一種鯉魚精巢生物反應器的製備方法及應用的製作方法
2023-09-19 18:28:40
專利名稱：一種鯉魚精巢生物反應器的製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種魚類精巢生物反應器的製備方法，還涉及一種鯉魚精巢生物反應器在製備藥用蛋白質、工業酶、疫苗和抗體中的應用。
背景技術：
轉基因生物反應器是指將外源基因轉入細胞或動植物、微生物，利用細胞增殖或生物體代謝製備外源基因的表達產物，主要包括轉基因微生物生物反應器、轉基因動物生物反應器和轉基因植物生物反應器三大類。轉基因微生物生物反應器生產的產物一般不具備生物活性，須經過後續的糖基化、羥基化等一系列修飾加工，工藝繁瑣，耗時費力。轉基因動植物生物反應器的產物具有 天然的生物活性，產品無需後加工過程，受到研究者們的青睞和社會各界的關注。就轉基因動物生物反應器而言，最令人矚目的是轉基因動物乳腺生物反應器。利用乳腺反應器生產的重組人抗凝血酶III是第一個獲準上市的動物生物反應器蛋白藥物(GTC Bio-therapeutics. Inc. http://www. transgenics. com/pressre_leases/pr060206·html);轉基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應器生產的重組蛋白已進入臨床III期試驗；數百種重組蛋白處於研發階段。由於轉基因動物乳腺生物反應器的主體是哺乳動物，有限的卵細胞數量和胚胎的體內發育使得轉基因操作極其困難，加上擴群速度緩慢，產品難以實現快速規模化生產。魚類轉基因技術成熟，受精和胚胎發育過程在體外進行，易於轉基因操作和篩選目的基因高表達的個體，以建立多途高效生物反應器平臺；紅鯉懷卵量大，性成熟的雌魚每尾可產卵5萬顆以上，具有擴群速度快的特點；紅鯉生長快，雄性個體在南方地區一年即可性成熟，精液平均產量10_20ml/尾/次，總蛋白含量為3. 04mg/ml ;在人工控制環境下，紅鯉可多季節，甚至常年生產精液，按每畝水面養殖1000尾雄魚，每半個月生產一批次精液，平均每尾產精液IOml計算，年產精液可高達240，OOOml0魚類精巢生物反應器具有研製快捷、規模化迅速的特點，適合生產中低需求量的蛋白質產品，應對瞬息萬變的市場需求。魚類精巢生物反應器將成為生物反應器家族中一個重要的成員。禽流感(Avian influenza, Al),又稱真性雞痕,是由A型流感病毒引起的禽類的一種急性、高度致死性傳染病。禽流感根據病原體表面血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)分成若干亞型，目前已經發現15種血凝素亞型(Hl H15)和有9種神經氨酸酶亞型(NI N9), H 5N1屬於高致病性的一種亞型。高致病性禽流感病毒不僅可感染家禽，而且能突破種屬屏障，感染人類，禽流感被國際獸醫局定為A類傳染病，我國將其列為一類動物疫病，禽流感的預防和控制是關乎禽類養殖業發展和人類健康的重大課題。目前，用於預防和控制病毒性流行病的疫苗主要包括全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗。全病毒滅活疫苗的生產存在安全隱患，可能對環境和生產人員健康構成威脅；減毒活疫苗研發困難，且存在毒力恢復、形成新流感毒株的潛在的風險。傳統亞單位疫苗從病毒粒子中分離獲得，雖安全性得到保障，但生化製備工藝複雜、成本高昂，難以推廣應用。隨著基因克隆、DNA重組和轉基因技術的發展，利用真核表達系統生產廉價的目標蛋白成為可能，藉此生產的亞單位疫苗同時具備良好的免疫原性和高度的安全性，是目前該領域研究的熱點。本發明利用紅鯉精巢作為生物反應器，製備禽流感病毒H5N1表面抗原一血凝素蛋白，建立一個H5N1亞單位疫苗的生產平臺
發明內容
本發明的目的在於提供了一種鯉魚精巢生物反應器的製備方法，方法易行，操作簡便。鯉魚精巢生物反應器是一種以轉基紅鯉為宿主動物、紅鯉精巢為產物特異表達組織的生物反應器，該生物反應器具有研製快捷、規模化迅速的特點，適合生產中低需求量的蛋白質產品，可應對瞬息萬變的市場需求。本發明的另一個目的是在於提供了一種鯉魚精巢生物反應器在製備藥用蛋白質、工業酶、疫苗和抗體中的應用，通過將兩個魚類精巢特異高效表達啟動子分別與目的蛋白基因進行重組，通過顯微注射方法，將重組基因導入紅鯉受精卵，使其在基因組中穩定整合，從而在精液中獲得目的蛋白，可實現對目的蛋白的規模化生產。