定量轉化生長因子－β1的方法以及通過使用該方法檢測癌症的方法

2023-09-19 09:41:55 1

專利名稱：定量轉化生長因子－β1的方法以及通過使用該方法檢測癌症的方法
技術領域：
本發明的領域本發明涉及一種定量一種體液中轉化生長因子-β1(TGF-β1)的濃度的方法，一種通過使用相同的方法檢測癌症的方法，一種檢測癌症的組合物，以及一種TGF-β1特異的單克隆抗體。
在哺乳動物中存在三種形式的TGF-β因子，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，並且，在這些當中，據信TGF-β1在生理機制和疾病進展中發揮關鍵的作用。已經報導它在一種發病過程中作用反常，例如，癌症發生。這暗示TGF-β1作為癌症診斷中的一種腫瘤標誌是有用的，並且一種定量一種體液中的TGF-β1的高精度的方法在癌症診斷中可能是決定性的。
歐洲專利公開第0 722 773 A1號(EP Publication No.0 722 773 A1)公開一種通過用一種吸附劑，OH-碳酸化的羥基磷灰石，接觸一種含有TGF-β1的血液樣品，從而吸附其中的TGF-β1，用一種緩衝液洗脫被吸附的TGF-β1，並用紫外分光光度法確定被洗脫的TGF-β1的量的檢測癌症的方法。然而，這個方法忍受著有限的敏感性和為測量值的大波動所證明的不精確的問題。
因此，已經存在一個開發一種改進的定量血漿中TGF-β1的量的方法的需要。
本發明的概述因此，本發明的一個目的是提供一種定量一種樣品中TGF-β1的量的具有高精度和敏感性的方法。
本發明的另一個目的是提供一種通過使用所說的方法檢測癌症的方法。
本發明的進一步的目的是提供一種檢測癌症的組合物。
本發明的又一個目的是提供一種TGF-β1特異的單克隆抗體和一種生產此單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
根據本發明的一個方面，提供了一種定量一種樣品中TGF-β1的量的方法，包括用一種TGF-β1特異的受體處理此樣品從而在TGF-β1與此受體之間形成一種複合物，並測量此複合物的量。
本發明的詳細描述在本發明中可以被使用的TGF-β1特異的受體包括TGF-β I型，II型，III型受體(R I，RII和RIII)，並優選TGF-β1 III型受體，RIII。這些TGF-β1受體可以根據一種常規的方法(Burand，J.P.等.病毒學(Virology)101，286-290(1980))通過在一種哺乳動物或昆蟲細胞系中表達一種TGF-β1受體基因而獲得。例如，此TGF-β1受體可以如下獲得用一種含有一種TGF-β1受體基因的重組杆狀病毒感染一種昆蟲細胞系，例如，Sf21(Invitrogen，Netherlands)；提取在此昆蟲細胞中表達的不溶於水的受體蛋白；用鹽酸胍或尿素溶解此不溶於水的受體蛋白；通過去除胍或尿素重新摺疊被溶解的受體蛋白，從而恢復對TGF-β1的親和力。
在本發明中可以使用的TGF-β1特異的抗體可以通過用TGF-β1或其中的一個部分免疫一種哺乳動物製備。此TGF-β1特異的抗體可以是僅對TGF-β1具有特異性的一種單克隆抗體或一種多克隆抗體。
一種定量一種體液，例如，血漿或尿中的TGF-β1的量的優選方法，根據本發明包括(a)將一種TGF-β1特異的受體結合到一種固體支持物上；(b)將一種體液樣品加入此被支持的受體中從而形成一種TGF-β1-受體複合物；(c)將一種與一種標記物結合的TGF-β1特異的抗體結合到此複合物上；和(d)使用此種作為一種檢測標記的標記物測量TGF-β1的量。
在本發明中可以被使用的代表性標記物包括辣根過氧化物酶，生物素和螢光。
本發明的第一個優選實施方案包括將TGF-β1受體結合到一種固體支持物上，例如，一塊微量滴定板的孔；將一種適當稀釋的含有TGF-β1的樣品加入到此TGF-β1受體中，從而使得TGF-β1與此TGF-β1受體之間能夠形成一種複合物；用一種磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌此支持物；向其中加入一種生色的酶聯抗-TGF-β1抗體並形成生色的酶；以及測量所產生的溶液的光密度從而定量此樣品中TGF-β1的含量。
