製備抗獨特型抗體的方法

2023-09-19 09:52:45 4

專利名稱：：製備抗獨特型抗體的方法製備抗獨特型抗體的方法單克隆抗體(MAb)治療在癌症、自身免疫疾病、移植排斥和其他病症治療中的應用在最近幾年日益廣泛。特別是分子工程技術可將鼠類MAb轉變為人源化或完全的人類分子，由此在患者治療中減少針對該治療劑的不良免疫反應(人抗人抗體-HAHA)。因此，用治療性MAb的成功治療事件顯著增加，這主要是因為治療性MAb減少或消除了免疫原性，增加了血清半衰期，並且提高了效應子功能。在這種情況下，開發出易於從所治療患者血清中的內源IgG分子庫中鑑別出治療性免疫球蛋白(IgG)的合適分析方法顯得極為關鍵。因此，需要對臨床給予治療性MAb進行藥物代謝動力學分析、藥物動力學分析、生物分布分析以及免疫應答誘導分析的工具。抗獨特型抗體(抗-ID抗體)特異性結合其他抗體的可變區，因此可用於在藥物代謝動力學研究中檢測治療性MAb，並且在治療個體中有助於定量人抗人抗體(HAHA)反應。目前，這類抗獨特性抗體是通過用目的治療性抗體免疫實驗動物，然後對獨特型結合MAb的存在進行篩選而製備的。遺憾地是，治療性MAb在實驗動物中引發的免疫應答主要針對人抗體Fc部分，由此抗獨特型抗體稀少且難以獲得。而且，通過多克隆血清的親和純化方法從動物產生抗獨特型抗體有許多不足，例如高百分比非獨特型結合抗體、對正常免疫球蛋白低產量免疫吸附，以及每批製備物質量存在差異。因此，本發明提供了轉基因非人動物在製備目的抗體的抗獨特型抗體中的應用，其中該非人動物為外源抗體轉基因動物，其中該目的抗體與該外源抗體具有相同同種型。這類外源抗體轉基因動物表現出對與該外源抗體所有相同的同種型抗體Fc部分的耐受性，由此允許對該外源抗體相同同種型抗體的可變區進行免疫應答，從而產生不同的獨特型抗體。EP05105946.7中已記載外源抗體非人轉基因動物。然而，其沒有公開本文中記載的應用。具體地，本發明提供了一種製備抗獨特型抗體的方法，其包括a)產生外源抗體的轉基因非人動物，b)利用該轉基因非人動物誘導針對目的抗體的免疫應答，目的抗體藉此與外源抗體具有相同種類的特異性同種型，以及e)由此產生直接針對目的抗體獨特型部分的抗體。優選地，該方法進一步包括另一步驟d)分離該抗獨特型抗體。分離抗體的方法，特別是分離來自體液(例如血液)的抗體的方法為本領域已知。更優選地，純化抗獨特型抗體。合適的純化方法是本領域技術人員已知的。本文所用的術語"外源抗體"是指含有源自來源生物(例如人類)恆定區的抗體，將該抗體的編碼DNA導入宿主生物(例如小鼠)，由此該宿主生物表達該抗體。來源生物與宿主生物不屬於林奈分類系統同一物種。物種為一組實質或潛在的遠交種群(interbreedingpopulation)。外源抗體可以為治療性抗體。優選地，外源抗體為人類、人源化或嵌合抗體，其中至少嵌合抗體恆定區為人源的。更優選地，外源抗體為免疫球蛋白G(IgG)。進一步優選地，抗體為抗人澱粉狀蛋白p肽或其變體的抗體。最優選，抗體為抗A卩IgGl。抗ApigGl在專利申請WO03/070760中有詳細記載，其內容在此整體併入作為參考。本文所用的術語"變體"或"抗體變體"是指結構特性、製備方法、配製或存儲條件與標準抗體不同的抗體。結構變體可包括一級蛋白質結構、二級蛋白質結構和三級蛋白質結構改變(即構象改變)，糖基化改變以及胺基酸化學修飾的改變。進一步地，結構變體為改變的結構域間構建體(VL/VL，VH/VH)、二聚體、寡聚體以及較大的聚集體。本文所用的術語"目的抗體"是指其恆定區與外源抗體恆定區屬於相同同種型的抗體。抗體為"Y"形分子，其由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。重鏈與輕鏈都有不同的型和亞型。每重鏈和每輕鏈都有恆定區和可變區，其中重鏈恆定區體積較大。術語"恆定區"或"C區"是指這樣的抗體分子區，該區域與相同物種生物產生的不同特異性抗體的相應區域幾乎完全相同。恆定區在相同種類抗體(同種型)中恆定，其負責特定免疫球蛋白亞類的效應子功能。Fc片段是指木瓜蛋白酶裂解抗體所產生的抗體片段，其包括大部分的恆定區。本文所用的術語"可變區"是指抗體分子結合特異性抗原的區域。它由重鏈和輕鏈的抗原結合位點組成。可變區在不同B細胞免疫球蛋白之間是不同的，但是在同一B細胞所產生的所有免疫球蛋白之間是相同的。可變區通過B細胞成熟期間發生的基因重組過程由體細胞產生。該過程為重排過程，該重排過程產生大量可結合任意給定抗原的多樣性，由此能使免疫系統識別並中和外源和病原結構所導致的大量抗原負載(antigenicburden)。因此，抗體庫由具有不同V區的豐富免疫球蛋白所組成，但該免疫球蛋白具有相同的Fc部分。術語"結合抗原片段"或"Fab片段"為含有可變抗原結合區的抗體片段，其通過木瓜蛋白酶裂解抗體產生。本文所用的術語"獨特型區，，是指每類抗體特異的抗體可變區部分。本文所用的術語"抗獨特型抗體"是指結合另一抗體獨特型區的抗體。本文所用的術語"免疫應答"是指免疫系統對出現的抗原的反應。其涉及能結合抗原的抗體的產生。術語"同種型"是指抗原決定區，其區別在於重鏈的類和亞類、輕鏈的型和亞型。不同同種型抗體不僅可變區不同，而且恆定區也不同。因此例如，同物種IgG和IgM抗體屬於不同同種型。