Mage-4抗腫瘤ctl表位肽及其應用的製作方法

2023-09-19 18:06:25 1

專利名稱：Mage-4抗腫瘤ctl表位肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物化學領域中的多肽技術領域，具體涉及一種MAGE-4來源的抗腫 瘤CTL表位肽及其在製備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。
背景技術：
MAGE-4 屬於腫瘤-睪丸抗原(Cancer-Testis Antigen，CTA)，是 MAGE 基因家族的 成員之一。據報導，MAGE-4在多種人類惡性腫瘤中表達，如卵巢癌、頭頸部腫瘤、食管癌、結 腸癌、肺癌、膀胱癌等，在食管鱗癌，肺癌，頭頸部腫瘤，膀胱癌中的表達程度尤其高，分別為 74 %、59 %、53 %和45 %。Zambon等研究發現67 %食管鱗癌和37. 5 %的食管腺癌中至少表 達一種MAGE基因，其中MAGE-4更多見於鱗癌組織中，由此認為MAGE-4可以作為食管鱗狀 細胞癌的一個特異性指標。在腫瘤免疫治療中，MAGE-4是一個非常好的腫瘤診斷和治療的 靶點。隨著現代免疫學的發展，細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在 腫瘤中發揮的重要作用越來越受到重視。如何有效激發CTL介導的特異性細胞免疫應答， 發揮抗腫瘤效能，已經成為當今腫瘤治療性多肽疫苗研製領域的一個重要課題。既往研究 發現，引起CTL免疫應答反應的，並非完整的腫瘤抗原分子，而是抗原來源的特異性CTL表 位(Epitope)。抗原遞呈細胞攝取腫瘤抗原後，通過蛋白水解作用將其加工成為8 10個氨 基酸長度的多肽片段，即CTL表位，進而與內質網腔中的主要組織相容性複合體I(MHC-I) 類分子結合形成多肽-MHC複合物(p印tide-MHC complex，pMHC)，並最終將pMHC遞呈到細 胞表面供CD8+T細胞表面的T細胞受體(T cell receptor, TCR)識別，從而活化CTL細胞， 引發CTL免疫應答。然而，免疫原性弱和免疫耐受的存在是CTL表位作為腫瘤治療性多肽疫苗應用的 兩大障礙。因此，如何提高CTL表位的免疫原性以及打破機體對CTL表位的免疫耐受成為腫 瘤治療性多肽疫苗發展的關鍵。在眾多腫瘤治療性多肽疫苗的增強策略中，對CTL表位進 行分子改造被認為是最有前景的方法之一。對CTL表位的改造，可以通過改造表位MHC結 合位點，來改善表位與MHC的親和力和pMHC的穩定性，從而達到增強免疫原性的目的；也可 以通過改造表位TCR結合位點，來改善pMHC與TCR結合的穩定性，進而提高CTL活性並克 服CTL耐受。近期研究表明，基於表位MHC結合位點改造的多肽疫苗雖然可以在一定程度 上提高疫苗的免疫原性，但在腫瘤免疫治療中達不到理想的抑瘤效果；而基於表位TCR結 合位點改造的多肽疫苗有望通過增強對低親和力T細胞的刺激能力或者招募一群新的具 有交叉反應性的T細胞打破腫瘤免疫耐受而達到理想的抑瘤效果。HLA-A2. 1分子主要與九肽結合，其二位和九位為MHC主要錨定位點，Jorg Ruppert(Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2. 1 molecules. Cell. 1993,74(5) :929_37.)在研究主要錨定位點的優勢胺基酸中發 現二位為L或M，九位為L、V或I，能將表位與MHC結合的能力提高10 100倍。Tourdot (A general strategy to enhanceimmunogenicity of low-affinity HLA—A2. 1-associatedpeptides amplication in the identification ofcryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000,30(12) :3411_21.)指出一位Tyr的引入主要依靠其側鏈苯環的疏水作用以 及酚羥基的氫鍵作用增強表位肽與HLA分子的相互作用。本申請主要是採用理論和實驗相結合的方法修飾並初步鑑定出能夠與MHC分子 結合能力強的的MAGE-4來源的候選CTL表位肽及其類似物。我們通過對CT datebase的 篩選，發現了在食管鱗癌中高表達的癌睪抗原MAGE-4，它在食管鱗癌中的陽性表達率達到 了 74%，是CT抗原中非常理想的一個食管癌免疫治療靶抗原。根據抗原的一級結構，採用 免疫信息學手段，運用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL 1. 2資料庫對抗原MAGE-4的HLA-A2. 1 限制性CTL表位進行了預測分析。

