一種具有高效驅動活性的啟動子的製作方法
2023-09-19 18:17:35 1
一種具有高效驅動活性的啟動子的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有高效驅動活性的啟動子。揭示一種來源於植物Histone3.3基因的多核苷酸，將其作為啟動子元件，可指導目的基因高水平表達。本發明的啟動子具有廣泛的活性，能夠指導目的基因高水平表達。
【專利說明】一種具有高效驅動活性的啟動子
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物技術和植物學領域；更具體地，本發明涉及一種具有高效驅動活性的啟動子。
【背景技術】
[0002]在植物基因工程中常用的啟動子按其作用和功能分為三種:組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異型啟動子。其中組成型啟動子最為常用。組成型啟動子分為內源組成型和異源組成型啟動子兩大類。植物基因工程中常用的內源啟動子主要有水稻肌動蛋白(actin)基因和玉米泛素(ubiquitin)基因的啟動子。異源組成型啟動子有來自農桿菌的Nos和Ocs啟動子以及來源於菸草花葉病毒基因的CaMV35S啟動子。組成型啟動子在所有組織中都有表達，具有持續性但不具有時空特異性。重複使用同一啟動子驅動兩個或兩個以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現象。然而關於CaMV35S啟動子在轉基因生物安全性角度存在潛在風險的問題報導比較多。已有文獻報導認為CaMV35S啟動子來源於菸草花葉病毒，一旦在轉基因過程中整合到病毒隱性基因附近就有可能激活病毒的表達，或者CaMV35S啟動子插入到編碼毒素蛋白的基因上遊，將增強毒素蛋白的表達，使得轉基因植物的安全性面臨巨大的挑戰。
[0003]真核生物的細胞核中與DNA結合的蛋白質包括組蛋白和非組蛋白類。組蛋白指細胞核中與DNA結合的鹼性蛋白質的總稱。組蛋白富含精氨酸和賴氨酸等鹼性胺基酸，二者加起來約為所有胺基酸殘基的1/4。它們分子量較小，大約10000~20000道爾頓。組蛋白主要有五種——Hl、H2A、H2B、H3、H4，它們具有不同的分子量和胺基酸組成。在五種組蛋白中，四種組蛋白(H2A、H2B、H3、H4)分子量較小(102~135個胺基酸殘基)，Hl的分子量較大(約含220個胺基酸殘基)，序列保守程度相對較低，但結構相似，Hl組蛋白其球形中心結構域在進化上保守，而 N端和C端兩個「臂」的胺基酸變異較大，所以Hl在進化上不如核小體組蛋白那麼保守，在構成核小體時Hl起連接作用，它賦予染色質以極性。
[0004]除常規的組蛋白外，組蛋白還有各種不同的變體，尤其是在核心組蛋白H2A、H3和連接組蛋白Hl中。核心組蛋白H2B和H4變化相對較少。根據與對應的常規組蛋白胺基酸序列的不同，組蛋白變體可分為兩類:一類是由胺基酸替換產生的變體，胺基酸總數不變，稱為同型變體(Homomorphous variants),如植物常規組蛋白H3 (即H3.1)及其變體H3.3。它們之間只在四個位置胺基酸呈現不同，分別在第31位(H3.1中為甘氨酸，H3.3中為蘇氨酸)、41位(H3.1中為苯丙氨酸，H3.3中為酪氨酸)、87位(H3.1中為半胱氨酸，H3.3中為組氨酸)和90位(H3.1中為甘氨酸，H3.3中為亮氨酸)。雖然H3.1和H3.3之間只有四個胺基酸的區別，但它們在染色質上的分布和功能有很大不同。H3.1主要在DNA複製過程中加載入染色質，而H3.3則可以不依賴於DNA複製而加載入間期染色質。H3.1主要與沉默的染色質有關，而H3.3主要與轉錄活躍的染色質有關。在植物包括擬南芥、水稻和玉米組蛋白H3.3的胺基酸序列分析結果中發現植物的組蛋白H3.3非常保守。
[0005]因此，結合現有的植物工程技術，對高表達保守蛋白的啟動子的功能研究是非常必要的。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種具有高效驅動活性的啟動子及其應用。
[0007]在本發明的第一方面，提供分離的多核苷酸，所述的多核苷酸是:
[0008](I)SEQ ID NO:2所不的核苷酸序列的多核苷酸；
[0009](2) SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0010](3) SEQ ID N0:4所不的核苷酸序列的多核苷酸；
[0011](4) SEQ ID NO: 34中(1-743)~1405位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0012](5) SEQ ID NO: 35中(1-1076)~1369位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0013](6) SEQ ID NO: 13所不的核苷酸序列的多核苷酸； [0014](7) SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0015](8) SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0016](9) SEQ ID NO: 16所不的核苷酸序列的多核苷酸；
[0017](IO)SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0018](11)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列雜交且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸；或
[0019](12)核苷酸序列與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列有80%以上(較佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上)相同性且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸。