導入另一物種的某物種抗體將優選^"導主要針對同種型免疫原性區域(同種型決定區)的抗異種抗體的產生。本發明的優選實施方案是製備抗人治療性抗體的抗獨特型抗體的方法，其包括a)產生人IgG抗體的轉基因非人動物；b)在該轉基因動物中誘導針對該治療性抗體的免疫應答，以及c)產生對該治療性抗體獨特型區特異的抗獨特型抗體。優選地，該方法進一步包括另一步驟d)分離抗獨特型抗體。轉基因非人動物可為任何非人動物。優選的非人動物為哺乳動物。更優選地，非人動物為嚙齒類，如小鼠或大鼠。產生轉基因非人動物的方法是本領域眾所周知的。合適的方法在HoganB.，BeddingtonR.，CostantiniF.&LacyE.Manipulatingthemouseembryo.Alaboratorymanual.第2版(1994).ColdSpringHarborLaboratoryPress中有記載。製備表達外源抗體的非人轉基因動物的優選方法包括a)將包含編碼外源抗體的DNA的基因構建體導入非人受精卵或非人胚胎幹細胞，b)從該受精卵或胚胎幹細胞構建轉基因非人動物，從而c)產生表達外源抗體的轉基因非人動物。例如，轉基因動物可通過下列步驟產生將上述DNA構建體注射至受精卵前核，轉移該已注射的受精卵至假孕代孕母體，將卵母細胞所產生起始動物伺養至野生型動物，檢測這些飼養動物後代是否存在合成的DNA轉基因構建體，飼養半合子動物，任選構建純合轉基因動物。備選地，轉基因動物可通過下列方法構建將上述基因構建體導入胚胎幹細胞，然後篩選基因組中存在轉基因的胚胎幹細胞克隆，確認轉化的胚胎幹細胞克隆存在轉基因，將確認的重組胚胎幹細胞注射至野生型動物胚泡，將這些注射的胚泡轉移至假孕代孕母體，祠養胚泡所產生的嵌合體至野生型，檢測該飼養動物後代是否存在轉基因，祠養半合子動物，任選構建純合轉基因動物。本發明中所用的非人轉基因動物也可為上述方法之一所產生的非人轉基因動物子代。子代可從飼養該非人轉基因動物獲得，其中該子代保留了該轉基因動物的相同表現型。受精卵或胚胎幹細胞可來自任何非人動物。優選地，受精卵或胚胎幹細胞來自嚙齒類。更優選地，受精卵或胚胎幹細胞來自小鼠。為了構建轉基因小鼠，受精卵或胚胎幹細胞包括但不限於來自C57BL/6J、CBA/、BALB/c、DBA/2和SV129受精卵或胚胎幹細胞(Seong，E等人(2004)TrendsGenet.20,59-62;Wolfer，D.P.等人，TrendsNeurosci.25(2002):336-340)。轉基因非人動物中抗體的表達可以是組成型或誘導型。優選地，抗體表達為組成型。可通過下列方法誘導動物針對抗體的免疫應答，例如包括將該抗原皮下、靜脈、損傷區、肌內或腹膜內(i.p.)注射或將該抗原口服給藥(p.o.)。為了處理轉基因非人動物，目的抗體可稀釋或乳化於適於給予轉基因非人動物的藥學上可接受的載體。載體可為液體載體。合適的載體是本領域技術人員公知的，例如，鹽溶液。優選地，載體為復水凝膠(Rehydrage)國HPAo分離所產生的抗獨特型抗體的方法是本領域技術人員公知的。優選的方法包括a)從免疫外源抗體轉基因非人動物獲取血液樣品，b)製備血清，例如通過凝固，和c)分離和純化抗獨特型抗體，通過層析法，例如親和層析、離子交換層析和/或分子大小排阻層析。本文記載的非人轉基因動物也可用於製備針對目的抗體的抗獨特型單克隆抗體。製備單克隆抗體的方法是本領域技術人員周知的。該方法例如可為下列方法，其包括a)分離外源抗體轉基因非人動物的脾細胞，b)製備骨髓瘤細胞，和c)將該脾細胞與該骨髓瘤細胞融合。由此產生的雜交瘤細胞可產生單克隆抗獨特型抗體。表達外源抗體的轉基因動物獲得對該特定抗體的免疫耐受性。給定的轉基因抗體，例如人抗ApigGl，可傳遞對相同同種型所有抗體Fc部分的耐受性，因而允許針對其他抗體V區的免疫應答。本發明方法可用於製備特異性識別治療性抗體的抗體。這類抗獨特型抗體在藥物動力學研究中，以及在用相應治療性單克隆抗體治療個體的臨床人抗人抗體(HAHA)反應研究中相當有用。此外，如上所述轉基因小鼠所產生的抗獨特型抗體可模擬抗原決定區，因此可作為替代抗原用於診斷目的，例如在抗原4吏用,皮限制的情況下應用。該應用包括竟爭性免疫分析或直接血清學分析。用"內影"抗獨特型抗體替代傳統抗原的優點包括易於製備、在抗原有毒或因其他原因有危險情況下可安全使用、易於純化、標記連接方法成熟、以及可能連接至固相而沒有免疫反應損失。多種自身免疫疾病特徵在於存在自身抗體。在確定自身抗體具有的獨特型之後，上述轉基因小鼠可用於製備抗獨特型抗體，以診斷抗體介導的和自身抗體相關的自身免疫疾病。已證明在諸如重症肌無力、橋本甲狀腺炎、類風溼性關節炎以及系統性紅斑狼瘡的疾病中出現特異性ID表達升高(IsenbergDA,WilliamsW，AxfordJ，等人，"ComparisonofAnti-DNAAntibodyIdiotypesinHumanSera,"JAutoimmunity,3:393-414，1990)。用作替代抗原以診斷人類傳染病是抗獨特型抗體的另一有用應用。現在本發明中概括記載的內容結合特定實施例和下列附圖將能更容易理解，該實施例包含在本文中只是為了說明本發明，而不期望對本發明構成任何限制，除非本文另有說明。附圖l顯示了本方法的示意圖。