發明內容
本發明目的在於用人工合成的方法提供一種具有抗腫瘤作用的MAGE-4來源的抗 腫瘤CTL表位肽，並提供表位肽的製備方法。本發明另一目的在於提供該MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽在製備腫瘤治療性多肽疫 苗中的應用。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案MAGE-4 抗腫瘤 CTL 表位肽，為九肽，其序列為a-b-Leu-Glu-His-Val-Val_Arg-c ； 其中，a 為 Lys 或 Tyr, b 為 Val 或 Leu ；c 為 Val 或 Leu。當 a 為 Lys，b 為 Val，c 為 Val 時，序列為 Lys-Val-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Va 1 (即 KVLEHVVRV，記為 P286)，分子量為 1078. 3。當 a 為 Tyr，b 為 Leu，c 為 Val 時，序列為 Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Va 1 (即 YLLEHVVRV，記為 P286-1Y2L)，分子量為 1127. 4。當 a 為 Tyr，b 為 Leu，c 為 Leu 時,序列為 Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Le u(即 YLLEHVVRL，記為 P286-1Y2L9L)，分子量為 1141. 4。所述MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽的製備方法，可以採用固相合成法合成CTL表位 肽。基本流程如下首先將一個氨基被Fmoc基團保護的胺基酸連接在不溶性固相載體Wang 樹脂上，然後脫掉氨基的保護基，第一個胺基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc 基團保護的第二個胺基酸的羧基用縮合劑活化，活化後的胺基酸再與已接在固相載體的第 一個胺基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重 復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最後切割 得到目的肽。經HPLC純化後，其純度大於90%，質譜分析並證實其分子量符合理論值。(參 見①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.賈庫布克著， 劉克良等譯，肽化學與生物學，科學出版社，2005年。)所述MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽在製備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。本發明優點利用在食管癌中高表達而在人體正常組織中不表達的抗原MAGE-4， 篩選出具有抗腫瘤活性的表位肽，鑑定的九肽均未見文獻報導，為研製基於抗原MAGE-4的 腫瘤治療性多肽疫苗提供理論基礎，並為後續多價的抗原肽疫苗構建奠定基礎。



圖1是本發明表位肽P286的質譜分析圖譜；圖2是本發明表位肽P286-1Y2L的質譜分析圖譜；圖3是本發明表位肽P286-1Y2L9L的質譜分析圖譜；圖4是本發明表位肽在轉基因小鼠體內誘導的特異性CTL對腫瘤細胞EC-9706殺 傷效應的檢測結果。實驗儀器名稱與型號電噴霧-離子阱多級質譜儀BRU KER Esquire-3000德國布魯克道爾頓儀器公司流式細胞儀Calibur美國BD公司
