抗獨特型綴合物及其在免疫測定中作為標準物的用途的製作方法

2023-09-19 09:46:10

專利名稱：抗獨特型綴合物及其在免疫測定中作為標準物的用途的製作方法
技術領域：
本發明包括綴合物，及其在測定抗藥物抗體的免疫測定中作為標準物 或陽性對照的用途。
背景技術：
使用單克隆抗體的標準固相免疫測定涉及在吸附於固相支持物上的抗 體(捕獲抗體)、抗原，以及針對抗原另一表位並綴合了可檢測標記的抗
體(示蹤抗體)之間形成複合物。由此形成夾層固相支持物-捕獲抗體-抗原-示蹤抗體。在夾層中，抗體綴合的可檢測標記的強度與孵育介質中的 抗原濃度成比例。由於捕獲抗體和示蹤抗體與抗原的不同表位結合，標準 夾心法也稱為雙抗原橋連免疫測定法(double antigen bridging immunoassay )。 Hoesel， W.等人在J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110 中報導了抗EPO雙抗原橋連測定法，其中使用了與氨基和與糖基偶聯的固 定4匕rhEPO混合物。
諸如雙抗原橋連ELISA的免疫測定法是研究患者對於抗體藥物(治療
Mire-Sluis, A.R.等人，在J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16中總結了 設計和優化檢測針對生物技術產品的宿主抗體的免疫測定法的建議。根據 Mire-Sluis等人所述，眾所周知的抗藥物抗體測定法形式顯示出顯著的缺 點。抗藥物抗體測定法在例如WO 2005/045058和WO 90/006515中有所 提及。抗獨特型抗體測定法在例如US 5，219，730、 WO 87/002778、 EP 0 139 389和EP 0 170 302中有所提及。Wadhwa, M.等人在J. Immunol. Methods 278 (2003) l-17中才艮道了檢測、測量和表徵由治療性生物製品誘導的不期望抗體的策略。
Ritter， G.， Cancer Res. 61 (2001) 6851-6859和WO 2003/016909中描
述了對於人抗人抗體的血清學分析。對於IgG類人抗人抗體的鑑定，在測 定之前需要進行G蛋白沉澱的額外步驟。
發明簡述
本發明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨 特型抗體和屬於單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。
性結合。
本發明還包括本發明的綴合物在免疫測定中作為標準物的用途，所述 免疫測定用於測定人類樣品中抗親本抗體的抗體。
優選所述綴合物在對樣品中抗親本抗體的抗體的免疫測定中用作標準 物或陽性對照，該免疫測定使用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定 法。
優選所述捕獲抗體或所述示蹤抗體為所述親本抗體。
優選所述親本抗體為治療性抗體或診斷性抗體。
優選所述捕獲抗體選自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區、Fab、 Fab'、 F(ab)2、或F(ab，)2片段。
優選捕獲抗體通過被動吸附與固相支持物進行綴合。 優選捕獲抗體通過特異性結合對固定化。
優選捕獲抗體與生物素綴合，通過固定化抗生物素蛋白或鏈黴抗生物 素蛋白進行固定。
優選示蹤抗體通過特異性結合對與可檢測性標記綴合。
優選示蹤抗體與洋地黃毒苷綴合，並通過針對洋地黃毒苷的抗體與可 檢測性標記進行連接。
優選免疫測定用表面等離振子共振進行。優選捕獲抗體和/或示蹤抗體與其綴合配偶體的綴合通過化學結合實
現，所述化學結合經由N端和/或s-i^(賴氨酸)、不同賴氨酸的& 、 抗體胺基酸骨架的羧基、巰基、羥基和/或酚官能團、和/或抗體糖結構的糖 醇基進行結合。
優選捕獲抗體通過被動吸附與固相支持物綴合，因此與固相支持物綴 合的捕獲抗體包含通過不同抗體位點與固相支持物綴合的至少兩種捕獲抗 體的混合物。例如Butler ， J.E. ， Solid Phases in Immunoassay, 在 Immunoassay, Diamandis， E.P.和Christopoulos， T.K.(編著)學術出版 社，聖地牙哥(1996),第205-225頁中對^皮動吸附有所描述。
在本發明的優選實施方案中，捕獲抗體通過特異性結合對固定化。這 樣的結合對(第一組分/第二組分)為，例如鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素 蛋白/生物素、抗體/抗原(參見例如Hermanson， G.T.等人,Bioconjugate Techniques,學術出版社，1996)、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、 激素/激素受體、酶/底物、IgG/A蛋白和/或G蛋白等。優選捕獲親本抗體 與生物素綴合，通過固定化的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白進行固定。