為實現上述目的，本發明採用以下技術措施一種鯉魚精巢生物反應器，通過以下步驟製備得到I)、篩選精液中高表達基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進行質譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153和BC076027 ;與斑馬魚基因組資料庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示；2)、重組載體的構建通過重疊PCR方法，構建分別由Q2和Q3驅動的目的蛋白基因基因表達載體；3)、轉基因魚的製備採用顯微注射法(Zhu，et al. 1985)，將兩個重組基因片段分別導入紅鯉受精卵中，常規方法孵化、養殖(可參考http: //baike. baidu. com/view/3868648, htm 中的內容)；4)、陽性轉基因魚的篩選採集性成熟轉基因紅鯉精液，提取基因組DNA，採用常規PCR方法，檢測篩選轉植基因陽性個體；5)、高表達陽性轉基因魚的篩選採用ELISA方法，檢測轉基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達個體作為父本，繁殖擴群，獲得反應器群體。一種鯉魚精巢生物反應器在製備禽流感病毒血凝素H5N1-HA (藥用蛋白質或抗體或工業酶)中的應用，其步驟是I)、篩選精液中高表達基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進行質譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153和BC076027 ;與斑馬魚基因組資料庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示；2)、重組載體的構建採用重疊PCR方法，構建分別由Q2和Q3驅動的H5N1-HA基因的重組表達載體，分別命名為PQ2-HA (圖2)和pQ3-HA (圖3)。其中，Q2、Q3啟動子DNA片段根據步驟I)中克隆獲得的序列，從斑馬魚基因組中PCR擴增獲得，H5N1-HA基因DNA片段根據GenBank中的序列資料(序列號EF624256)生化合成獲得(由上海生工生物工程公司合成);3)、轉基因魚的製備採用顯微注射法(Zhu，et al. 1985)，將兩個重組基因片段分別導入紅鯉受精卵中，常規方法孵化、養殖；4)、陽性轉基因魚的篩選採集性成熟轉基因紅鯉精液，提取基因組DNA，採用常規PCR方法，檢測篩選轉植基因陽性個體；5)、高表達陽性轉基因魚的篩選及蛋白檢測採用ELISA方法，檢測轉基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達個體作為父本，繁殖擴群，獲得反應器群體，H5N1-HA高表達於紅鯉精液中。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果 I、研製簡便魚類的受精和胚胎發育過程在體外完成，易於進行轉基因操作和大規模篩選，進而獲得目的基因高效表達的轉基因個體；2、擴群迅速魚類懷卵量大，性成熟紅鯉懷卵量高達50，000顆/尾，能迅速形成大規模轉基因魚群體；3、持續高效紅鯉生長快，雄性個體在南方地區一年即可性成熟，精液平均產量10-20ml/尾/次，總蛋白含量為3. 04mg/ml ;在人工控制條件下，紅鯉可常年產生精液。魚類精巢生物反應器可持續高效生產目的基因蛋白。
圖I為一種斑馬魚精液中特異表達的六個基因RT-PCR產物電泳圖。「M」 為分子量 Marker I」、「2」、「3」、「4」、「5」 和 「6」 泳道分別是 ΝΜ_001002099,NM_212788、BC122153、NM_001003646、BC076027 和 NM_001080035 基因的 RT-PCR擴增產物。圖2為一種表達載體pQ2-HA示意圖。長度8682bp ;抗性氨節。圖3為一種表達載體pQ3-HA示意圖。長度8759bp ;抗性氨苄。圖4為一種轉H5N1-HA基因紅鯉陽性魚PCR檢測電泳圖。「M」為分子量DL2000Marker ;箭頭所示為PCR擴增條帶。圖5為一種使用Curve Expertl. 3繪製出的ELISA標準曲線。
具體實施例方式實施例I :一種鯉魚精巢生物反應器的製備方法，通過以下步驟製備得到I)、篩選精液中高表達基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進行質譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153(SEQ ID NO. I)和BC076027(SEQ ID NO. 3);與斑馬魚基因組資料庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示；2)、重組載體的構建通過重疊PCR方法，構建分別由Q2和Q3驅動的目的蛋白基因基因表達載體；3)、轉基因魚的製備採用顯微注射法(Zhu，et al. 1985)，將兩個重組基因片段分別導入紅鯉受精卵中，常規方法孵化、養殖；4)、陽性轉基因魚的篩選採集性成熟轉基因紅鯉精液，提取基因組DNA，採用常規PCR方法，檢測篩選轉植基因陽性個體；5)、高表達陽性轉基因魚的篩選採用ELISA方法，檢測轉基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達個體作為父本，繁殖擴群，獲得反應器群體。