在本發明的第二個優選實施方案中，一種含有一種TGF-β1特異的受體的液體可以被用於替換被支持的TGF-β1受體。在這個方法中，一種樣品中的TGF-β1的量可以如下定量將此樣品加入此含有TGF-β1特異的受體的液體中；加入一種TGF-β1特異的與其中一種標記物結合的抗體；沉澱一種抗體-TGF-β1受體複合物；並且測量其光密度。
本發明的方法能夠檢測在30 pg/ml或更低的一個非常低濃度範圍的TGF-β1。
以上方法在癌症診斷中特別有用，因為癌症患者體液中的TGF-β1濃度顯然不同於健康人的那個。因此，癌症可以通過重複以上方法從而定量患者體液樣品，例如血漿或尿中TGF-β1水平，並將此TGF-β1濃度與健康人的那個比較而被檢測。
本發明的檢測一種癌症的方法的一個優選實施方案包括(a)將一種TGF-β1特異的受體結合到一種固體支持物上；(b)將一種體液樣品加入此被支持的受體中從而形成此TGF-β1-受體複合物；(c)將一種TGF-β1特異的與一種標記物結合的抗體結合到此複合物上；(d)使用此種作為一種診斷標記物的標記物測量TGF-β1的量；和(e)將此TGF-β1量與健康人的那個比較。
以上方法在檢測胃癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，直腸結腸癌，前列腺癌和子宮頸癌中特別有效。
在此檢測一種癌症的方法中可以被使用的一種組合物包括一種TGF-β1受體，優選RIII，和一種TGF-β1特異的抗體。
為了改進敏感性，此單克隆抗體可以如下獲得根據一種常規的細胞融合方法，使用TGF-β1或其中的一種抗原決定簇部分作為一種免疫原，製備一種生產TGF-β1特異的單克隆抗體的雜交瘤細胞系；並從此雜交瘤細胞系分離此單克隆抗體。例如，這樣一種雜交瘤細胞系可以如下製備用人TGF-β1免疫一種小鼠；根據Kohler和Milstein(歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol.)，6，511-519(1976))所描述的細胞融合方法，將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合；通過使用ELISA選擇一種僅對人TGF-β1具有特異性的雜交瘤細胞系；使用一種免疫擴散的方法，確定此雜交瘤細胞系所產生的單克隆抗體的亞類；並且，選擇一種分泌IgG1亞類的具有最高抗體滴度的雜交瘤細胞系。這樣獲得的此雜交瘤細胞系被定名為hTGF-46，並根據關於因專利程序之微生物保藏物的國際識別的布達佩斯條約的條款(The Budapest Treaty on the International Recognition ofthe Deposit of Microorganism for the Purpose of Patent Procedure)在1998年4月20日保藏在韓國典型培養物保藏中心(Korean Collection for TypeCulture)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-600，Republic ofKorea)，其保藏號為KCTC 0460BP。
雜交瘤細胞系hTGF-46起源於β-淋巴瘤，並且在產生TGF-β1特異的IgG1亞類的抗體的同時連續地分裂。此雜交瘤細胞系可以在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養基(Gibco-BRL，USA)中在37℃在5％CO2的空氣中和100％溼度下培養。細胞數在12到14小時內倍增。此雜交瘤細胞系懸浮在此培養基中，自身不結合到培養瓶的底部，呈圓形，直徑為15到20μm。
為了用此雜交瘤細胞系生產大量的TGF-β1特異的單克隆抗體，將此雜交瘤細胞系注射到一種小鼠中，並當其腹腔膨脹時獲取含有高濃度的雜交瘤細胞的腹水從而分離來自其中的此單克隆抗體。