[0020]在另一優選例中，⑷中，包括:SEQID NO:34 中第464-1405位(pHTR4_5 (942bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸;SEQ ID NO: 34中第276-1405位(pHTR4_6 (1130bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID N0:34所示的核苷酸序列的多核苷酸。
[0021]在另一優選例中，(5)中，包括:SEQID NO:3 中第201-521 位(pHTR711_2 (521bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO:35中第624-1369位(pHTR711_4(746bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO: 35中第416-1369位(pHTR711_5 (954bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO: 35中第200-1369位(pHTR711_6 (1170bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID N0:35所示的核苷酸序列的多核苷酸。
[0022]在本發明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用於作為啟動子元件。
[0023]在一個優選例中，所述的啟動子元件用於指導目的基因強表達。
[0024]在另一優選例中，所述的目的基因是結構基因。
[0025]在另一優選例中，所述的目的基因可編碼具有特定功能的蛋白。
[0026]在另一優選例中，所述的目的基因是外源基因。
[0027]在本發明的另一方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的多核苷酸，作為啟動子元件。
[0028]在一個優選例中，所述的載體還含有與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因。
[0029]在另一優選例中，所述的目的基因位於所述多核苷酸的下遊。
[0030]在另一優選例中，所述的目的基因位於所述多核苷酸的下遊，且與所述多核苷酸的間隔小於1000bp ;優選的，小於500bp ;更優選的，小於200bp。[0031]在另一優選例中，所述的目的基因位於所述多核苷酸的下遊，且與所述多核苷酸的間隔小於lOObp，更佳地小於50bp。
[0032]在另一優選例中，所述的載體是真核表達載體。
[0033]在另一優選例中，在所述多核苷酸的下遊包含多克隆位點或至少一個酶切位點。
[0034]在本發明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞(較佳地，所述的宿主細胞不是動植物繁殖材料)，所述的細胞:
[0035]含有所述的載體；或其基因組中整合有外源的所述的多核苷酸。
[0036]本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1、擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子驅動⑶S基因表達圖。
[0038]A:pCambial300-CaMV35S-GUS轉化菸草，在愈傷組織中⑶S組織化學染色結果；
[0039]B:pCambial300-pHTRl-GUS轉化菸草，在愈傷組織中⑶S組織化學染色結果；
[0040]C:pCambial300-pHTR4-GUS轉化菸草，在愈傷組織中⑶S組織化學染色結果。
[0041]圖2、擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子驅動⑶S基因表達圖。
[0042]A:pCambial300-pHTRl-GUS轉化菸草，在菸草葉片中⑶S組織化學染色結果；
[0043]B:pCambial300-pHTR4-GUS轉化菸草，在菸草葉片中⑶S組織化學染色結果；
[0044]C:pCambial300-CaMV35S-GUS轉化菸草，在菸草葉片中⑶S組織化學染色結果。
[0045]圖3、擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子驅動⑶S基因表達圖。
[0046]Al，A2:pCambial300-pHTRl-GUS轉化擬南芥，在擬南芥蓮座葉、莖生葉和花序中的GUS組織化學染色結果；
[0047]BI, B2:pCambial300-pHTR4-GUS轉化擬南芥，在擬南芥蓮座葉、莖生葉和花序中⑶S組織化學染色結果；
[0048]Cl，C2:pCambial300-CaMV35S-GUS轉化擬南芥，在擬南芥蓮座葉、莖生葉和花序中⑶S組織化學染色結果。
[0049]圖4、轉基因擬南芥中HTR1，HTR4和YFP的Ct值差異圖。橫坐標為三株樣本，分別是35S-l，35S-2，35S-3 ;縱坐標為Ct值。
[0050]圖5、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅動⑶S基因表達圖。
[0051]A:pCambial300-CaMV35S-GUS轉化中花11愈傷組織，⑶S組織化學染色結果；
[0052]B:pCambial300-pHTR711-GUS轉化中花11愈傷組織，⑶S組織化學染色結果；
[0053]C:pCambia l300-pHTR712-GUS轉化中花11愈傷組織，⑶S組織化學染色結果。
[0054]圖6、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅動GFP基因表達在亞細胞水平的定位圖。
[0055]A:水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅動GFP基因在三葉期狐尾草葉片細胞核中的表達情況；
[0056]B:在單個狐尾草葉片細胞中GFP基因的表達情況；
[0057]C:狐尾草植株(Green foxtail, Setaria viridis (L.)P.Beauv) ?