在本發明的優選實施方案中，示蹤抗體與可檢測性標記綴合，優選通 過特異性結合對綴合。這樣的結合對(第一組分/第二組分)為，例如鏈黴 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原(參見例如Hermanson， G.T.等人，Bioconjugate Techniques,學術出版社，1996)、凝集素/多糖、 類固醇/類固醇結合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。 優選，示蹤親本抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地黃毒苷的抗體與可檢測性 標記綴合。備選地，示蹤親本抗體與電化學發光標記綴合，如釕聯吡咬復 合物。
發明詳述
本發明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨 特型抗體，以及屬於單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。優選所述親 本抗體為治療性抗體。優選所述親本抗體為診斷性抗體。本發明的術語"與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨特型抗體"表 示在非人動物中針對親本抗體產生的抗體，即為非人抗體。優選所述針對 親本抗體產生的抗體在嚙齒類動物或獼猴中產生，特別優選在小鼠、兔或
食蟹猴中產生，或通*示(display)技術，優選噬菌體或核糖體展示技 術獲得。優選所述抗獨特型抗體為多克隆抗體。還優選所述抗獨特型抗體 為單克隆抗體。優選用親本抗體或其片段對所述動物進行免疫。在之後的 步驟中，通過對親本抗體的一個或多個CDR區的親和吸附來分離和純化 來自所述動物的免疫球蛋白。術語"親本抗體的CDR區"表示親本抗體輕 鏈和重鏈的CDR區，即包含親本抗體輕鏈CDR1、 CDR2、 CDR3，親本 抗體重鏈CDR1、 CDR2、 CDR3。
本發明的術語"親本抗體"表示可以作為藥物(藥物抗體或治療性抗體) 或診斷工具(診斷性抗體)對個體施用的抗體，因此推測在施用之後所述個
體的樣品包含所述親本抗體。在根據本發明進行的一種測定法中，親本抗 體、捕獲(親本)抗體和/或示蹤(親本)抗體包含"相同的"抗體分子，例如用 相同的表達載體重組生產，並包含相同的M酸序列。藥物抗體(治療性 單克隆抗體)廣泛應用於治療多種疾病如腫瘤疾病(例如血液惡性癌和實 體惡性癌，包括非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和結直腸癌)。例如在Levene， A.P.等人，Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 146-152中描 述了此類抗體。此類抗體為例如針對CCR4、 CD19、 CD20、 CD22、 CD28、 HLA-DR、 CD33、 CD40、 CD52、 CD80、 CSF畫1R、 CTLA隱4、成纖維細 胞活化蛋白(FAP)、 EGFR、 G250、 GD3、 HER2/neu、 HER3、 HER4、前 列腺特異性膜抗原(PSMA)、 CD56、 VEGF、 VEGF2、 TLSP-R、 TIE畫1、 TIE-2、 TNF-a、 TNF樣凋亡孩吏弱+秀導劑(TNF like weak inducer of apoptosis， TWEAK)、 CEA、 Ep畫CAM、 TRAIL、 TRAIL受體1、 TRAIL 受體2、淋巴毒素p受體、Levis Y抗原、hepsin、黑素瘤相關的硫酸軟骨 素蛋白聚糖(MCSP)、 IL-1受體、IL-6受體、VEGF-受體1、 VEGF-受體2 或IGF-1受體的抗體。治療性抗體在Groner， B.等人，Curr. Mol. Meth. 4 (2004)539-547;和Harris, M.， Lancet Oncol. (2004) 292-302中也有所描述。
本文使用的術語"參考免疫球蛋白"表示完整的免疫球蛋白，即包含
Fab區和Fc區的免疫球蛋白，以及完整免疫球蛋白的片段，如Fc區、CH2 結構域或CH3結構域。參考免疫球蛋白優選為人免疫球蛋白。優選"參考 免疫球蛋白"為人免疫球蛋白或人免疫球蛋白的Fc區。本發明的"參考免疫 球蛋白"不與抗獨特型抗體特異性結合，不與綴合物的親本抗體特異性結 合。免疫球蛋白的Fc區由對完整免疫球蛋白的胃蛋白酶切割或木瓜蛋白酶 切割得到。參考免疫球蛋白屬於"單個免疫球蛋白類"。術語"單個免疫球蛋 白類，，表示所述參考免疫球蛋白包含免疫球蛋白類特異性恆定區胺基酸序 列，其選自免疫球蛋白A、 E、 M和G類。關於免疫球蛋白類特異性恆定 區^J^斷列，參見例如Pink， J.R.等人，Biochem. J. 117(1970)33-47。