用例如單複製人IgG抗體免疫的野生型小鼠將產生主要針對該單克隆抗體同種型部分的抗體。這些抗體可交叉識別所有人IgG。用例如單複製人IgG抗體免疫的單複製人IgG抗體轉基因小鼠產生主要針對免疫IgG可變區(抗體獨特型部分)的抗體，由此降低與其他人IgG的交叉識別。1)=免疫；2)=免疫應答；A)=單複製人IgG抗體；8)=野生型小鼠，C)=所產生的主要針對單克隆抗體(A)同種型部分的抗體，CI)=所產生抗體(C)的識別位點位於單複製人抗體(A)的同種型部分；D)=單複製人IgG抗體(A)轉基因小鼠；E)=所產生主要針對單克隆抗體(A)獨特型部分的抗體，El)=所產生抗體(E)的識別位點位於單複製人抗體(A)的獨特型部分。圖2顯示了克隆至表達載體pHSE3，用於轉基因表達的人AP特異性人Igyl基因的編碼序列。PCR擴增所用引物位置和名稱顯示在相應序列上方或下方。前導序列以斜體顯示。終止密碼子以粗體顯示。圖3顯示了克隆至表達載體pHSE3，用於轉基因表達的人A卩特異性人IgK基因的編碼序列。PCR擴增所用引物位置和名稱顯示在相應序列上方或下方。前導序列以斜體顯示。終止密碼子以粗體顯示。圖4顯示了抗A卩IgGl(-Mab-ll)轉基因小鼠的血清分析示意圖。對人K輕鏈和人y重鏈進行特異性的夾心ELISA檢測。MS:鼠血清、hlgGl:重組人免疫球蛋白yl同種型、F2F:起始小鼠2F、Neg:PCR陰性同步(littermate)對照、Tg5M+:轉基因小鼠5M+、Tg7M+:轉基因小鼠7M+。轉基因小鼠表達同一分子的兩條抗體鏈。圖5顯示了分子大小排阻層析圖鐠A)分子量標準、B)Mab-ll安慰劑、C)Mab-ll。沒有檢測到聚集體或片段。裝置、工作條件和方法記載在實施例3中。圖6顯示了離子交換層析圖語Mab-ll安慰劑(左邊)，Mab-ll(右邊)。裝置、工作條件和方法記載在實施例3中。圖7顯示了Mab-ll和還原性/羧甲基化Mab-ll(RAMab-ll)在2-4%Bis-Tris凝膠上、非還原條件(A)和還原條件(B)下SDS-PAGE分析的示意圖。染色用考馬斯亮藍染料。M:標準參照物、泳道1-3:Mab-ll、泳道4-7:RA畫Mab國ll。圖8顯示了還原性/烷基化Mab-ll(RAMab-ll)LC/MS分析示意圖。A)HPLC層析鐠(C8RP-HPLC，UV-示蹤，214nm)，峰代表輕鏈和重鏈；B)去疊加質^脊；C)B)中高分子量(HMW)質i普峰放大區。所檢測質量顯示在表3中。圖9顯示了如實施例5中所記載製備和分離的全長抗體、純化Fab和Fc片段的SDS-PAGE圖。左邊數字表示分子量標準參照物條帶的位置(單位kDa)。用考馬斯亮藍染料染色。SDS-PAGE在非還原條件下進行。M:分子量標準參照物、1:Humira，全長抗體、2:Humira,Fab國片段、3:Humira，Fc片段、4:Synagis，全長抗體、5:Synagis，Fab國片段、6:Synagis，Fc片段、7:Mab國ll，全長抗體、8:Mab國ll，Fab-片段、9:Mab-ll，Fc片段。將抗體和片段稀釋於MES緩衝液，每種樣品上樣量為2嗎。圖10顯示了第0天用Mab-ll免疫的野生型(WT)和Mab-ll轉基因(TG)動物血清中第7天、12天、21天和35天的抗Mab-ll反應的ELISA示意圖。該圖分別顯示了5WT和5TG小鼠免疫的平均值。該結果以免疫前血清O.D.的倍數表示。圖11顯示了(A)野生型小鼠和(B)Mab-ll轉基因小鼠血清抗Humira反應的ELISA示意圖，該圖以免疫前血清O.D.的倍數表示。5隻野生型(WT)和5隻轉基因(TG)小鼠在第0天用Humira免疫。在第7天、12天和21天檢測抗Humira抗體滴度。圖12顯示了用Humira免疫21天後，5隻野生型小鼠血清庫中Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段血清反應性的ELISA示意圖。結合以對照(免疫前的野生型)血清O.D.的倍數表示。圖13顯示了用Humira免疫21天後，5隻Mab-ll轉基因小鼠血清庫中Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段血清反應性的ELISA示意圖。結合(免疫前的野生型)以對照血清O.D.的倍數表示。實施例實施例中所涉及市售試劑按製造商使用說明使用，除非另有說明。實施例l:產生人免疫球蛋白轉基因小鼠構建Mab-ll構建體使用免疫球蛋白(Ig)重鏈(H)同種型編碼cDNA(SEQ.ID.NO:l)和人A卩肽特異性輕鏈(L)同種型k編碼cDNA(SED.ID.NO:2)[Bardroff,M.e.a.，Anti-amyloidbetaantibodiesandtheiruse.EP03001759EP，2003。該抗ApIgGl抗體也稱為Mab-ll。用表1中的引物在PCR反應中擴增cDNA。5'引物含有Sall(或相容的Xhol)位點，3，引物含有BamHI(或相容的BglII)位點，其可定向插入pHSE3"載體[Pircher，H.，等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3》第719-27頁。PCR擴增的cDNA先用兩種限制酶Sail和BamHI酶切，然後將其分別插入載體pHSE3，的相應位點。