[0058]圖7、7個擬南芥基因HTR4啟動子片段示意圖。其中，pHTR4_l (116bp)代表SEQID NO: 2 序列中第 548-663 位；pHTR4-2 (263bp)代表 SEQ ID NO: 2 序列中第 401-663 位；PHTR4-3 (453bp)代表 SEQ ID NO: 2 序列中第 211-663 位；pHTR4_4 (663bp)即 SEQ ID NO: 2序列；pHTR4-5 (942bp)序列如 SEQ ID NO: 34 中第 464-1405 位;pHTR4_6 (1130bp)序列如SEQ ID NO:34 中第 276-1405 位；pHTR4-7(1405bp)序列如 SEQ ID NO:34 序列。
[0059]圖8、7個水稻基因HTR711啟動子片段示意圖。其中，pHTR711_l (201bp)代表 SEQ ID N0:3 序列中第 321-521 位；pHTR711-2(321bp)代表 SEQ ID N0:3 序列中第201-521 位；pHTR711-3(521bp)代表 SEQ ID NO:3 序列;pHTR711_4(746bp)序列如 SEQID NO:35 中第 624-1369 位；pHTR711-5(954bp)序列如 SEQ ID NO:35 中第 416-1369 位;pHTR711-6(1170bp)序列如 SEQ ID NO:35 中第 200-1369 位;pHTR711_7 序列如 SEQ IDNO:35序列。
[0060]圖9、7個擬南芥基因HTR4啟動子的螢光圖。
[0061]A:pHTR4-l啟動子的螢光圖；
[0062]B:pHTR4-2啟動子的螢光圖；
[0063]C:pHTR4-3啟動子的螢光圖；
[0064]D:pHTR4-4啟動子的螢光圖；
[0065]E:pHTR4-5啟動子的螢光圖；
[0066]F:pHTR4-6啟動子的螢光圖；
[0067]G:pHTR4_7啟動子的螢光圖。
[0068]圖10、7個水稻基因HTR711啟動子的螢光圖。
[0069]A:pHTR711-l啟動子的螢光圖；
[0070]B:pHTR711-2啟動子的螢光圖；
[0071]C:pHTR711-3啟動子的螢光圖；
[0072]D:pHTR711-4啟動子的螢光圖；
[0073]E:pHTR711-5啟動子的螢光圖；
[0074]F:pHTR711-6啟動子的螢光圖；
[0075]G:pHTR711_7啟動子的螢光圖。
[0076]圖11、7個擬南芥基因HTR4和7個水稻基因HTR711啟動子螢光值的箱體圖。
[0077]A:7個擬南芥基因HTR4啟動子螢光值的箱體圖；
[0078]B:7個擬南芥基因HTR711啟動子螢光值的箱體圖。
[0079]圖12、擬南芥基因HTR1、HTR4啟動子及CaMV35S啟動子驅動⑶S基因表達圖。
[0080]A:pCambial300-pHTRl-GUS轉化擬南芥，在整株中⑶S組織化學染色結果；
[0081]B:pCambial300-CaMV35S-GUS轉化擬南芥，在整株中⑶S組織化學染色結果；
[0082]C:pCambial300-pHTR4-GUS轉化擬南芥，在整株中⑶S組織化學染色結果。
[0083]圖13、玉米基因HTR101、HTR102、HTR104和HTR113啟動子驅動⑶S基因表達圖。
[0084]Al, A2:pCambial300-pHTR101-GUS轉化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S組織化學染色結果；
[0085]BI, B2:pCambial300-pHTR102-GUS轉化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S組織化學染色結果；
[0086]Cl，C2:pCambial300-pHTR104-GUS轉化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S組織化學染色結果；
[0087]Dl, D2:pCambial300-pHTR113-GUS轉化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S
組織化學染色結果。
[0088]圖14、水稻基因HTR706啟動子驅動⑶S基因表達圖。
[0089]A:pCambial300-pHTR706-GUS轉化擬南芥，在莖生葉中⑶S組織化學染色結果；
[0090]B:pCambial300-pHTR706-GUS轉化擬南芥，在蓮座葉中⑶S組織化學染色結果。
【具體實施方式】
[0091]本發明人通過廣泛而深入的研究，揭示一種核酸，將其作為啟動子元件，可指導目的基因高水平表達。本發明的啟動子來源於HiStone3.3基因的啟動子區域。本發明的啟動子具有廣泛的活性，能夠指導目的基因高水平表達(強表達)。在此基礎上完成了本發明。
[0092]如本文所用，所述的「啟動子」或「啟動子區(域)」是指一種核酸序列，其通常存在於目的基因編碼序列的上遊(5』端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。
[0093]如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然 環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
[0094]如本文所用，所述的「可操作地連接」或「操作性連接」是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如:啟動子區被置於相對於目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被「可操作地連接」到該核酸序列上。