具體實施例方式以下通過實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的保護範圍不限於此。實施例1 抗腫瘤 CTL 表位肽 P286 (Lys-Val-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Val)的 製備採用Fmoc固相合成法，從C端一N端逐個延長。用芴甲氧羰醯基(Fmoc)保 護胺基酸的α 「氨基，各種Fmoc保護胺基酸的側鏈保護基分別為Arg(Pbf)、His (trt)、 Glu (OtBu)、Lys (Boc) (Pbf代表2，2，4，6，7_五甲基二氫苯並呋喃_5_磺醯基、trt代表三苯 甲基、OtBu代表叔丁脂、Boc代表叔丁氧羰基)。先將α _氨基保護的C端第一個胺基酸， 即Fmoc-Val-OH用Ν、Ν' - 二異丙基碳二亞胺(DIC)作縮合劑，並加入1_羥基苯並三氮唑 (HOBt)，將Fmoc-Val-OH連接到wang樹脂上；依次用DMF、無水甲醇、二氯甲烷、DMF洗滌；然 後用哌啶-DMF混合液 Vdmf= 1 4)除去Fmoc保護基，依次用DMF、無水甲醇、二氯 甲烷、DMF洗滌。再與C端第二個胺基酸即Fmoc-Arg (Pbf) -OH用DIC作縮合劑，並加HOBt， 將Fmoc-Arg (Pbf)-OH連接到Val的氨基上，用哌啶-DMF混合液(V Vdmf=I 4)脫 去Fmoc保護基，依次用DMF、無水甲醇、二氯甲烷、DMF洗滌。得Arg-Val-Wang樹脂。再與 Fmoc-Val-OH連接，重複上述步驟，依次連接上Val、His、Glu、Leu、Val, Lys,使肽鏈按序列 從C端一N端逐步延長，用哌啶-DMF混合液 Vdmf = 1 4)脫去Fmoc保護基，用切 割試劑(V三氟V苯甲硫醚V水乂苯 : Vuu醇=82. 5 5 5 5 2. 5)將Ρ286從 Wang樹脂上切下，並脫去Pbf、trt、OtBu, Boc保護基，得到抗腫瘤CTL表位肽P286粗品。HPLC分離純化用 C18製備性HPLC柱(Partisil 100DS-39. 4X 250讓，Whatman 公司) 分離純化。取上述P286粗品30mg溶於3ml含三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)的水溶液a(TFA體 積含量為0. 1 %，CAN體積含量為30 % )中，用a進行等梯度洗脫，流速5ml/min，收集主峰，冷 凍乾燥得精肽。將產物進行質譜分析見圖1，結果證實分子量為1078. 3，與理論值相符合。實施例2 抗腫瘤 CTL 表位肽 P286-1Y2L (Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Va 1)的製備採用與實施例1同樣的合成方法，不同之處僅在於用Leu替代N端第二個胺基酸 Val, Tyr 替代 Lys。將產物進行質譜分析見圖2，結果證實分子量為1127. 4，與理論值相符合。實施例3 抗腫瘤 CTL 表位肽 P286-1Y2L9L (Tyr-Leu-Leu-Glu-HiS-Val-Val-Arg-Leu)的製備
採用與實施例1同樣的合成方法，不同之處僅在於用Leu替代N端第二個胺基酸 Val，用Leu替代N端第九個胺基酸Val，Tyr替代Lys。將產物進行質譜分析見圖3，結果證實分子量為1141. 4，與理論值相符合。上述製備的CTL表位肽，可用於製備腫瘤治療性多肽疫苗，其應用實驗如下1、表位肽與HLA-A2. 1分子結合力試驗(l)800rpm離心收集HLA-A2. 1表達陽性且內源性抗原加工處理能力缺失的T2細 胞(ATCC公司)，PH7. 2的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌3次，無血清RPMI 1640培養基(Gibico 公司)重懸至細胞密度為1 X 106/mL,接種於24孔板中。(2)每孔加入50 ii g表位肽和0. 5 ii g人3 2微球蛋白(Sigma公司)，37°C共孵育 18h ；(3)用4°C的PBA(將2g牛血清白蛋白，0. 2g疊氮化鈉溶解於100ml PH7. 4的PBS 中即得PBA)洗滌3次，加100 ill用PH 7. 4的PBS 100倍稀釋後的鼠抗人HLA-A2. 1分子 的單克隆抗體BB7. 2 (Sigma公司)，4°C避光孵育40min ；(4)用4°C的PBA洗滌3次，加入50 yl用PH 7. 