IgcDNA在pHSE3，中表達由鼠MHCI類基因H-2k的啟動子驅動，並由位於克隆基因3，端的鼠IgH基因增強子增強[Pircher，H.，等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3》第719-27頁。該表達載體可確保在轉基因小鼠T和B'淋巴細胞中高水平產生相應插入基因產物([Pircher，H"等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3):笫719-27頁]，結果未公布)。然後將包含(從5，至3，)H-2k啟動子、插入的cDNA、poly-A、剪接位點以及IgH基因增強元件的全長表達框用限制酶Xhol從載體剪切，並瓊脂凝膠純化，製成合適濃度，以微注射受精的小鼠卵母細月包(2ng/ml於10mMTrisHCl/0.1mMEDTA，pH7)。cDNA的編碼能力可通過抗ApIgH和L基因的全長編碼cDNA的測序進行確認(參見圖2和3)。引物名稱序列限制位點(粗體)SEQ.IDGl,llSalfor(5，刷5，-ACGTGTCGACGCCGCCACCATGAAACACCTG-3'Sail(GTCGAC)3Gl.llBamreV(3，鵬5，國ACGTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAG-3'Bamffl(GGATCC)4K.llXhofor(5，IgL)5，-ACGTCTCGAGGCCGCCACCATGGTGTTGCAG-3"XholCCTCGAG)K.llBglrev(3,IgL)5，-ACGTAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG國3'BglII(AGATCT)6表l:克隆引物的序列。產生抗ApIgGl轉基因小鼠用1:1混合的純化IgH和L基因(上述部分記載的)編碼Xhol片段對C57BL/6雌性供體受精卵母細胞進行微注射以獲得雙轉基因動物。用特異性引物擴增尾部活組織檢查製備的基因組DNA，以從這些微注射胚胎所產生的幼仔中篩選轉基因的存在。所用引物示於表2中。tableseeoriginaldocumentpage12表2:檢測轉基因的引物序列。用1pl(約100ng)尾活組織檢查總DNA進行PCR反應，PCR反應在下列條件下進行卯。C1分鐘，30x[94'C10秒；64tl30秒；72'C90秒，72C7分鐘。約660bpPCR擴增DNA片段，最後在1.5%瓊脂凝膠中可見，其分別對應於轉基因IgH基因和轉基因IgL基因。實施例2:轉基因小鼠的表現型特徵血清分析尾靜脈穿刺Wi。室溫過夜凝固。500xg離心IO分鐘分離血清，20'C冷凍至下一步分析。為確定轉基因小鼠是否表達全長人抗體，建立ELISA系統。用多克隆山羊抗人k鏈特異性抗體(SigmaK3502)俘獲人抗體。用偶聯過氧化物酶的單克隆小鼠抗人Y鏈特異性抗體(POD,SigmaA0170)進行檢測。如圖4所示，轉基因鼠表達全長人免疫球蛋白。用人IgGl抗體HUMIRA(Abbott)免疫分析抗近緣抗原的反應。10jigHUMIRA用200jil復水凝膠HPA(Reheis)乳化。第0天腹膜(i.p.)免疫動物，第7天、12天、21天和35天尾靜脈穿刺^U6l,製備血清，ELISA分析抗HUMIRA滴度，該ELISA用HUMIRA包被maxisorp平板(Nunc)俘獲抗HUMIRA抗體並用小鼠抗IgG(BDPharmigen)檢測該抗體。如圖11所示，野生型和轉基因小鼠都顯示出抗近緣人IgGl抗體HUMIRA的反應。實施例3:Mab-ll(也稱為抗A卩IgGl)的製備、純化和表徵用實施例1該轉基因相同序列IgGl的編碼cDNA轉染的中國倉鼠卵巢細胞在無血清條件下產生Mab-ll。Mab-ll從培養上清液的分離和純化所有步驟僅用鋼化玻璃器皿在無內毒素條件下進行，包括柱在內的所有裝置用0.5MNaOH進行滅菌處理，無菌過濾(0.22)所有緩衝液。僅使用新鮮的凝膠材料。作為第一個純化步驟，用MabSelect凝膠(Amersham)進行A蛋白親和層析。預電泳之後，將柱用25mMTris/HCl、25mMNaCl、5mMEDTA，pH7.1平衡，並將CHO細胞培養物的濾過上清液上樣至凝膠。用100mMHAc,pH2.9洗脫A蛋白結合的抗體。為滅活病毒，用HAc調整洗脫液至pH^3.6，然後室溫下溫育15分鐘，然後用1MTris調整pH至pH4.0。作為第二個純化步驟，用SP-Toyopearl650M(Tosoh)為基質進行離子交換層析(陽離子交換層析)。預電泳後，將步驟1的洗脫級分上樣至凝膠，用緩衝液A平衡(50mMHAc，pH5.0)，然後用0-100%緩衝液B(50mMHAc，1MNaCl，pH5.0)梯度洗脫。收集洗脫的蛋白質級分，超濾濃縮，並調整至pH7.5,用IEX和SECHPLC進行分析。作為第三個純化步驟，用Q-SepharoseFF凝膠(Biorad)作為固定相，用25mMTris/HCl、80mM乙酸鈉，pH7.5作為流動相，進行分子大小排阻層析(流通陰離子交換層析)。按UV信號分離流出級分。