當TGF-β1，-β2，和-β3進行電泳隨後進行Western印跡時，本發明的此單克隆抗體僅識別TGF-β1，但是不識別TGF-β2或-β3。這暗示此單克隆抗體對TGF-β1有獨特的特異性。本發明的此單克隆抗體還對人TGF-β1顯示高親和力，並且結合到對應於TGF-β1的第5到80胺基酸殘基的表位區域。
計劃用以下的實施例進一步說明本發明，而不限制其範圍。
進一步地，以下給出的固體在液體中的混合物，液體在液體中混合物和固體在液體中的混合物的百分數分別基於wt/wt，vol/vol和wt/vol，除非另外明確說明。實施例1TGF-β1對受體的敏感性(步驟1)TGF-β1 III型受體的製備使用引物RIII和RIII2(SEQ ID Nos1和2)，用含有一個人TGF-β1 III型受體的全長cDNA的質粒pCEP4(Invitrogen，Netherlands)進行聚合酶鏈式反應(PCR)，從而獲得編碼包括400胺基酸殘基(1到400)的此受體的一個細胞外結構域的一個DNA片段。這樣獲得的DNA片段被插入杆狀病毒載體pCRBac(Invitrogen，Netherlands)，從而獲得重組質粒pCRBac-TGFR。用此重組質粒pCRBac-TGFR轉化了E.coli細胞，並在一種選擇培養基，含有氨苄青黴素的LB培養基上選擇了被轉化的E.coli細胞。
使用脂質體轉染法(Burand，J.P.，病毒學(Virology)，101，286-290(1980))，將載體pCRBac-TGFR和Bac-N-Blue DNA(Invitrogen，Netherlands)共同導入昆蟲細胞系Sf21(Invitrogen，Netherlands)中，並培養3天，從而獲得一種病毒產物。3天之後，用lacZ基因作為一種選擇性標記，對這樣獲得的病毒進行了噬斑分析，從而選擇此重組病毒。使用正向引物(SEQ ID NO3)和反向引物(SEQ ID NO4)，對這樣獲得的重組病毒進行了PCR，從而確認此TGF-β1受體基因的存在。野生杆狀病毒顯示了839 bp PCR產物，而此重組病毒給出了一個1.5 kbp PCR產物。
用此重組病毒感染昆蟲細胞系SF21，並在此後培養5天。離心此培養物，從而去除細胞碎片並收集含有病毒的上清。
用此上清接種昆蟲細胞系Sf21，並在此後在27℃在含有10％胎牛血清(FBS)，7.3％ TC yeastolate和73％乳清蛋白水解產物的Grace昆蟲培養基(Invitrogen，Netherlands)中培養72天。離心此培養物，從而收集細胞，並用PBS洗滌此細胞。向其中加入蛋白裂解溶液(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)，50 mM NaCl，10 mMβ-巰基乙醇，1％Triton X-100和2 mMBMSF)，並在此後在100℃加熱所產生的溶液10分鐘，從而製備一種樣品。
用此樣品在12.5％ SDS-聚丙烯醯胺凝膠中進行了SDS-PAGE，並用考馬斯亮藍對所產生的凝膠染色。如下對此凝膠進行了Western印跡將在凝膠上被分離的蛋白電轉移到一張膜上，從RD Systems Inc.，USA(美國研究與發展系統股份有限公司)獲得的TGF-β1受體的抗體結合此膜上的蛋白，並在此後使用結合了辣根過氧化物酶(HRP)的抗IgG第二抗體分析TGF-β1(Chemicon，USA)，從而確認TGF-β1 III型受體的表達。