[0095]如本文所用，所述的「高水平表達」是指:利用本發明的啟動子指導一目的基因(如GUS基因)的表達與CaMV35S啟動子指導該目的基因表達相比，利用本發明的啟動子所得的表達量顯著更高。蛋白表達量的檢測是本領域技術人員熟知的技術。
[0096]如本文所用，所述的「SEQ ID NO:34中(1-743)~1405位所示的核苷酸序列」也即指所述序列可起始於SEQ ID NO:34中第I位至第743位中的任一位的鹼基，終止於SEQID NO:1中第1405位的鹼基。
[0097]如本文所用，所述的「SEQ ID NO:35中(1-1076)~1369位所示的核苷酸序列」也即指所述序列可起始於SEQ ID NO: 35中第I位至第1076位中的任一位的鹼基，終止於SEQID NO:1中第1369位的鹼基。
[0098]啟動子及其指導的基因表達
[0099]基於本發明人的新發現，提供一種分離的核酸，所述的核酸具有SEQ ID NO:2,SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQID NO: 17所示的核苷酸序列或這些序列的片段以及含有這些序列的長度更長的核苷酸序列，所述的核酸可作為指導目的基因表達的啟動子元件。[0100]此外,本發明還包括上述核酸的一些具有相同功能的變異體。包括:
[0101]序列在嚴格條件下能夠與SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ IDNO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17 所示的核苷酸序列或其片段或延長序列雜交且具有指導目的基因高水平表達功能的核酸；或
[0102]序列與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列或其片段或延長序列有80%以上同源性且具有指導目的基因高水平表達功能的核酸；或
[0103]序列與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列或其片段或延長序列互補(優選完全互補)的核酸。
[0104]多核苷酸的雜交是本領域技術人員熟知的技術，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發明還涉及與SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 所示的核苷酸序列或其片段或延長序列雜交且兩個 序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的核酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述核酸可雜交的多核苷酸。
[0105]在本發明中，「嚴格條件」是指:(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲醯胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。並且，可雜交的核酸也具有指導目的基因高水平表達的功能。
[0106]在本發明的實例中，在本發明的啟動子的指導下，可以使GUS基因或GFP基因高水平地表達。因此可見，本發明的啟動子是一種特別適合於指導目的基因表達的啟動子，在基因表達的研究中具有重要的應用價值。
[0107]本發明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對於啟動子而言可以是外源(異源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一種結構性核酸序列)，所述的目的基因優選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。
[0108]例如，所述的目的基因包括但不限於:GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等。GUS作為一種代表性的指示基因表達狀況的工具，可良好地指示由啟動子指導的基因表達情況。而由本發明的啟動子可指導GUS高表達這一實例，可顯而易見地得知本發明的啟動子作為基因調控兀件，可指導其它任何合適的基因的聞表達。
[0109]作為本發明的優選方式，所述的目的基因可以是一種對於某一植物或特定植物組織或器官而言缺失或表達量不足的基因，可將該目的基因與本發明的啟動子可操作地連接，或將目的基因與本發明的啟動子可操作的連接入合適的載體中，採取適當的方式導入到適當的細胞內，並傳遞到該植物或特定植物組織或器官內，從而驅動目的基因高水平地表達。
[0110]所述的「植物」沒有特別的限制，只要該植物適合進行基因的轉化操作(轉基因操作)，如各種農作物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是:雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。例如但不限於:十字花科(如蕓薹屬的大白菜、小白菜)，十字花科(如鼠耳芥屬植物(如擬南芥))，禾本科(如水稻)，茄科(如菸草)，此外還包括瓜果、蔬菜、油菜等等。更具體地，所述的植物包括(但不限於):小麥、大麥、黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、樓桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、Il粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿蔔、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、菸葉、堅果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。