"抗親本抗體的抗體"為與親本抗體特異性結合的抗體，即針對親本抗 體的抗體。同樣，抗-抗IL-6R抗體的抗體為與抗IL-6R抗體特異性結合的 抗體。"抗親本抗體的抗體"為針對親本抗體任何區域的抗體，如親本抗體 的可變區、恆定區或糖結構。此類抗親本抗體的抗體可能在抗體治療過程 中作為患者的免疫原性反應出現(見Pan, Y.等人，FASEB J. 9 (1995) 43-49)。"抗獨特型抗體"為與親本抗體CDR區特異性結合的抗體。抗獨特 型抗體特異性結合親本抗體的輕鏈CDR1區、輕鏈CDR2區、輕鏈CDR3 區、重鏈CDR1區、重鏈CDR2區或重鏈CDR3區。
親本抗體(優選單克隆)的實例為針對IL-6受體的抗體(抗IL-6R抗 體)。此類抗體在例如Mihara， M.等人，Clin. Immunol. 98 (2001) 319-326; Nishimoto， N.等人，Blood 106(2005)2627-2632;臨床實驗NCT00046774; 或WO 2004/096274中有所描述。
親本抗體(優選單克隆)的實例為針對IGF-1受體的抗體(抗IGF-1R 抗體)。此類抗體在例如WO 2004/087756， WO 2005/005635中有所描述。
本發明的術語"結合"或"特異性結合"指以小於l(T6 M (M=mol/l)(例如 10"2M)的Ko值，更優選以範圍在l(T9 M到1(T15M中的KD值與抗原、免 疫球蛋白的恆定區、親本抗體或親本抗體的CDR區結合，KD值以BIAcore測定法測定。當Ku值大於10-s M(例如l(T4 M)時見到"非特異性結合"。
例如Hage， D.S.在Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R中描述了不同免 疫測定法的原理。Lu, B.等人在Analyst. 121 (1996) 29R-32R中報導了抗 體的定向固定，以用於免疫測定法。例如Wilchek， M.和Bayer， E.A.， Methods Enzymol. 184 (19卯)467-469報導了抗生物素蛋白-生物素介導的 免疫測定法。
抗體(特別是其恆定結構域)包含氬基酸側鏈功能性，即化學反應性 基團，以與結合配偶體偶聯，所述結合配偶體如表面、蛋白質、聚合物(例 如PEG、纖維素、或聚苯乙烯)、酶、或結合對的成員。抗體的化學反應 基團為例如，氨基(賴氨酸的s-氨基、oi-氨基)、巰基(胱氨酸、半胱氨 酸、曱硫氨酸)、羧酸基團(天冬氨酸、穀氨酸)和糖醇基。例如Aslam， M.和Dent, A.， Bioconjuation，麥考林出版公司(MacMillan Ref. Ltd.) (1999) ， 50-100頁，對此類方法有所描述。
多肽與例如固相支持物的綴合需要適當的化學保護劑。這些保護劑例 如與無保護的側鏈胺結合，這種結合沒有在N端的結合穩定，且與之不同。 許多這樣的化學保護劑是已知的(參見例如EP 0 651 761)。優選的化學保護 劑包括環狀二羧酸酐如馬來酸酐或檸康酸酐(citraconylic anhydride )。
術語"樣品"包括但不限於來自人的任意量的物質。此類物質包括但不 限於來自個體的全血、血清或血漿，這些是在臨床實踐中最廣泛使用的樣 品來源。
本發明免疫測定的固相支持物在本領域技術中有廣泛描述(參見例如 Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23)。
術語"固相支持物"表示非流體物質，包括晶片、小管和顆粒(包括 微粒和小珠)，其由如諸如聚合物、金屬(順磁、鐵磁性顆粒)、玻璃和 陶瓷等材料製成；凝膠物質如矽膠、氧化鋁和聚合物凝膠；毛細管，其可 以由聚合物、金屬、玻璃和/或陶資製成；沸石和其他多孔物質；電極；微 量滴定板；固體檢測條(strip);比色亞、管或其他分光計樣品容器。測 定法中的固相支持物元件與測定法中可能接觸到的惰性固體表面的不同之處在於，"固相支持物，，表面包含至少 一個預期與捕獲抗體直接或間接相互 作用的部分。固相支持物可以是固定元件，如管、檢測條、比色皿或微量 滴定板，或可以是不固定的元件，如小珠和微粒。孩^立還可以作為勻相測 定法形式的固相支持物。可以使用允許蛋白質和其他物質非共價或共價連
接的多種微粒。這樣的顆粒包括聚合物顆粒如聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸 甲酯；金顆粒如金納米顆粒和膠體金；和陶瓷顆粒如矽膠、玻璃和金屬氧 化物顆粒。見例如Martin ， C.R.等人，Analytical Chemistry-News & Features 70 (1998) 322A-327A，其引入本文作為參考。
"晶片"為固相、無孔材料，如金屬、玻璃或塑料。該材料可以任選完 全或在某些區域被包被。在該材料的表面上，點的任何排列可見地或在坐 標中呈現。在各點上，確定的多肽可以通過或不通過連接體(linker)或間 隔物(spacer)固定到材料的表面上。
上文和下文中提到的所有文件均在此引入本文作為參考。
可檢測性標記的實例為色原(螢光或發光基團和染料)、酶、NMR-活性基團或金屬顆粒、半抗原(例如洋地黃毒苷)。可檢測性標記還可以 是光活化交聯基團，例如疊氮基或吖丙咬基(azirine)。可以用電化學發光 檢測的金屬螯合物也是用作可檢測標記的優選信號發射基團，特別優選釕 螯合物，例如釕(聯吡咬)32+螯合物。例如EP 0 580 979、 WO卯/05301、 WO 90/11511和WO 92/14138中描述了適合的釕標記基團。