因為此TGF-β1受體不溶解於水，所以向此樣品中加入8M鹽酸胍，並攪拌所產生的溶液1小時。所產生的溶液在7,000rpm離心40分鐘，並在此後將上清調整到2mg/ml蛋白濃度。為了恢復此TGF-β1受體結合TGF-β1的活性，將所產生的溶液加入一種摺疊緩衝液中(100mMTris，0.5M精氨酸，0.2M EDTA，pH8.0)，至蛋白濃度為150μg/ml，並在10℃保存40小時，所產生的溶液用20mM Tris溶液(pH8.0)，接連地按照每4小時兩次，過夜之後一次，並在此後每2小時兩次透析，從而有效地重新摺疊此TGF-β1受體。(步驟2)TGF-β1III型受體對TGF-β1的敏感性將在步驟1中獲得的每一份2μg的TGF-β1III型受體放置於一塊微量滴定板的孔中，並將所產生板子在環境溫度保存24小時，從而將此受體結合在此板上。將2ng的純化的TGF-β1(RD systems Inc.，USA)溶解在PBS中，並連續稀釋。將每一個稀釋溶液按100μl的量加入孔中，並在此後在環境溫度保存3小時，從而使此TGF-β1能夠結合此受體。用含有0.05％Tween 20(PBST)的PBS洗滌各孔，並在此後向其中加入結合HRP的抗-TGF-β1抗體(RD systems Inc.，USA)。將產生的板子在室溫保存1.5小時。用PBST洗滌每一個孔。向其中加入100μl的TMB-ELISA(Gibco-BRL，USA)，一種HRP底物，並將所產生的板子在室溫放置20分鐘從而顯色。通過加入25μl 2N硫酸終止了此顯色反應。在450nm的測量波長和570nm的校正波長測定了此反應混合物的光密度，並將結果繪製成圖，從而獲得一條標準的光密度-濃度相關曲線。


圖1說明這樣獲得的相關曲線是一條相關係數為0.999，斜率為0.28的直線。此斜率代表在這些測量中所使用的受體的敏感性，並且此TGF-β1III型受體被認為對TGF-β1結合具有良好的敏感性。在圖1中的相關曲線還說明本方法可以檢測極低濃度的TGF-β1，低至10pg/ml。
使用TGF-β1II型受體(RD systems Inc.，USA)重複了以上過程，從而確定TGF-β1II型受體的敏感性。這些結果也被繪製在圖1中，說明使用TGF-β1II型受體獲得的相關曲線也是一條相關係數為0.999，斜率為0.57的直線。因此，II型受體也可以被用於定量TGF-β1的濃度，但是其敏感性顯著地比III型受體的那個低。實施例2TGF-β1III型受體對TGF-β1的特異性除了使用含有2,000pg/ml TGF-β1，2,000pg/ml TGF-β2和2,000pg/ml TGF-β3(RD Systems Inc.，USA)的混合物替換了TGF-β1之外，重複了實施例1的步驟2的過程。使用2,000pg/ml TGF-β1作為一個對照，重複了實施例1的步驟2的過程。結果被顯示在表I中。
表I
正如從表I可以見到的一樣，TGF-β1III型受體僅與TGF-β1結合，不與TGF-β2或TGF-β3發生交叉反應。實施例3使用單克隆抗體測量癌症患者的血漿TGF-β1濃度從101個健康人，111胃癌患者，100個肝癌患者和151個乳腺癌患者獲得血液樣品。用含有0.081ml作為一種抗凝劑的15％乙二胺四乙酸(EDTA)的真空容器收集血液樣品，並在此後將所獲得的混合物在3,000rpm離心20分鐘，從而獲得一種血漿樣品。將0.1ml的此血漿樣品加到0.1ml的2.5N乙酸/10M尿素溶液中。將所產生的混合物在室溫保存10分鐘，並用0.1ml的含有1M乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的2.7N NaOH中和。用PBST4倍稀釋這樣獲得的被活化的血漿，從而獲得一種進行以下測量其TGF-β1濃度之過程的血漿樣品。
0.1ml的這樣獲得的血漿樣品溶液，以及0.1ml一份的TGF-β1標準溶液(0，100，1,000和2,000pg/ml)被分別地加入到一塊含有TGF-β1III型受體的96-孔板的孔中，在室溫保存3小時，並在此後，用PBST洗滌了3次。將純化的TGF-β1單克隆抗體-HRP複合物(Sigma)加入每一個孔，並在此後將此板在室溫保存1.5小時，此後用PBST洗滌這些孔3次。將100μl的TMB-ELISA(Gibco-BRL，USA)，一種HRP底物，加入每一個孔，並將此板在室溫保存20分鐘從而顯色。通過加入25μl的2N硫酸終止了此顯色反應。在450nm的測量波長和570nm的校正波長測定了此反應混合物的光密度。基於使用標準溶液獲得的校正曲線，確定了此血漿樣品的TGF-β1濃度，並將結果顯示於表II和圖2.