[0111]本發明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進的目的基因序列上，該目的基因相對於啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進來產生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進來增加必需胺基酸的含量，提高胺基酸序列的翻譯，改變翻譯後的修飾(如磷酸化位點)，將翻譯產物轉運到細胞外，改善蛋白的穩定性，插入或刪除細胞信
V寸O
[0112]此外，啟動子和目的基因可以設計成下調特定基因。這一般是通過將啟動子連接到目的基因序列上來實現，該序列以反義反向被引導。本領域的普通技術人員熟悉這種反義技術。任何核酸序列可以以這種方式被調節。
[0113]本發明的啟動子和目的基因序列可被包含在重組載體中。 [0114]所述的重組載體一般包括(從5』到3』方向):引導目的基因轉錄的啟動子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3』轉錄終止子，3』多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉運和靶向核酸序列、抗性選擇標記、增強子或操作子。
[0115]作為一種方式，所述的重組載體包括本發明的啟動子，在所述啟動子的下遊包含多克隆位點或至少一個酶切位點。當需要表達目的基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶切位點內，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。
[0116]用於製備重組載體的方法是本領域技術人員所熟知的。術語「表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、病毒或其他載體。總之，只要其能夠在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都是可以被採用的。優選的，所述的表達載體是真核表達載體。
[0117]本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含有本發明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0118]此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新黴素抗性、潮黴素抗性以及綠色螢光蛋白O^FP)、⑶S 等。
[0119]重組載體中除了含有本發明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。所述的其它啟動子例如是:組織特異性的、組成型的或誘導型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒 19S 和 35S(CaMV19S CaMV35S)、增強的 CaMV、菸草 RB7 等。
[0120]作為本發明的一種實例,所述的載體是pCambia系列載體。即利用pCambia上的多克隆位點，可將本發明的啟動子區域構建到報告基因如GUS或GFP的前面，轉化宿主細胞，啟動子激活GUS或GFP編碼基因的表達，所述啟動受到啟動子區各順式作用元件的調控，模擬了基因在體內被激活轉錄的狀況。
[0121]包含上述適當的啟動子和目的基因的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0122]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，酵母，動物的組織細胞，植物細胞等。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體和宿主細胞。
[0123]本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。
[0124]本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子或宿主細胞。
[0125]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法、花芽浸泡法等。對於轉化的植物組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得轉基因的植物。
[0126]作為一種方式，製備轉基因植物的方法是:將攜帶啟動子和目的基因(兩者可操作地連接)的雙元載體轉入農桿菌，農桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉基因受體植物例如是擬南芥、菸草和水稻。
[0127]本發明的主要優點在於:
[0128](I)揭示一種可指導目的基因高水平表達的啟動子，利用本發明的啟動子可以高強度地啟動目的基因的大量表達。
[0129](2)本發明為外源基因表達導致相關基因沉默的現象以及水稻育種過程中引進的外源啟動子如Cauliflower Mosaic Virus35S Promoter (CaMV35S)存在潛在的生物安全性風險等問題提供了一種新的解決途徑。
