較大空隙時表示消化較充分，用1ml吸管輕輕吹打細胞幾次，加6ml預熱的飼養層細胞培養液終止消化。
(4)將細胞轉移到15ml離心管中，離心1000rpm，5min。
(5)棄上清，將細胞沉澱用凍存液重懸，吹打兩下後立即將細胞分裝到凍存管中。將凍存管轉移到細胞凍存盒中-70℃保存過夜，第二天轉移到液氮內長期保存。一般每個10cm2細胞培養皿可凍8支細胞。
該人胚胎幹細胞系SH-HES1已經於2005年3月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC-C200503。
4、復甦人胚胎幹細胞(1)將人胚胎幹細胞凍存管從液氮中取出，37℃水浴直至冰塊幾乎全部溶解。
(2)用75％酒精擦拭凍存管，用1ml吸管將細胞吸出後緩慢地加到預熱的人胚胎幹細胞培養液中。
(3)細胞離心1000rpm，5min。
(4)用人胚胎幹細胞培養液重懸細胞沉澱後接種到六孔皿中，以X和Y軸方向晃動培養皿使細胞均勻分布，將細胞放到培養箱中培養。
5、鑑定人胚胎幹細胞系(1)人胚胎幹細胞表面標誌物鑑定和基因表達未分化的人胚胎幹細胞表達細胞表面抗原SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、鹼性磷酸酶(AKP)等，不表達細胞表面抗原SSEA-1。這些抗原可用免疫螢光的方法進行檢測。用RT-PCR的方法還可檢測到未分化的人胚胎幹細胞表達Oct-3、Sox2、FGF4、Rex1等基因。人胚胎幹細胞系SH-HES1表達細胞表面抗原SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、鹼性磷酸酶(AKP)，不表達細胞表面抗原SSEA-1。代表未分化的基因FGF4、SOX2、LeftyA、OCT-4、TDGF1、Thy-1、Rex-1、Nanog在人胚胎幹細胞SH-HES1中表達。細胞表面抗原用間接免疫螢光技術檢測。用RT-PCR的方法鑑定未分化基因的表達。
(2)人胚胎幹細胞體內分化能力將人胚胎幹細胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID-BEIGE)體內後可產生畸胎瘤，若畸胎瘤含有三個胚層來源的細胞，可基本證明人胚胎幹細胞具有體內分化的多能性。由於畸胎瘤需要較長時間才能形成，因此應該儘早進行這項檢測。用石蠟包埋、HE染色的方法分析畸胎瘤的組織構成。
結果表明，本發明獲得的人胚胎幹細胞系SH-HES1形成的畸胎瘤含有表皮(外胚層)、軟骨(中胚層)、脂肪組織(中胚層)、漿液性腺體(內胚層)、單層柱狀上皮(內胚層)等組織。
(3)人胚胎幹細胞體外分化能力在體外適當的條件下人胚胎幹細胞能自發或被誘導分化，這種分化可用特異的抗體檢測到。若能檢測到人胚胎幹細胞能分化成三個胚層來源的細胞，基本可證明其在體外條件下具有分化的多能性。用間接免疫螢光技術檢測細胞體外分化形成的特殊細胞。
本發明的人胚胎幹細胞系SH-HES1能形成類胚體(EB)，類胚體貼壁培養後細胞能自發分化，用免疫螢光的方法檢測這些細胞表達肌動蛋白(中胚層)，細胞角蛋白7(內胚層)，神經絲蛋白70(外胚層)和神經早期蛋白(nestin，外胚層)抗原。
本發明的SH-HES1細胞系除了在體內和體外都具有向三個胚層分化的能力，還能形成具有自主搏動能力的心肌樣細胞，因此其分化的潛能應該是廣泛的。
(4)人胚胎幹細胞核型正常的人胚胎幹細胞應該具有兩倍體的正常核型，一般用G帶顯色的方法鑑定。人胚胎幹細胞系SH-HES1在15代和23代時檢測具有正常兩倍體核型。
(5)端粒酶鑑定端粒酶是一種逆轉錄酶，能以自身攜帶的RNA為模板延長染色體端粒的長度，因此在維持染色體長度及決定細胞壽命方面有重要作用。大多數體細胞不表達端粒酶，而且端粒的長度隨著歲月的增加而縮短。腫瘤細胞和生長活躍的胚胎細胞高表達端粒酶。經鑑定，本發明的人胚胎幹細胞系SH-HES1高表達端粒酶。
權利要求
1.一種在體外獲得人胚胎幹細胞系的方法，其特徵在於，所述方法包括(1)消化除去囊胚的透明帶，然後將整個囊胚放到由小鼠成纖維細胞製成的飼養層細胞上進行培養，原代培養液的配方是DMEM，20％胎牛血清，0.06-0.2mmol/Lβ-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需胺基酸，1-2mmol/L穀氨醯胺，30-60U/ml青黴素，30-60μg/ml鏈黴素；(2)在步驟1的細胞培養進行8-10天後，將細胞團塊切成小塊，再接種到新鮮的小鼠成纖維細胞飼養層細胞上進行培養，培養液配方為KO-DMEM，20％血清替代物0.06-0.2mmol/L β-巰基乙醇，0.06-0.2mmol/L非必需胺基酸，1-2mmol/L穀氨醯胺，30-60U/ml青黴素，30-60μg/ml鏈黴素，3-5ng/ml bFGF；(3)在步驟2的細胞生長到第4～8代時，除去培養液，在飽和溼度、37℃、5％ CO2下用0.05％胰酶-EDTA進行消化傳代培養，分離得到人胚胎幹細胞系。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中在步驟(3)中人胚胎幹細胞以1∶5～1∶10的比例進行傳代。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中所用的原代培養液的配方為DMEM，20％胎牛血清，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需胺基酸，1mmoL/L穀氨醯胺，50U/ml青黴素和50μg/ml鏈黴素。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所用的培養液配方為KO-DMEM，20％血清替代物，0.1mmol/L β-巰基乙醇，0.1mmol/L非必需胺基酸，1mmol/L穀氨醯胺，50U/ml青黴素，50μg/ml鏈黴素和4ng/ml bFGF。
5.一種用權利要求1所述方法獲得的人胚胎幹細胞系。
6.根據權利要求5所述的人胚胎幹細胞系，其特徵在於，所述人胚胎幹細胞系是人胚胎幹細胞系SH-HES1，其保藏號為CCTCC-C200503。
全文摘要
本發明提供了一種在體外獲得人胚胎幹細胞系的方法。本發明還提供了用該方法獲得的人胚胎幹細胞系，尤其是人胚胎幹細胞系SH－HES1，其保藏號為CCTCC－C200503。
文檔編號C12N5/0735GK1865435SQ200510026010
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月20日 優先權日2005年5月20日
發明者金穎, 孫博文 申請人:中國科學院上海生命科學研究院