緩衝液至Mab-ll安慰劑(不含Mab-ll的緩衝液)的轉換以及濃度調整用10kDa膜在Amicon攪拌杯(Amicon)中進行，其中該Mab-ll安慰劑含有20mM組氨l140mMNaCl，pH5.5。最後，將溶液用0.22jimMillex-GV無菌濾膜(Millipore)過濾，於-80'C等份儲藏。抗ApIgGl(Mab-ll)的表徵用SDS-PAGE、大小排阻層析、離子交換層析檢測所純化Mab-llIgGl蛋白的完整性和異質性，用下述還原性和羧甲基化Mab-ll抗體的LC/MS分析進行一級序列的確認。大小排阻層析用JascoPU-980HPLC系統的大小排阻層析分析純化的Mab-ll樣品。在以0.2MK2HP04、0.25MKC1，pH7.0作為流動相的TSK-GelG3000SWXL，7.8x300mm，5jim柱(ToshoBiosciences)中進行樣品層析。流速i更置為0.5ml/分鐘。用與Merck-HitachiD-2500記錄系統相連的JascoUV-975檢測儀在220nm處監測吸光度。平衡柱直至獲得穩定基線。按凝膠過濾標準物(BioRad，151-1卯1，包括670kD牛甲狀腺球蛋白、158kD牛IgG、44kDOVA、17kD馬(eq.)肌紅蛋白以及1.35kD維他命B12)、Mab-ll安慰劑(陰性對照無Mab-ll的緩衝液)、Mab-ll樣品順序注射。注射量對應約50嗎樣品。示意性大小排阻層析圖譜如圖5所示。滯留時間對稱J^相應於155-160kba。沒有檢出聚集體或片段。離子交換層析用JascoPU-980HPLC系統的離子交換層析分析純化的Mab-ll樣品。20分鐘內用0%B-52%B梯度在MonoS5/50GL柱(AmershamBiosciences)上對樣品進行層析(固定相A:50mM丙二^/丙二鹽於水中，pH5.3;流動相B:1M乙酸鈉於固定相A中，pH5.3)。流速設為1ml/min。用與Merck-HitachiD-2500記錄系統相連的JascoUV-975檢測儀在280nm處監測吸光度。將柱用固定相A平衡直至獲得穩定基線。按Mab-ll安慰劑、Mab-ll樣品順序注射。Mab-ll注射量大約為50fig。示意性離子交換層析圖鐠(IEC)如圖6所示。結果>95%Mab-ll樣品在高滯留時間、以沒有可分辨肩峰的單峰洗脫。約5。/。在短滯留時間洗脫。十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳將純化的Mab-ll和還原性/羧甲基化Mab-ll(RAMab-ll，製備參見下文)樣品用XcellMini-cellIIGel系統(Invitrogen)進行SDS國PAGE分析。將預稀釋樣品與還原性或非還原性樣品緩衝液混合至2-8jig/20jil濃度。還原性樣品緩衝液按製造商建議將NuPAGELDS樣品緩衝液(Invitrogen)與NuPAGE還原劑(Invitrogen)混合而製備。樣品在還原性樣品緩沖液中70'C溫育10分鐘。樣品和標準物上樣至10孔梳、1.0mm厚的NuPAGE4-12%Bis-Tris凝膠(Invitrogen，弁NP0301BOX)上。使用覆蓋範圍200-2.5kDa的Mark12TM分子量標準參照物(Invitrogen,弁LC5677)作為標準物。用NuPAGEMOPSSDS電泳緩衝液(Invitrogen)在200V凝膠電泳l小時。凝膠用StainEaseGel染色盤(Invitrogen)染色過夜，用光密度測定法掃描並分析。根據同一凝膠上標準參考物的標準樣品線計算蛋白濃度。結果非還原條件下SDS-PAGE:全長Mab-11,條帶對應於IgG的期望分子量；RAMab-ll，兩條帶對應於IgGlH-和IgGlL-鏈分子量。未檢出全長或部分還原性Mab-ll。還原條件下SDS-PAGE:全長Mab-11和RAMab-ll兩者都有，兩條帶對應於IgGlH-和IgGlL-鏈分子量。未檢出聚集體或片段(參見圖7)。質譜用LC/MS分析確定一級結構.還原性和羧甲基化Mab-11抗體以Lundell和Schreitmfiller所記栽方法(Samplepreparationforpeptidemapping—Apharmaceuticalquality-controlperspective.AnalBiochem.1999年1月1日；266(1):31-47)進行製備。使用梯度系統(A:水0.1%甲酸、B:乙腈0.1%甲酸)在AgilentPoroshellC8-反相柱(0.5x75mm)上進行分析性RP-HPLC分析。接著將層析流以正態、鎖閉噴射質量校正(lockspraymasscorrection)狀態進入ESI畫Q畫TOF質i普(Micromass/WatersQ-TOFUltima,Manchester,UK)的ESI離子源。蛋白圖語用MasslynxMaxEntl模塊去疊加。RA-Mab-11的LC/MS分析示於圖8中，觀測質量和計算質量如表3所示。tableseeoriginaldocumentpage15M+H十23845DaMab-ll;L鏈，還原性和羧曱基化的(23844Da)51770DaMab-ll;H鏈-G。，Pyro-Glu，-Lys，還原性和羧甲基化的(51770Da)51932DaMab國ll;H鏈國G!