[0130]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0131]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
[0132]實施例1、啟動子的獲得
[0133]本發明分別克隆了擬南芥組蛋白變體H3.3基因HTR4(AT4G40030)以及水稻組蛋白基因 HTR711(L0C_0s03g27310)和 HTR712 (L0C_0s06g04030)的 5』端調控區啟動子。擬南芥基因HTR4啟動子序列如SEQ ID NO:2 ;水稻基因HTR711啟動子序列如SEQ ID NO:3 ;水稻基因HTR712啟動子序列如SEQ ID NO:4 ;擬南芥基因HTRl啟動子序列如SEQ ID NO:1,作為對照。 [0134]上述啟動子序列可用於構建報告基因表達載體。
[0135]實施例2、擬南芥基因HTR4啟動子驅動⑶S基因表達的活性檢測[0136]1、轉基因菸草GUS組織化學染色檢測啟動子活性
[0137]在擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子、CaMV35S的驅動下，以⑶S為報告基因構建植物表達載體 pHTRl-GUS、pHTR4-GUS 及 CaMV35S_GUS。
[0138]擬南芥基因HTR1、HTR4啟動子、CaMV35S序列分別插入到pCambial300表達載體(購自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位點中(即位於⑶S報告基因的上遊)。⑶S兀件插入到pCambial300的BamHI和SacI酶切位點。
[0139]獲得的重組載體分別命名為:pCambial300-pHTRl-GUS、pCambial300-pHTR4_GUS及 pCambial300-CaMV35S-GUS。 [0140]將構建的重組載體轉化農桿菌EHA105 (參見Hood, E.E.等，TransgenicRes.，1993，2，208 - 218)，篩選陽性克隆。以獲得的含有目的基因質粒的農桿菌轉染菸草葉片，共培養2天後轉入篩選培養基，去除殘餘的農桿菌。大約I個月左右將感染了農桿菌的陽性愈傷組織進行組織化學染色，檢測GUS基因的瞬時表達。待菸草長出抗性不定芽之後，將芽切下轉入含有抗性的生根培養基中，約一個月左右將生根的菸草小苗轉入盆中，在溫室中培養，I個月左右取葉片進行組織化學染色檢測GUS基因的瞬時表達。
[0141]將共培養的愈傷組織或葉片用滅菌蒸餾水漂洗後置於1.5ml離心管中，加入沒過愈傷組織的GUS染色液並混勻，使愈傷組織與染色液充分接觸；於37°C溫浴2小時或過夜；以70%的乙醇為脫色液對愈傷組織進行脫色並觀察藍色斑點。
[0142]HTR4(H3.3)的啟動子主要在細胞間期高度表達，在營養器官高水平組成性表達。HTRl (H3.1)的表達是與DNA複製緊密相關的，在DNA複製過程中即S期H3.1大量合成。⑶S組織化學染色結果表明了在菸草愈傷組織中擬南芥基因HTRl啟動子驅動的GUS基因的表達活性明顯高於HTR4和CaMV35S驅動的⑶S表達活性，如圖1所示。
[0143]在轉基因菸草葉片中，擬南芥基因HTR4啟動子驅動的⑶S基因的表達活性明顯高於HTRl驅動的⑶S表達活性，如圖2所示。但是，在不同時期，擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子的驅動活性均比常用的組成型啟動子CaMV35S的活性高。
[0144]2、轉基因擬南芥GUS組織化學染色檢測啟動子活性
[0145]將構建的植物表達載體pCambial300-pHTRl-GUS、pCambial300-pHTR4_GUS 及pCambial300-CaMV35S-GUS轉化農桿菌GV3101 (Invitrogen)，篩選陽性克隆。以獲得的含有目的基因質粒的農桿菌轉染擬南芥花序，用保鮮膜包裹擬南芥苗後暗培養2天，之後轉入光培養，在溫室培養約I個半月後收集種子。在篩選培養基上篩選TO代種子，鑑定Tl代苗後轉入盆中，在溫室培養2周後，取葉片進行組織化學染色檢測GUS基因的瞬時表達。
[0146]在轉基因擬南芥葉片(尤其在花序)中，擬南芥基因HTR4啟動子驅動的GUS基因的表達活性明顯高於HTRl和CaMV35S驅動的⑶S表達活性，⑶S染色最明顯，如圖3所示。以上實驗說明在不同生長時期，擬南芥基因HTR4啟動子的驅動活性較常用的組成型啟動子CaMV35S的活性高。
[0147]3、定量RT-PCR(qRT-PCR)方法檢測啟動子活性
[0148]構建植物表達載體pCambial301-CaMV35S-Copl-YFP:將CaMV35S啟動子片段克隆到載體pCambial301 (購自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位點；之後將cop I (以擬南芥 cDNA 為模板，以 sall-copl-5:CCCGTCGACATGGAAGAGATTTCGACGGATCCGG(SEQ IDNO:5) ；spe1-copl-3:CCCACTAGTCGCAGCGAGTACCAGAACTTTG (SEQ ID NO:6)為引物的 PCR 擴增產物)片段克隆到載體上的SalI和SpeI位點；將YFP片段克隆到載體的SpeI和SacI位點。
[0149]將構建的植物表達載體pCambial301-CaMV35S-Copl_YFP轉化農桿菌GV3101 (Invitrogen)，篩選陽性克隆。以獲得的含有目的基因質粒的農桿菌轉染擬南芥花序，用保鮮膜包裹擬南芥苗後暗培養2天，之後轉入光培養，在溫室培養約I個半月後收集種子。在篩選培養基上篩選TO代種子，鑑定Tl代苗後轉入盆中，在溫室培養2周後，取葉片抽提RNA，反轉錄成cDNA後做定量PCR反應。