本發明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨 特型抗體和屬於單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。
本發明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨 特型抗體和屬於選自人免疫球蛋白E、人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M 或人免疫球蛋白A的單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白，即所述參考 免疫球蛋白為人IgE類、或為人IgG類、或為人IgM類、或為人IgA類。
優選本發明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區特異性結合的 抗獨特型抗體和屬於單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白，所述參考免 疫J求蛋白不與所述抗獨特型抗體特異性結合，不與所述親本抗體特異性結合。
優選所述親本抗體為治療性抗體或診斷性抗體。優選所述參考免疫球 蛋白為屬於單一免疫球蛋白類別的無功能的免疫球蛋白，或為屬於單一免
疫球蛋白類別的免疫球蛋白的Fc區。
術語"診斷性抗體"表示用於檢測和顯示其耙抗原的抗體，其為天然抗 體或重組生產的抗體。診斷性抗體在例如測定系統(例如ELISA)中使用， 或用於體外成像。診斷性抗體可以為例如標記的治療性抗體。
優選所述參考免疫球蛋白為人免疫球蛋白或人免疫球蛋白Fc區。 參考免疫球蛋白提供免疫球蛋白類別特異性恆定區，該免疫球蛋白類 別特異性恆定區可以與抗免疫球蛋白類抗體，如抗人免疫球蛋白G抗體特 異性結合。因此參考免疫球蛋白為本發明的綴合物提供了免疫球蛋白類別 特異性標記，該免疫球蛋白類別特異性標記可以通過標記特異性抗體得到 特異性鑑定。例如，如果該標記為免疫球蛋白G恆定區，則標記特異性抗 體為抗免疫球蛋白G抗體。
優選所述抗獨特型抗體為多克隆抗體，所述參考免疫球蛋白為多克隆 免疫球蛋白。還優選所述抗獨特型抗體為多克隆抗體，所述參考免疫球蛋 白為單克隆免疫球蛋白。更優選所述抗獨特型抗體為單克隆抗體，所述參 考免疫球蛋白為單克隆免疫球蛋白。
本發明的綴合物由抗獨特型抗體和參考免疫球蛋白的化學綴合得到。 在本發明的綴合物中，抗獨特型抗體為有功能的免疫球蛋白，參考免 疫球蛋白為無功能的免疫球蛋白。這表示抗獨特型抗體與其靶抗體特異性 結合，而參考抗體不與任何人抗原特異性結合。提供參考抗體是為了呈現 與天然存在的免疫球蛋白儘可能相似的Fc區，而不是為了結合抗原。抗獨 特型抗體和參考抗體不是相同抗體的情況也涵蓋在本發明的範圍內，這樣 的情況即它們有至少20 %的胺基酸殘基不同，即它們基於氨基^列的同 一性為80%或更少。參考抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本申請中 使用的術語"單克隆"表示由單種細胞或其子代產生的抗體群。該術語表示 所述抗體具有相同的胺基酸序列，即所述抗體具有相同的胺基酸序列，雖然在產生抗體的細胞增殖的過程中有偶然突變。
本申請中使用的術語"無功能的免疫球蛋白，，表示以10-5 mol/1或更高 (例如l(T3 mol/l)的Ku值(結合親和力)，優選以l(T6 mol/1或更高的Ko值與 人抗原結合的免疫球蛋白。結合親和力用標準結合測定法，如表面等離振 子共振技術(BIAcor^)測定。此結合親和力值不必作為精確值對待；它只 是參考點。該結合親和力值用於確定和/或選擇對於人抗原不顯示免疫球蛋 白典型的特異性結合，從而在人類中沒有治療活性的免疫球蛋白。這不排 除免疫球蛋白對於非人抗原顯示特異性結合。此與非人抗原的特異性結合 的Ku值為l(T7 mol/1或更低(例如1(T1Q mol/l)，優選Ko值為l(T8 mol/1或更 低。
基於轉染瘤，即從免疫的小鼠獲得的包含轉染的免疫球蛋白基因的淋 巴樣細胞，本發明的綴合物可以通過核酸水平上的綴合得到。
對哺乳動物使用源自受體生物之外的藥物，例如施用外源性治療多肽， 會導致受體哺乳動物的免疫應答。此免疫應答通過抗藥物抗體的出現而變 得顯而易見。評估此類免疫應答需要檢測針對該藥物的抗體的方法。
本發明的綴合物可以在免疫測定中用作標準物。因此，本發明包括綴 合物用於在測定人類樣品中抗親本抗體的抗體的免疫測定中作為標準物的 用途的用途，所述綴合物包含與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨特 型抗體和屬於單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。
本發明的綴合物還可以在免疫測定中用作陽性對照。這使得例如可以 例如建立檢測限。因此，本發明包括綴合物在用於測定人類樣品中抗親本 抗體的抗體的免疫測定中作為陽性對照的用途，所述綴合物包含與親本抗
體的CDR區特異性結合的抗獨特型抗體和屬於單一免疫球蛋白類別的參 考免疫球蛋白。在此實施方案中優選所述綴合物在免疫測定之前加入人類 樣品中。