4的PBS 50倍稀釋後的異硫氰酸 螢光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG(北京博奧森生物技術有限公司)，4°C避光孵育30min ；(5) PBA洗滌後於流式細胞儀檢測。結果用螢光係數FI表示，詳見表1。結果顯示，三條表位肽均顯示出中等結合力，且改造肽P286-1Y2L和P286-1Y2L9L 均高於母體肽P286。2、表位肽/HLA-A 2. 1分子複合物穩定性分析(l)800rpm離心收集T2A2細胞，PH7. 2的PBS洗滌3次，無血清RPMI 1640培養基 重懸至細胞密度為1 X 106/mL,接種於24孔板中；(2)每孔加入50 ii g表位肽和0. 5 ii g人0 2微球蛋白，37°C共孵育18小時；(3) 4°C PH7. 2的PBS洗滌4次以除去未結合的肽；(4)每孔加入 10 u g BrefeldinA(BFA, Sigma 公司)孵育 lh，PBS 洗滌；(5)37°C>5% C02 分別孵育 0h、2h、4h、6h ；(6)孵育結束後，用4°C的PBA洗滌3次，加100 yl用PH 7. 4的PBS 100倍稀釋 後的鼠抗人HLA-A2. 1分子的單克隆抗體BB7. 2(—抗)，4°C反應30min ；(7) 4°C的PBA洗滌3次，加50 yl用PH 7. 4的PBS 50倍稀釋後的FITC標記的羊 抗鼠IgG4°C反應30min ；(8)4°C的PBA洗滌後於流式細胞儀檢測。結果用表位肽/HLA-A2. 1分子複合物的 半衰期DC5(1表示，詳見表1。由表1可知，三條表位肽的半衰期均大於2h。表1表位肽與HLA-A2. 1結合力及穩定性試驗結果
表位肽FIDC50/hP2860. 392 4 注FI =(表位肽平均螢光強度_背景平均螢光強度)/背景平均螢光強度FI > 1.5 表位肽與HLA-A2. 1具有強結合力；0. 5 < FI < 1. 5 中等結合力；FI < 0. 5 弱結合力；DC50為50%表位肽/HLA-A2. 1分子複合物解離所需的時間。3.轉基因小鼠體內試驗3.1CTL 體內誘導免疫方案隨機選取8 12周齡HLA-A2. 1/Kb轉基因小鼠(第二軍醫大曹雪濤教 授惠贈)，雌雄隨機，每組4隻小鼠。將lOOyg表位肽、140iig Th表位肽(I_AbB肝病毒核 心抗原來源的Th細胞表位TPPAYRPPNAPIL，可以採用常規的Fmoc固相合成法製備或者購買 市售產品)、50 ill弗氏不完全佐劑(IFA，sigma公司)和50 yl PH7. 2的PBS混合乳化獲 得的免疫製劑於小鼠尾根部皮下注射，劑量為100 yl/只，分別於第1天、第6天、第11天 進行注射，共注射3次，第12天取小鼠脾臟細胞。設置PBS組(即不加入表位肽和Th表位 肽)和Th+PBS組(即不加入表位肽)做陰性對照。3.2效應01製備(1)將上述注射三次的小鼠於第12天脫頸致死，酒精浸泡2 3min消毒後，於超 淨臺中無菌取出小鼠脾臟；(2)200目鋼網研磨，PBS(PH7. 2)衝洗，得脾細胞懸液；(3) 800rpm 離心，棄上清；(4)加入5ml紅細胞裂解液(北京鼎國公司)，重懸細胞，4°C孵育5min ；(5) 800rpm 離心，收集細胞，PBS (PH7. 2)洗滌 3 次；(6)細胞重懸於10ml含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培養基 (Gibico公司)中得細胞懸液，然後將其於6孔板中培養，每孔5ml ；(7)次日每孔加入 250U Recombinant mouse IL-2 (PR0SPEC 公司)和 50 ii g 表位 肽；(8)體外培養6天後收穫效應細胞CTL，進行LDH檢測。LDH 檢測使用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (細胞毒性 檢測試劑盒，Promega公司)進行LDH試驗檢測細胞毒活性。步驟如下(詳見試劑盒說明 書)1)設立檢測板(100 Pi/孔)(1)設立實驗組以腫瘤細胞EC-9706 (ATCC公司)作為靶細胞(最優靶細胞數 5000)按不同效靶比20 1,40 1,80 1加入上述效應細胞CTL(2)設立效應細胞自發釋放組(3)設立靶細胞自發釋放組
7