[0150]HTRl和HTR4啟動子(內源)的表達水平可以通過檢測HTRl和HTR4基因cDNA的表達來反映，因為Copl是擬南芥的內源基因，所以通過檢測YFP的活性來反映CaMV35S啟動子的表達水平。
[0151]RT-PCR檢測引物如下:
[0152]HTRl:F:CGTACCAAGCAAACCGCAAGGAAA(SEQ ID NO:7)；
[0153]R:AGGACGGAATCTGTGTGGCTTCTT(SEQ ID NO:8)；
[0154]HTR4:F:TGCACCAACTACTGGTGGAGTCAA(SEQ ID NO:9)；
[0155]R:AGCTAAGACAGCATGGCTCTGGAA(SEQ ID NO:10)；
[0156]YFP:F:TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCA(SEQ ID NO:11)；
[0157]R:TCTTGTAG TTGCCGTCGTCCTTGA(SEQ ID NO:12)。
[0158]圖4顯示了 HTR1，HTR4，YFP基因Ct值的差異圖，本發明人選取了 3株轉pCamb i a 1301 -CaMV3 5 S-Cop 1-YFP的轉基因擬南芥苗作為材料，橫坐標為3個樣本(35S-1，35S-2，35S-3)，縱坐標為 Ct 值。
[0159]定量的結果顯示三個材料中，HTR4基因的Ct值最小，HTRl比YFP略低。這就反映了在三株轉基因擬南芥葉片中，HTR4啟動子的表達是最強的。
[0160]實施例3、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅動⑶S基因表達
[0161]在水稻基因HTR711和HTR712啟動子的驅動下，以⑶S為報告基因構建植物表達載體 pCambial300-pHTR711-GUS、pCambial300-pHTR712_GUS 及 pCambial300-CaMV35S_GUS，將構建的質粒轉化農桿菌EHA105，篩選陽性克隆。
[0162]水稻基因HTR711和HTR712啟動子、CaMV35S序列分別插入到pCambial300表達載體的HindIII和BamHI酶切位點中(即位於⑶S報告基因的上遊)。⑶S元件插入到pCambial300 的 BamHI 和 SacI 酶切位點。
[0163]以獲得的含有目的質粒的農桿菌轉染水稻轉化受體(中花11)的愈傷組織，共培養兩天後轉入篩選培養基，去除殘餘的農桿菌；三天後將感染了農桿菌的陽性愈傷組織進行組織化學染色檢測⑶S基因的瞬時表達。將共培養的愈傷組織用滅菌蒸餾水漂洗後置於1.5ml離心管中，加入沒過愈傷組織的GUS染色液並混勻，使愈傷組織與染色液充分接觸；於37°C溫浴2小時或過夜；以70%的乙醇為脫色液對愈傷組織進行脫色並觀察藍色斑點。
[0164]⑶S組織化學染色結果表明，水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅動的⑶S基因的表達活性較CaMV35S驅動的⑶S表達活性高，如圖5所示。
[0165]以上實驗說明，水稻基因HTR711和HTR712啟動子的驅動活性較常用的組成型啟動子CaMV35S的活性高。
[0166]實施例4、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅動GFP基因瞬間表達分析[0167]在水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅動下，以綠色螢光蛋白(GFP)為報告基因，構建植物表達載體 pCambial300-pHTR711-GFP 和 pCambial300-pHTR712_GFP。
[0168]水稻基因HTR711和HTR712啟動子、CaMV35S序列分別插入到pCambial300表達載體的HindIII和BamHI酶切位點中(即位於GFP基因的上遊)。GFP元件插入到pCambial300的BamHI和SacI酶切位點。
[0169]將構建好的質粒轉化農桿菌EHA105，篩選陽性克隆。選擇三葉期的狐尾草(Green foxtail, Setaria viridis (L.)P.Beauv)為瞬間表達受體材料。挑取pCamb ial 300-pHTR711-GFP 和 pCambial300-pHTR712_GFP 陽性菌株 EHA105 的單克隆在280C，200rpm培養至OD600為0.8左右。取1.5ml菌液於1.5ml滅菌離心管中，4°C，2000rpm離心5分鐘，棄上清；向收集的菌體中加入1ml滅菌蒸餾水，重懸菌液，4°C，2000rpm離心5分鐘，棄上清。向收集的菌體中加入滅菌蒸餾水至0D_為0.8左右用於注射植物葉片。取較健康幼嫩的三葉期狐尾草葉片進行注射實驗，將注射葉片區域作好標記。兩天後取注射區域的葉片進行顯微觀察實驗。以去卷積螢光顯微鏡觀察pCamb ial 300-pHTR711-GFP和pCambial300-pHTR712-GFP質粒在狐尾草葉片中的表達狀況。取注射區域I~2cm2大小的葉片置於加有一滴蒸餾水的載玻片上，以放大倍數為60倍的水鏡鏡頭觀察GFP的表達情況。
[0170]如圖6，在水稻基因HTR711和HTR712啟動子的驅動下，GFP基因在狐尾草葉片細胞核內有強的表達。
[0171]實施例5、擬南芥基因HTR4以及水稻基因HTR711啟動子關鍵位點分析