表II
正如在描述各患者組的血漿TGF-β1濃度分布模式的圖2中可以看見的一樣，癌症患者的血漿樣品呈現與健康人組的那個顯然不同的TGF-β1濃度模式。這暗示上述癌症可以根據以上過程通過測量血漿TGF-β1濃度被檢測。實施例4使用單克隆測量癌症患者的血漿TGF-β1濃度使用從288個健康人，29個肺癌患者，48個直腸-結腸癌患者，50個前列腺癌患者和88個子宮頸癌患者所獲得的血液樣品，重複了實施例3的過程，從而測量各血漿TGF-β1濃度，並將結果顯示在表III和圖3中。
表III
P＜0.01正如在說明各患者組的血漿TGF-β1濃度分布模式的圖3中可以看見的一樣，癌症患者的血漿樣品呈現與健康人組的那個顯然不同的TGF-β1濃度模式。這暗示上述癌症可以根據以上過程通過測量血漿TGF-β1濃度而被檢測。實施例5使用多克隆抗體測量癌症患者的血漿TGF-β1濃度除了使用了一種多克隆抗體代替此單克隆抗體以外，使用從50個健康人，50個肝癌患者，和50個乳腺癌患者所獲得的血液樣品，重複了實施例3的過程，從而測量各血漿TGF-β1濃度，並將結果顯示於表IV。
表IV
P＜0.05
正如在表IV中可以看見的一樣，癌症患者的血漿樣品呈現與健康人組的那個顯然不同的TGF-β1濃度模式。這暗示上述癌症可以根據以上過程通過測量血漿TGF-β1濃度而被檢測。實施例6生產一種TGF-β1單克隆抗體的雜交瘤細胞系的製備(步驟1)免疫小鼠將TGF-β1與等體積的弗氏完全佐劑混合，直至此混合物變成液體，並且所產生的混合物按100μl/小鼠的量，注射到一隻7周齡的Balb/c小鼠的尾靜脈。2周之後，將與弗氏不完全佐劑混合的與第一次注射中相同量的TGF-β1，注射到此小鼠的尾靜脈。在4到5天之後，從尾獲得小量血液，並通過ELISA確認了TGF-β1抗體的存在。此後，在下面的細胞融合過程之前3到4天，用溶解在0.85％PBS中的30μg的人TGF-β1靜脈注射。(步驟2)細胞融合在此細胞融合過程中使用骨髓瘤細胞SP2/0·Ag14(ATCC CRL 1581)作為一種母細胞。此母細胞在含有10％FBS的RPMI 1640培養基中培養，同時維持5×105/ml的最大細胞密度。
使用乙醚麻醉在步驟1中所獲得的被免疫的小鼠，並摘除其脾臟，從而用組織勻漿器勻漿。將所產生的勻漿懸浮在HBSS(Gibco-BRL，USA)中，並將所產生的懸浮液放置於一支15ml離心管中離心。重複此過程兩次，從而徹底地洗滌脾細胞。將此母細胞，SP2/0·Ag14細胞，懸浮在HBSS中並離心之。重複此過程兩次。脾細胞和SP2/0·Ag14分別被懸浮在10ml的HBSS中從而計數每一種懸浮液中的細胞數量。將從各懸浮液獲得的108個脾細胞和107個SP2/0·Ag14細胞在一支離心管中混合，此後離心，從而使細胞沉澱。用手指輕輕敲打此離心管從而分散被沉澱的細胞，並在此後，在37℃保存1分鐘。歷時1分鐘向其中加入1ml的含有45％PEG(w/v)和5％DMSO的HBSS，此後搖動此管1分鐘。歷時3分鐘向其中加入9ml的RPMI培養基，並在此後向其中加入RPMI培養基直至細胞懸浮液的總體積變成50ml，同時搖動此管。將所產生的懸浮液離心，並將這樣獲得的細胞沉澱按1-2×105/ml的濃度重新懸浮在HAT培養基(Gibco-BRL，USA)中。將0.2ml一份的所產生的懸浮液置於一塊96-孔微量滴定板的孔中，並在此後在培養箱中培養了數天，條件維持在37℃，5％CO2和100％溼度。(步驟3)生產單克隆抗體的雜交瘤細胞系的選擇如同下面所描述的一樣，使用人TGF-β1抗原對在步驟2中獲得的雜交瘤細胞系進行了ELISA，從而獲得特異性地與TGF-β1反應的細胞。
將人TGF-β1抗原按50μl(2μg/ml)/孔的量加入一塊微量滴定板的孔中，並在室溫保存12小時，從而將抗原結合到孔的表面上。用PBST洗滌了這些孔，從而去除沒有結合的抗原。
將在步驟2中獲得的此雜交瘤細胞培養物按50μl/細胞的量加入每一個孔中，並在37℃保存1小時。用PBST洗滌這些孔，從而去除此培養物。向其中加入羊抗鼠IgG-HRP(Sigma，USA)，在室溫保存1小時，並用PBST洗滌。向其中加入100μl的底物溶液(OPD，Sigma)，在室溫保存20分鐘，並在492nm測量了所產生的反應混合液的光密度。