(4)設立靶細胞最大釋放組(5)設立體積校正對照組(6)設立背景對照組2)細胞裂解及收穫上清(1)37°C>5% C02 孵育檢測板(5h)(2)靶細胞最大釋放組和體積校正對照組中加入裂解液，每100 iU培養基中加入 10 u 1裂解液(10 X)，收穫上清前45min加入裂解液(3)250g離心4min，收穫上清3) LDH 檢測(1)轉移50 ill上清至另一孔板(2) 50 u 1/孔迅速添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30min(3)添加50 u 1終止溶液(4)將孔中含有的氣泡去除，一小時內檢測490nm吸收值0D。細胞殺傷率計算公式如下(% ) = [(0D實驗組H3D效應細胞自發釋放組—ODm細胞自發釋放組)/(0Dm細胞最大釋放組—ODm細
es ffl)]X100% (注所有實驗組、效應細胞自發釋放組、靶細胞自發釋放組的吸收值均 應減去背景對照組的平均吸收值；靶細胞最大釋放組吸收值應減去體積校正對照組的平均 吸收值)結果見圖4，由圖4可知，在效靶比80 1時三條表位肽誘導的特異性CTL對腫瘤 細胞EC-9706均顯示出一定的殺傷率。由此，可知MAGE-4來源的抗腫瘤CTL表位肽能夠用 於製備腫瘤治療性多肽疫苗。
權利要求
MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽，其特徵在於，所述抗腫瘤CTL表位肽為九肽，其序列為a-b-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-c；其中，a為Lys或Tyr，b為Val或Leu；c為Val或Leu。
2.如權利要求1所述MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽，其中a為Lys，b為Val，c為Val時， 序列為 Lys-Val-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Val。
3.如權利要求1所述MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽，其中a為Tyr，b為Leu，c為Val時， 序歹丨J為 Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Val。
4.如權利要求1所述MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽，其中a為Tyr，b為Leu，c為Leu時， 序列為 Tyr-Leu-Leu-Glu-Hi s-Val-Val-Arg-Leu。
5.權利要求1至4任一所述MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽的製備方法，其特徵在於，採用 固相合成法製備CTL表位肽。
6.權利要求1至4任一所述MAGE-4抗腫瘤CTL表位肽在製備腫瘤治療性多肽疫苗中 的應用。
全文摘要
本發明涉及一種MAGE-4來源的抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其序列為a-b-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-c(其中a為Lys或Tyr，b為Val或Leu；c為Val或Leu)，表位肽P286序列為Lys-Val-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Val；抗腫瘤CTL表位肽P286-1Y2L序列為Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Val；抗腫瘤CTL表位肽P286-1Y2L9L的序列為Tyr-Leu-Leu-Glu-His-Val-Val-Arg-Leu。本發明所述抗腫瘤CTL表位肽在轉基因小鼠體內所誘導的特異性CTL對腫瘤細胞EC-9706顯示出一定的殺傷率，可用於製備腫瘤治療性多肽疫苗。
文檔編號A61K39/00GK101870725SQ20101021252
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者劉偉, 呂虹, 吳亞紅, 吳宗胤, 李璐, 祁元明, 高豔鋒 申請人:鄭州大學