，Pyro-Glu，畫Lys，還原性和羧甲基化的(51932Da)52094DaMab-ll;HM-G2，Pyro-Glu,-Lys，還原性和羧曱基化的(52094Da)表3:RA-Mab-11的LC/MS分析;Sjt見測質量的分布(參見圖8)。L-鏈=輕鏈，H-鏈-重鏈，Go，Gi，G2-H鏈糖基化，Pyro-Glu=含焦穀氨酸的M酸序列，-Lys=H鏈胺基酸序列上1個賴氨酸缺失。檢測質量與H鏈有一個Pyro-Glu和一個Lys缺失的Mab-ll—級序列抗體的還原性/羧甲基化H-和L-鏈理論期望質量相匹配。H-鏈以G。，&糖基化為主，G2糖基化僅佔小部分。實施例4:耐受性免疫分析將轉基因和野生型同窩對照小鼠(N-5/每實驗)用乳化於200pl復水凝膠-HPA(Reheis)的10jig重組Mab誦ll進行腹膜(i.p.)免疫。第7、12、21和35天，尾靜脈穿刺取血。血清通過如上所述凝固製備，用ELISA檢測血清抗Mab-ll滴度。室溫下將Mab-ll以0.2嗎/孔包#7不包被maxisorp平板(Nunc)。洗滌後，將孔用PBS/0.1。/。(v/v)Tween-20/0.1。/。(w/v)BSA封閉，然後加入1:100稀釋血清在定軌搖床上振蕩溫育1小時。按製造商建議用1:100稀釋的APK-標記的抗小鼠IgG(BDPharmingen)檢測抗體結合。ELISA分析顯示野生型動物中可產生抗Mab-ll強免疫應答，而hlgGl-轉基因動物不能對重組Mab-ll產生強免疫應答(圖10)。因此，Mab-ll轉基因小鼠可耐受以外源方式提供的轉入其的抗體轉基因產物。實施例5:Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段的產生和分離將單克隆抗體Humira、Synagis⑧(Palivizumab，ABBOTTAG，存2422260A)和Mab-ll用木瓜蛋白酶消化，產生Fab-和Fc-片段，該片段用離子交換層析(IEC)分離。簡而言之，用葡聚糖凝膠TMG-25MPD10柱(AmershamBioscience)將抗體製劑緩衝液轉換為0.1MTris，4mMEDTA，1mM半胱氨酸，pH7.4，然後稀釋至濃度為3-5mg/ml。加入木瓜蛋白酶(RocheDiagnostics)至0.01mg/ml的終濃度。37。C溫育2小時後，用Amicon超離心過濾設備(MiIlipore)lOkDa超濾，將緩衝液轉換為20mML-組氨酸，pH5.5。用PL國SCX1000A，8um,4.6x150mm(PolymerLabs)或MonoSTM5/50GL柱(AmershamBiosciences),分別以50mM3-(N誦嗎啉代)丙磺酸(MOPS)(Applichem)pH6.7至50mMMOPS中的1M乙酸鈉，pH7.0的梯度，或10mM2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)pH6.0至10mMMES、0.2MNaCl，pH6.0的梯度，用製備性IEC進行Fab-和Fc-片段分離。收集含有蛋白質的級分，用10kDa超濾(AmiconUltra,參見上文)將緩衝液轉換為20mML畫組氨酸、140mMNaCl、0.01%Tween,pH5.5。用實施例3所述的非還原條件SDS-PAGE鑑定所濃縮的級分。結果如圖9所示。實施例6:產生抗獨特型抗體將Humira(Adaliinumab，ABBOTTAG,#04H-640-E694-l)用作Mab-ll相同同種型的獨特型抗體的實例。Humira為治療類風溼性關節炎的TNF特異性治療單複製人抗體。Mab-ll和Humira都是IgGl抗體，它們Fc部分和Fab恆定區的一級序列相同或幾乎相同。將IO嗎HUMIRA乳化於200jil復水凝膠HPA(Reheis)。第0天腹膜(i.p.)免疫動物，第7、12、21天尾靜脈穿刺取血，製備血清，ELISA檢測抗HUMIRA滴度。用HUMIRA包被maxisorp平板(Nunc)用以俘獲,用上述抗小鼠IgG(BDPharmigen)進行檢測。如圖11所示，野生型(A)和轉基因小鼠(B)都對HUMIRA產生強免疫應答。實施例7:評測抗Humira血清對獨特型抗體的交叉反應性為評測Humira免疫的WT和TG小鼠血清中抗Humira抗體的特異性，用Fc部分和Fab恆定區一級序列相同或幾乎相同的Humira、Mab-11和Synagis作為獨特型人IgGl的實例，進行ELISA。Synagis(Palivizumab，ABBOTTAG，#2422260A)是用於治療RSV感染的單複製人源化IgGl。Humira,Mab-11和Synagis的Fab和Fc片段按實施例5記載的方法製備並分離，並在室溫下以0.2照/孔包被maxisorp平板(Nunc)。洗塗後，將小孔用PBS/0.1%(v/v)Tween-20/0.1%(w/v)BSA封閉。加入用Humira免疫的五隻轉基因小鼠和五隻野生型小鼠的1:100稀釋血清庫，在定軌搖床上振蕩溫育l小時。按製造商建議，用1:100稀釋的APK-標記抗小鼠IgG(BDPharmingen)檢測抗體的結合。ELISA分析顯示，血清抗體與測試抗原的結合存在顯著差異。對於野生型動物，觀察到對所有測試抗體的Fab-和Fc-片段均產生強免疫應答。