[0172]對於PHTR4和pHTR711兩個啟動子，分別取長短不一的7個片段，以鑑定其關鍵位點。pHTR4和pHTR711兩個啟動子各自構建了 7個片段，見圖7和8。分別以擬南芥和水稻基因組為模板，以表1引物(注:應用正向引物為pHTR4-(l~7)-KpnI時，反向引物均是反向PHTR4-R-BamHI ;應用正向引物為PHTR711_(1~7)_HindIII時，反向引物均是反向PHTR711-R-BamHI)來擴增所述片段，以黃色螢光蛋白(YFP)為報告基因的植物表達載體，各自構建7個載體，引物序列見表1。
[0173]表1、7個擬南芥基因HTR4和7個水稻基因HTR711啟動子引物序列
[0174]
【權利要求】
1.分離的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸是: (1)SEQID N0:2所示的核苷酸序列的多核苷酸； (2)SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列的多核苷酸； (3)SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的多核苷酸； (4)SEQ ID NO: 34中(1-743)~1405位所示的核苷酸序列的多核苷酸； (5)SEQ ID NO: 35中(1-1076)~1369位所示的核苷酸序列的多核苷酸； (6)SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列的多核苷酸； (7)SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列的多核苷酸； (8)SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的多核苷酸； (9)SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的多核苷酸； (10)SEQID NO: 17所示的核苷酸序列的多核苷酸； (11)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列雜交且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸；或 (12)核苷酸序列與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列有80%以上相同性且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，(4)中，包括: SEQ ID NO: 34中第464-1405位(pHTR4_5 (942bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO: 34中第276-1405位(pHTR4_6 (1130bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或 SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列的多核苷酸。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，(5)中，包括: SEQ ID NO: 3中第201-521位(pHTR711_3 (521bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO:35中第624-1369位(pHTR711_4(746bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO: 35中第416-1369位(pHTR711_5 (954bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO: 35中第200-1369位(pHTR711_6 (1170bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或 SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列的多核苷酸。
4.權利要求1所述的多核苷酸的用途，用於作為啟動子元件。
5.如權利要求4所述的用途，其特徵在於，所述的啟動子元件用於指導目的基因強表達。
6.—種載體，其特徵在於，所述的載體含有權利要求1所述的多核苷酸，作為啟動子兀件。
7.如權利要求6所述的載體，其特徵在於，所述的載體還含有與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因。
8.如權利要求7所述的載體，其特徵在於，所述的目的基因位於所述多核苷酸的下遊。
9.如權利要求8所述的載體，其特徵在於，所述的目的基因位於所述多核苷酸的下遊，且與所述多核苷酸的間隔小於lOObp，更佳地小於50bp。
10.如權利要求8所述的載體，其特徵在於，所述的載體是真核表達載體。
11.如權利要求8所述的載體，其特徵在於，在所述多核苷酸的下遊包含多克隆位點或至少一個酶切位點。
12.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，所述的細胞: 含有權利要求6-11任一所述的載體；或 其基因組中整合有外源 的權利要求1所述的多核苷酸。
【文檔編號】C12N15/113GK104004761SQ201410066961
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2013年2月26日
【發明者】方玉達, 夏溪 申請人:中國科學院上海生命科學研究院