親本抗體優選為治療性抗體。並且優選親本抗體為鼠抗體、嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。優選親本抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。 特別優選所述親本抗體為治療性的嵌合、人源化或人抗體。檢測針對親本抗體的抗體可以z使用不同的方法，如放射免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測 定(ELISA)、免疫放射測定(IRMA)或表面等離振子共振(SPR)。
本申請中使用的術語"治療性抗體"及其語法上的等同用語優選表示單 克隆抗體，其預期施用於哺乳動物，優選人類，用於疾病的治療 (treatment),療法(therapy )或診斷。治療性抗體通常用重組方法生產， 例如通過培養用編碼所述治療性抗體的核酸轉染的真核細胞生產。優選治 療性抗體為嵌合抗體、或人源化抗體、或人抗體。施用治療性抗體以實現 期望的效果，例如消耗靶細胞、或介導ADCC (依賴抗體的細胞介導的細 胞毒性)、或介導CDC(依賴補體的細胞毒性)。靶細胞可以是例如癌細胞或 病毒感染的細胞。要介導ADCC或CDC，治療性抗體必須結合乾細胞， 因此是對例如腫瘤抗原特異性的，即與其特異性結合。
本文使用的"肺瘤抗原"，包括本領域已知的含義，其包括在腫瘤細胞 上表達(或與腫瘤細胞發育相關)、已知或被認為對腫瘤細胞的致瘤特性 有作用的任何分子。許多腫瘤抗原為本領域已知。 一種分子是否為腫瘤抗 原還可以根據本領域技術人員熟知的技術和測定法確定，例如克隆發生測 定法(clonogenic assay )、轉化試驗、體外或體內肺瘤形成測定法、凝膠 遷移測定法(gel migration assay)、基因敲除分析等。優選術語"腫瘤抗 原"在本文中使用時指AJ^膜蛋白，即錨定在細胞脂雙層中的細胞膜蛋白。 本文使用的人跨膜蛋白通常會包含"細胞外結構域"，其可以結合配體、親 脂跨膜結構域、保守的胞內結構域，例如酪氨酸激酶結構域，和具有若干 可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號結構域。肺瘤抗原包括分子如 EGFR、 HER2/neu、 HER3、 HER4、 EpCAM、 CEA、 TRAIL 、 TRAIL 受體l、 TRAIL受體2、淋巴毒素p受體、CCR4、 CD19、 CD20、 CD22、 CD28、 CD33、 CD40、 CD80、 CSF-1R、 CTLA畫4、成纖維細胞活4匕蛋白 (FAP)、 hepsin、黑素瘤相關的硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、前列腺特異 性膜抗原(PSMA)、 VEGF受體1、 VEGF受體2、 IGF1-R、 TSLP-R、 TIE-1、 TIE-2、 TNF-a、 TNF樣凋亡微弱誘導劑(TWEAK)或IL-1R。
優選本發明的綴合物在^f吏用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定法對樣品中的抗親本抗體的抗體進行的免疫測定中用作標準物。特別優選 所述捕獲抗體或所述示蹤抗體為所述親本抗體。
例如，抗藥物抗體測定法在WO 2005/045058和WO卯/006515中有 所提及，抗獨特型抗體測定法在US 5，219，730、WO 87/002778、EP 0 139 389 和EP 0 170 302中有所提及。
優選所述抗獨特型抗體為單克隆抗體，所述參考免疫球蛋白為多克隆 人免疫球蛋白。還優選所述抗獨特型抗體為單克隆抗體，所述參考免疫球 蛋白為單複製人免疫球蛋白。
本發明的綴合物優選在對樣品中針對親本抗體的抗獨特型抗體進行的 免疫測定中用作標準物。所述免疫測定使用捕獲抗體和示蹤抗體。在一個 實施方案中捕獲抗體為親本抗體。優選用作捕獲抗體的親本抗體為完整抗 體，即它包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈包含可變結構域和恆定結構域，其中 重鏈包含可變結構域、CH1、 CH2、 CH3和任選的CH4結構域和鉸鏈區。 優選捕獲抗體選自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區、Fab、 Fab，、 F(ab)2 或F(ab，)2片段，即其為所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區、Fab、或Fab，、 或F(abh、或F(ab，)2片段。在其他實施方案中，示蹤抗體為親本抗體。在 此實施方案中，例如本發明的綴合物通過與綴合物的參考免疫球蛋白特異 性結合的免疫球蛋白與固相支持物結合。
示蹤抗體和/或捕獲抗體與其綴合配偶體的綴合可以通過不同方法實
現，如被動吸附、化學結合或通過特異性結合對結合。本文使用的術語"綴 合配偶體，，表示例如固相支持物、多肽、可檢測性標記、特異性結合對的成