因此，野生型動物中所產生的免疫應答主要針對人IgGl恆定區，這解釋了觀察到的對所有測試抗體Fab和Fc部分的強烈交叉識別(圖12)。相反地，對於Humira免疫的Mab-11轉基因小鼠，檢測到針對HumiraFab部分的強抗體應答，而對Humira的Fc和Fab以及所有其他測試獨特型抗體Fc部分的結合僅為背景水平(圖13)。因此，可以得出結論人抗體Mab-11轉基因動物可產生主要針對免疫獨特型抗體的可變、獨特型特異區的免疫應答。本文也顯示，本發明的IgGl轉基因鼠對轉基因表達的IgGl抗體耐受，而當用相同IgGl同種型的不同人抗體^b^時，可產生強免疫應答。產生的免疫應答僅針對用於激發的人IgGl分子的V區，而Fc區被巧妙忽略。人抗ApigGl轉基因小鼠的特性可使其成為迅速、有效產生抗獨特型單克隆抗體的有價值的工具。序列表〈110〉弗哈夫曼-拉羅切有限公司〈120〉製備抗獨特型抗體的方法〈130〉23856<160〉10<170〉Patentln版本3.3〈210〉11562〈212〉DNA〈213〉人(Homosapiens)〈400〉1gcgccaccatgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcc60tgtcccaggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgc120gtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgcc180aagcccctgggaagggtctagagtgggtgagcggtattaatgctgctggttttcgtactt240attatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccc300tgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtg360gtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaag420gcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac480cctcctccaagagcacctctgggggcacagcagccctgggctgcctggtcaaggactact540tccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacacct600tcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccct660ccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacca720aggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcc780cagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca840ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaag900accctgaggtcaagttcaacagccgcgggaggagcagtacaccaggactggctgaatggccccccatcgagaaaaccatcccctgcccccatcccgggataaggcttctatcccagcgacactacaagaccacgcctccctcaccgtggacaagagcaggaggctctgcacaaccactaccacggccggcaagcccccgcaccccgtgtacatacttcccgg<210〉2〈211〉715〈212〉DNA〈213〉人〈400〉2cgccaccatggtgttgcagactacggggatatcgtgctgatgcgaccctgagctgcagaggcagaaaccaggtcaagcacggtcccggcgcgttttagcgcctggaacctgaagactttgctttggccagggtacgaaagcttcccgccatctgatgagctaacttctatcccagagaggtaactcccaggagagtgtcatggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa%0aacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgc1020aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccag1080tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca1140gagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca1200atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaaca1260gtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagc1320tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatg1380acacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtgc1440tccccaggctctcggggtcgcgcgaggatgcttggcacgt1500aggcacccagcatggaaata犯gcacccagcgcttccctg15601562cccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgc60cccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacg120cgagccagtatgttgatcgtacttatctggcgtggtacca180cgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactgg240gctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcag!300cgacttattattgccagcagatttattcttttcctcatac360ttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcat420agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaa480ccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcggg540cagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcag600caccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcac660cca/tcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc犯caggggagagtgttag715331腿人工的3acgtgtcgacgccgccaccatgaaacacctg31428DNA人工的人工序列的描述Gl.11Ba虹ev，人抗APIgGl重鏈3'末端引物〈400>4acgtggatcctcatttacccggagacag285<211〉31DNA〈213〉人工的〈220>人工序列的描述K.11Xhofor,人抗APIgGl輕鏈5'末端引物〈400>5acgtctcgaggccgccaccatggtgttgcag31<210〉6〈211〉29腿〈213>人工的〈223>人工序列的描述K.11Bglrev,人抗APIgGl輕鏈3'末端引物6acgtagatctctaacactctcccctgttg29<210〉7〈211〉27<212〉DNA人工的人工序列的描述5H2KP，人抗APIgGl重鏈基因PCR引物820腿人工的〈220>人工序列的描述G1.0501,人抗IgGl重鏈基因PCR引物8tgtactccttgccattcagc20927薩人工的〈220〉人工序列的描述5H2KP,人抗APIgGl輕鏈基因PCR引物9atgaattcacagtttcacttctgcacc271020〈212>醒人工的人工序列的描述K.44,人抗AeIgGl輕鏈基因PCR引物〈400>10gctcatcagatggcgggaag20權利要求1、轉基因非人動物在製備針對目的抗體的抗獨特型抗體中的應用，其中所述非人動物為外源抗體轉基因動物，並且其中所述目的抗體與所述外源抗體具有相同同種型。2、權利要求1的應用，其中所述外源抗體和目的抗體為人抗體或人源化抗體。3、權利要求1或2的應用，其中所述外源抗體和目的抗體為IgG抗體。4、製備針對目的抗體的抗獨特型抗體的方法，其包括a)產生外源抗體轉基因非人動物，b)在所述轉基因非人動物中誘導針對目的抗體的免疫應答，其中目的抗體與外源抗體具有相同同種型，以及c)製備直接針對目的抗體獨特型部分的抗體。5、權利要求4的方法，其中所述方法包括另一步驟d)分離抗獨特型抗體。6、權利要求4或5的方法，其中所述外源抗體和目的抗體為人抗體或人源化抗體。7、權利要求4-6中任一項的方法，其中所述外源抗體和目的抗體為IgG抗體。8、與本文前述記載實質上相同、特別是參考前述實施例的方法和應用。全文摘要本發明涉及外源抗體轉基因非人動物在製備抗獨特型抗體中的應用，以及製備抗獨特型抗體方法，該方法包括a)產生外源抗體轉基因非人動物，b)在該轉基因非人動物中誘導針對目的抗體的免疫應答，其中目的抗體含有與外源抗體相同種類的特異性同種型，以及c)製備針對目的抗體獨特型部分的抗體。文檔編號C07K16/18GK101186651SQ200710194470公開日2008年5月28日申請日期2007年11月6日優先權日2006年11月6日發明者A·伊格萊希亞斯,H·貝克,M·措赫爾,T·施萊特米勒申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司