最先選擇了分泌針對人TGF-β1抗原的具有高特異性的抗體的雜交瘤細胞系，並使用人TGF-β1，-β2和-β3對這些雜交瘤細胞系中的每一種都進行了ELISA，從而篩選僅對人TGF-β1抗原具有特異性的雜交瘤細胞。對這樣獲得的雜交瘤細胞中的每一種進行了有限稀釋，從而獲得7個產生一種單克隆抗體的雜交瘤細胞系克隆，hTGF-7，-8，-31，-46，-70，-119和-207。每一個克隆都被冷凍乾燥。
離心雜交瘤細胞培養物，並將上清進行ELISA，從而確定此抗體滴度，並在此後用免疫分型試劑盒(immunotype kit)(Sigma，USA)分析，從而確定此抗體的亞類。將結果顯示於表V。
表V
正如表V中可以看見的一樣，全部7個克隆都是IgG1。
在這7個克隆當中，選擇了具有最高滴度的克隆，hTGF-46，並腹膜內注射給一隻小鼠。此後，收集其腹水，並進行了Western印跡。結果說明此雜交瘤細胞系克隆hTGF-46分泌一種對人TGF-β1具有高特異性的單克隆抗體。根據關於因專利程序之微生物保藏物的國際識別的布達佩斯條約的條款，在1998年4月20日將此雜交瘤細胞系hTGF-46保藏在韓國典型培養物保藏中心(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon305-600，Republic of Korea)，其保藏號為KCTC 0460BP。實施例7TGF-β1的單克隆抗體的生產為了使用在實施例6中獲得的雜交瘤細胞系生產TGF-β1的單克隆抗體，給Balb/c小鼠腹膜內注射了0.5ml的降植烷，並在1周之後，給每一隻小鼠注射了5×106個雜交瘤細胞。從具有膨脹的腹腔的小鼠獲取含有高濃度的雜交瘤細胞的腹水，並在10,000rpm離心，從而去除此雜交瘤細胞。上清被保存在-20℃。
柱子用蛋白G珠子填充，並在此後用1×PBS洗滌了4次。將2ml的上清按5滴/分鐘的速率一滴一滴地上樣到此柱子上，並將0.1M甘氨酸-鹽酸溶液按1滴/10分鐘的速率引進此柱子從而洗脫IgG。
HRP在含有1.25％戊二醛0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.5)中被活化，並將被活化的HRP對碳酸鹽緩衝液(pH9.2)透析。將被透析的HRP與此IgG反應，從而獲得一種結合了HRP的IgG。在此反應完成之後，通過在280nm和403nm測量此反應混合液的光密度確定了RZ值(A403/A280)。為了確定酶聯抗體的活性，用1μg的TGF-β1包被了一塊微量滴定板的每一個孔，並在此後與此結合了HRP的IgG反應，從而確定活性。進一步地，對此結合了HRP的抗體進行了Western印跡，從而確定其活性。
在10％SDS-聚丙烯醯胺凝膠上對人TGF-β1，-β2和-β3蛋白進行了SDS-PAGE，並在此後將其電轉移到一張硝酸纖維素濾膜上。將此膜與此單克隆抗體反應數小時。所產生的膜在室溫用牛血清白蛋白處理12到14小時，從而封閉這些蛋白的非特異反應。用含有0.5％Tween 20的PBS洗滌此膜3次，並在此後與結合了HRP的抗小鼠IgG(Sigma，USA)在室溫反應。用含有0.5％Tween 20的PBS洗滌此膜3次，此後，向此膜加入一種底物緩衝液(TMB，Gibco-BRL，USA)從而顯色。
結果說明了本發明的此單克隆抗體僅與人TGF-β1反應，並且不與人TGF-β2和-β3反應。因此，本單克隆僅對人的TGF-β1具有特異性。
儘管關於以上特定實施例，本發明已經被描述了，應該承認本領域中的熟練人員可以對本發明進行各種修飾和改變並仍然在被附加的權利要求書所規定的範圍中。
微生物國際保藏證明(譯文)
序列表110韓美藥品工業株式會社120定量轉化生長因子-β1的方法以及通過使用該方法檢測癌症的方法130PCA00418/HMY150KR 1999-125681511999-04-09150KR 1999-439351511999-10-121604170PatentIn version 3.1210121118212DNA213人工序列220223Primer RIII14001atggcagtga catcccac18210221112212DNA213人工序列220223Primer RIII24002atttgggctt cc 12210321124212DNA213人工序列220223正向引物4003tttactgttt tcgtaacagt tttg24210421121212DNA213人工序列220223反向引物4004caacaacgca cagaatctag c 2權利要求