員。在一個實施方案中，捕獲抗體和/或示蹤抗體與其綴合配偶體的綴合是 通過化學結合實現，其經由N端和/或s-氨基(賴氨酸)、不同賴氡酸的s-氨基、抗體胺基酸骨架的氛基、巰基、羥基和/或酚官能團、和/或抗體糖結 構的糖醇基進行結合。在一個實施方案中，捕獲抗體和/或示蹤抗體通過特 異性結合對與其綴合配偶體綴合。優選捕獲抗體與生物素綴合，通過固定 於固相支持物的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白實現與固相支持物的固 定。優選示蹤抗體與洋地黃毒苷綴合，通過針對洋地黃毒普的抗體實現與可檢測標記的連接。在另一實施方案中，捕獲抗體通過被動吸附與固相支 持物綴合。通過被動吸附與固相支持物綴合的抗體包含通過不同抗體位點 與固相支持物綴合的抗體的混合物。因此，通過^皮動吸附與固相支持物綴 合的捕獲抗體為兩種或多種不同綴合物的混合物，其中綴合物在實現與固
相支持物的綴合的抗體位點(即抗體殘基)上有所不同。例如Butler，丄E.， Solid Phases in Immunoassay, Immunoassay,第205-225頁，Diamandis， E.P.和Christopoulos， T.K.(編)學術出版社，聖地牙哥(1996)中對被 動吸附有所描述。
在本發明的優選實施方案中，捕獲抗體通過特異性結合對固定化。此 類結合對(第一組分/第二組分)為，例如鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋 白/生物素、抗體/抗原(參見例如Hermanson, G.T.等人，Bioconjugate Techniques,學術出版社，1996)、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、 激素/激素受體、酶/底物、IgG/ A蛋白和/或G蛋白和/或L蛋白等。優選 捕獲親本抗體與生物素綴合，通過固定化的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素 蛋白進行固定。在本發明的其他優選實施方案中，示蹤抗體與可檢測性標 記綴合，優選通過特異性結合對綴合。這樣的結合對(第一組分/第二組分) 為，例如鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、凝集素/ 多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/A蛋白和/ 或G蛋白和/或L蛋白等。優選示蹤親本抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地 黃毒普的抗體與可檢測性標記綴合。可選地，示蹤親本抗體與電化學發光 標記(如釕聯吡啶複合物)綴合。
如果本發明的綴合物在測定人類樣品中針對親本抗體的抗獨特型抗體 的免疫測定中用作標準物，則優選以兩種或多種不同濃度^f吏用該綴合物。 使用測定的對不同濃度標準物的反應，計算/可以計算校準曲線。
如果本發明的綴合物在測定人類樣品中針對親本抗體的抗獨特型抗體 的免疫測定中用作標準物，可以使用與所述綴合物的所述參考免疫球蛋白 特異性結合的(任選的)其他抗體。本發明的綴合物可以作為標準物單獨使 用，或與任選其他的抗人免疫球蛋白抗體組合使用(圖3和4)。在本申請中可以互換使用的術語"標準物"或"標準物質"表示分析方法
中的參考點，用於設定相對於相同分析方法中比較的其他結果的值。本文 使用的術語"陽性對照"表示這樣的標準物質，當在分析方法中使用它時， 會得到高於確定的截斷值或閾值的反應。截斷值通常是在不含抗藥物抗體 樣品的分析中得到的平均值加上兩倍、優選三倍所得值的標準差。
本發明還包含在免疫測定中使用本發明的綴合物作為標準物的方法，
所述方法包含下列步驟a)本發明的綴合物與捕獲抗體相接觸，b)檢測 所述綴合物與所述捕獲抗體的結合。對步驟a)中的結合的檢測可以例如通 過SPR角度的變化直接進行，或例如通過示蹤抗體和/或可檢測性標記間 接進行。
本發明還包含測定抗藥物抗體是否與親本抗體的Fc區或Fab區結合， 以及測定所述抗藥物抗體屬於哪種免疫球蛋白類別的方法(見例如圖7)。在 此方法中，樣品的結合^f吏用固定化的親本抗體、固定化的所述親本抗體的 Fc區和/或固定化的所述親本抗體的Fab區進行測定。這可以例如在 BIAcore晶片上實現，其上的四個槽(channel)中一個含有固定化的親本 抗體， 一個含有固定化的親本抗體的Fc區， 一個含有固定化的親本抗體的 Fab區， 一個不含固定化的親本抗體。取決於哪些槽，於是也就是親本抗 體的哪(些)部分顯示與來自樣品的抗藥物抗體結合，由此可以確定抗藥 物抗體的結合區域。免疫球蛋白的類別通過結合抗人免疫球蛋白E抗體、 抗人免疫球蛋白M抗體、抗人免疫球蛋白G抗體或抗人免疫球蛋白A抗 體確定。依次或伴隨使用抗人免疫球蛋白抗體，優選依次使用。本發明的 綴合物可以在此方法中用作標準物。
本發明還包括用包含捕獲抗體、示蹤抗體和本發明的綴合物的夾心免 疫測定法，以測定樣品中與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨特型抗 體的免疫球蛋白類別的方法，其包含下列步驟