實施例2 —種魚類精巢生物反應器在製備H5N1-HA中的應用，其步驟是A.精巢特異聞效表達基因啟動子的篩選，其步驟是首先對斑馬魚的精液蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進行質譜檢測，生物信息學分析質譜檢測結果，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達的基因(表I);然後提取斑馬魚精巢總RNA，反轉錄獲得cDNA。RT-PCR驗證(RT-PCR引物見表2)以上六個基因在精巢中的表達(圖I);最後挑選表達量最高的二個基因，序列號分別為BC122153，其核苷酸序列為SEQID NO. I所示，和BC076027，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示，與斑馬魚基因組資料庫比較，獲得這二個基因的啟動子序列，分別命名為Q2 (其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示)和Q3 (其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示)。表I斑馬魚精液中特異表達的六個基因的基本信息
權利要求
1.一種鯉魚精巢生物反應器，由以下步驟製備得到 1)、篩選斑馬魚精液中高表達基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進行質譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153和BC076027 ;與斑馬魚基因組資料庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2和Q3 ； 2)、重組基因表達載體的構建通過重疊PCR方法，構建分別由Q2和Q3驅動的目的蛋白基因表達載體； 3)、轉基因魚的製備採用顯微注射法，將兩個重組基因片段分別導入紅鯉受精卵中，常規方法孵化、養殖； 4)、陽性轉基因魚的篩選採集性成熟轉基因紅鯉精液，提取基因組DNA，採用常規PCR方法，檢測篩選轉植基因陽性個體； 5)、高表達陽性轉基因魚的篩選採用ELISA方法，檢測轉基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達個體作為父本，繁殖擴群，獲得反應器群體。
2.根據權利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應器，其特徵在於所述的目的蛋白為禽流感病毒血凝素。
3.權利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應器，其特徵在於所述的Q2啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
4.權利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應器，其特徵在於所述的Q3啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示。
5.權利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應器在製備藥用蛋白質中的應用。
6.權利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應器在製備藥用工業酶中的應用。
7.權利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應器在製備藥用疫苗中的應用。
8.權利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應器在製備藥用抗體中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種鯉魚精巢生物反應器的製備方法及應用，一種鯉魚精巢生物反應器，其製備步驟為A.篩選在精液中高表達基因的啟動子;B.構建在魚類精巢中特異表達的目的基因表達載體；C.將重組基因片段導入紅鯉受精卵，使其在基因組中穩定整合；D.目的基因在轉基因紅鯉精巢中高效表達，獲得一種高效表達目的基因的生物反應器。利用魚類精巢基因特異表達的屬性，可構建安全高效、可持續利用的生物反應器；同時魚類具有擴群速度快和養殖成本低的特點，可實現生物反應器的規模化、低成本運行。
文檔編號A61K39/00GK102796763SQ201210282430
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者阮慧雲, 李良明 申請人:武漢達邦生物科技有限公司