1.一種定量樣品中TGF-β1的量的方法，包括用一種TGF-β1特異的受體處理樣品從而在TGF-β1與此受體之間形成一種複合物，並測定此複合物的量。
2.權利要求1的方法，包括(a)將TGF-β1特異的受體結合到一種固體支持物上；(b)將此樣品加入此被支持的受體從而形成TGF-β1-受體複合物；(c)將一種結合了一種標記物的TGF-β1特異的抗體結合到此複合物上；和(d)使用該標記物作為檢測標記測定TGF-β1的量。
3.權利要求1或2的方法，其中TGF-β1特異的受體是TGF-β1 III型受體。
4.權利要求2的方法，其中TGF-β1特異的抗體是一種通過用TGF-β1或其中的一個部分免疫一種哺乳動物所製備的抗體。
5.權利要求4的方法，其中此抗體是一種單克隆抗體或多克隆抗體抗體。
6.權利要求5的方法，其中此單克隆抗體是用一種雜交瘤細胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)生產的。
7.權利要求1或2的方法，其中在此樣品中TGF-β1的濃度是30pg/ml或更低。
8.權利要求2的方法，其中此標記物是辣根過氧化物酶，生物素或螢光。
9.一種在患者中檢測癌症的方法，包括用TGF-β1特異的受體處理取自患者的體液樣品從而在此受體與存在於此樣品中的TGF-β1之間形成複合物；測量此複合物的量從而定量此樣品中的TGF-β1的濃度；並且將此TGF-β1濃度與健康人的進行比較。
10.權利要求9的方法，包括(a)將TGF-β1特異的受體結合到一種固體支持物上；(b)將此樣品加入此被支持的受體從而形成TGF-β1-受體複合物；(c)將一種結合了一種標記物的TGF-β1特異的抗體結合到此複合物上；(d)使用該標記物作為檢測標記測定TGF-β1的量，從而確定此樣品中TGF-β1的濃度；和(e)將此TGF-β1濃度與健康人的比較。
11.權利要求9或10的方法，其中此TGF-β1特異的受體是TGF-β1 III型受體。
12.權利要求10的方法，其中此TGF-β1特異的抗體是一種通過用TGF-β1或其中的一個部分免疫一種哺乳動物所製備的抗體。
13.權利要求13的方法，其中此抗體是一種單克隆抗體或一種多克隆抗體。
14.權利要求13的方法，其中此單克隆抗體是用一種雜交瘤細胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)生產的。
15.權利要求9或10的方法，其中此樣品中的TGF-β1的濃度是30pg/ml或更低。
16.權利要求10的方法，其中此標記物是辣根過氧化物酶，生物素或螢光。
17.權利要求9或10的方法，其中此癌選自胃癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，直腸結腸癌，前列腺癌和子宮頸癌。
18.權利要求9或10的方法，其中此體液是血漿或尿。
19.一種檢測癌的組合物，包括一種TGF-β1特異的受體和一種TGF-β1特異的抗體的。
20.權利要求19的組合物，其中此TGF-β1特異的受體是TGF-β1III型受體。
21.一種雜交瘤細胞系，它是產生人TGF-β1特異的單克隆抗體的hTGF-46(KCTC 0460)。
22.一種由雜交瘤細胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)產生的TGF-β1特異的單克隆抗體。
全文摘要
通過用一種TGF－β1特異的受體處理樣品從而在TGF－β1與此受體之間形成複合物並測量此複合物的量而定量一種樣品中的TGF－β1的量。
文檔編號C07K16/22GK1355882SQ00806081
公開日2002年6月26日 申請日期2000年4月10日 優先權日1999年4月9日
發明者陳承嫄, 申勳, 林昌基 申請人:韓美藥品工業株式會社