a) 所述樣品與捕獲抗體在適合形成捕獲抗體/抗獨特型抗體複合 物的條件下相接觸，
b) 分別以0 抗人免疫球蛋白A抗體，
ii) 抗人免疫球蛋白E抗體，
iii) 抗人免疫球蛋白M抗體，和
iv) 抗人免疫球蛋白G抗體
作為示蹤抗體與所述捕獲抗體/抗獨特型抗體複合物相接觸， c)測定各所述示蹤抗體與所述複合物的結合，由此確定所述抗獨特 型抗體的免疫球蛋白類別，
其中本發明的綴合物用作陽性對照。
此方法的圖解和示例性反應圖在圖1和2中給出。
優選所述示蹤抗體與所述捕獲抗體/抗獨特型抗體複合物接觸的順序 為i)抗人免疫球蛋白A抗體，ii)抗人免疫球蛋白E抗體，iii)抗人免疫 球蛋白M抗體，iv)抗人免疫球蛋白G抗體，即示蹤抗體與複合物依次接 觸。
優選所述捕獲抗體選自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區、Fab、 Fab，、 F(ab)2或F(ab，)2片段。
本發明還包含特異性結合抗IL-6R抗體CDR區的多克隆抗體。本發 明的多克隆抗體的製備方法在實施例la)中描述。
驟
a) 所述樣品在適合形成捕獲抗體/抗獨特型抗體複合物的條件下與 捕獲抗體相接觸，
b) 用選自抗人免疫球蛋白G抗體、抗人免疫球蛋白E抗體、抗人 免疫球蛋白M抗體、抗人免疫球蛋白A抗體的示蹤抗體與所述捕獲抗體/ 抗獨特型抗體複合物相接觸，
c) 測定所述示蹤抗體與所述複合物的結合，
d) 分解所述捕獲抗體/抗獨特型抗體複合物，
e) 用之前未選擇的示蹤抗體重複步驟a)至d)，
f) 確定所述抗獨特型抗體的免疫球蛋白類別為特異性結合所述捕獲抗體/抗獨特型抗體複合物的所述示蹤抗體的免疫球蛋白類別。
示蹤抗體優選選自抗人免疫球蛋白G抗體、或抗人免疫球蛋白E抗體、 或抗人免疫球蛋白M抗體、或抗人免疫球蛋白A抗體。
本申請中使用的術語"在適合形成[...l複合物的條件下"及其語法上的 等同語表示在這樣的M下當目的抗體/免疫球蛋白(例如抗獨特型抗體) 與二級抗體相接觸時會與其結合。這並不一定表示100 %的目的抗體都與 二級抗體結合，而是基本上100。/。的目的抗體與二級抗體結合，即至少85 %的目的抗體與二級抗體結合，優選至少90 %的目的抗體與二級抗體結
合，優選至少95%的目的抗體與二級抗體結合，更優選多於95%的目的 抗體與二級抗體結合。
提供下文的實施例和附圖以幫助理解本發明，本發明的真正範圍由隨 附的權利要求書闡明。應理解在不偏離本發明精神的情況下可以對列出的 方法做出修改。


圖1用任選的隨後亞類測定檢測樣品中的抗親本抗體的抗體的圖解。 圖2本發明的抗獨特型抗體亞類測定的BIAcoreSPR圖。(1)注入樣
品，(2) + (3)注入抗人免疫球蛋白E抗體，(4)注入抗人免疫球蛋白G抗體。
圖3用本發明的綴合物作為標準物並使用任選類別的特異性抗體的 圖解。
圖4用本發明的化合物作為標準物(一級反應)並使用任選的隨後抗標 準物免疫球蛋白亞類抗體(二級反應)的BIAcore SPR圖。 圖5抗獨特型抗體ELISA測定的圖解。 圖6測定抗獨特型抗體的ELISA標準曲線。
圖7用隨後的免疫球蛋白類別測定對抗親本抗體的抗體的結合區域 的多槽檢測的圖解。在下列實施例中使用針對IL-6受體的抗體只是為了舉例說明本發明， 而不是旨在限制本發明的範圍。
實施例1
製備與親本抗體的CDR區特異性結合的多克隆抗獨特型抗體和多克 隆Aj6l清免疫球蛋白E、 G、 A和M類的組合物。
抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體(抗-抗IL-6R-mAb pAb) i)製備4f對單克隆抗IL-6R抗體的多克隆抗體 從兔血清中純化多克隆抗體
才艮據標準方法用單克隆抗IL-6R抗體免疫兔。通過用珪膠(Aerosil) (1.5 。/。(w/v))脫脂除去五隻免疫的兔的原始血清中的脂質成份，用硫酸銨 (1.7 M)沉澱免疫球蛋白。經過酸處理(30分鐘，pH 5.5)和以補充有50 mM NaCl, pH7.0的15 mM磷酸鉀緩沖液透析之後，用DEAE離子交換層析 在pH 7.0分離混合物。免疫球蛋白G級分在流出液中(二兔抗-抗IL-6R-mAb pAb)，濃縮至約25mg/ml。
製備與針對IL-6R的親本抗體的CDR區特異性結合的兔抗-抗 IL-6R-mAb抗體
將之前步驟中濃縮的IgG級分轉移到補充有150 mM NaCl， pH 7.5 的50 mM磷酸鉀(PBS)緩衝系統中。用本領域現有技術將抗IL-6R抗體與 NHS-瓊脂糖綴合，製備具有固定化的抗IL-6R抗體(親本抗體)的免疫吸附 劑，將其填充到柱中，用補充有150 mM NaCl， pH 7.5的50 mM磷酸鉀
緩衝液平衡。
將10 mg濃縮的免疫球蛋白G級分/ml免疫吸附劑上樣至用PBS平衡 的柱上。用PBS、補充有0.05 % (w/v) Tween 20的0.5 M NaCl和30 mM NaCl相繼洗滌柱。用3 mM HC1和1 M丙酸洗脫特異性結合免疫吸附劑 的IgG。以PBS透才斤洗脫液。
為除去與人免疫球蛋白G(IgG)恆定區具有交叉反應性的抗體，將親和 純化的抗體上樣至具有固定化的人IgG的親和柱上，該親和柱用本領域現有技術將非特異性人IgG與NHS-瓊脂糖綴合製備得到。用PBS平衡該柱。 將約6 mg IgG/ml免疫吸附劑上樣至該柱上。期望的特異性多克隆IgG級 分在流出液中。用補充有0.05。/。(w/v)Tween⑧20的0.5MNaCl、 30 mM NaCl、 1 M丙酸和PBS令柱再生之後，重複兩次對與人IgG恆定區非特 異性結合的抗體的免疫吸附，以完全除去對人IgG具有交叉反應性的抗體。 將所得純化的對人IgG恆定區不具有交叉反應性的抗-抗IL-6R抗體 的多克隆抗體濃縮至約4 mg/ml ，儲存在-80 'C 。
ii)抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體與多複製人免疫球蛋白E、人免疫 球蛋白G、人免疫球蛋白A和人免疫球蛋白M的綴合
製備兔抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體(aa-IL-6R pAb)與人免疫球蛋白 G的綴合物
步驟1:製備兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150 mM NaCl， pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩衝液透析aa-IL-6R pAb，將蛋白質溶液調整至蛋白質濃度為約15 mg/ml。 ]\-琥珀醯亞胺-3-乙醯硫代丙酸酯(SATP)溶於DMSO,以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調整pH至pH 7.1，混合物在25。C孵育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應，以含有200 mM NaCl、 1 mM E1)TA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩衝液透析除去剩餘的SATP。
步驟2:製備人多複製人免疫球蛋白G-MH
以pH 7.4的30 mM磷酸鉀緩衝液透析多複製人抗體，而後將蛋白質 溶液調整至蛋白質濃度為約25 mg/ml。馬來醯亞胺己醯-N-羥基琥珀醯亞 胺酉旨(Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester ， MHS)溶於DMSO， 以l:6(IgG:MHS)的摩爾比加入至抗體溶液中。調整pH至pH7.1，混合物 在25匸孵育60分鐘。通過加入L-賴氨酸至終濃度為10 mM停止反應，調 整pH至pH 6.2，通過以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM 磷酸鉀緩衝液透析除去剩餘的MHS。
步驟3: aa-IL-6R pAb-SATP與多複製人免疫球蛋白G-MH的綴合通過用2 % (v/v)l M羥胺(hydroxylamine)， pH 7,5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去乙醯基為aa-IL-6R pAb-SH,在25。C孵育45分鐘。脫去 乙醯基的抗體與多複製人免疫球蛋白G-MH混合(摩爾比為 IgG-SH:IgG-MH = 1:3)，用含有200 mM NaCl、 lmMEDTA， pH 6.1的 10 mM磷酸鉀緩衝液稀釋至終濃度為1.5 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和4.5 mg/ml多複製人免疫球蛋白G-MH。調整pH至pH7.1，在25^孵育混合 物。用分析性凝膠過濾柱(例如TSK 3000)分析綴合過程。通常在45分鐘 後通過加入半胱氨酸至終濃度為1 mM停止綴合。再經過30分鐘孵育時間 後，加入終濃度為5 mM的N-曱基馬來醯亞胺(NMM)，並調整pH至pH 7.5。在25。C孵育60分鐘後，用S300^m過濾層析純化綴合物，除去未綴 合的抗體。
製備兔aa-IL-6R pAb與人免疫球蛋白M的綴合物 步驟1:製備兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150 mM NaCl， pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩衝液透析aa-IL-6R pAb，將蛋白質溶液調整至蛋白質濃度為約15 mg/ml。 N-琥珀醯亞胺-3-乙醯硫代丙酸酯(SATP)溶於DMSO，以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調整pH至pH 7.1，混合物在25。C孵育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應，以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM確酸鉀緩衝液透析除去剩餘的SATP。
步驟2:製備多複製人免疫球蛋白M-MH
以pH 7.4的30 mM磷酸鉀緩衝液透析多複製人抗體，而後將得到的 蛋白質溶液調整至蛋白質濃度為約20 mg/ml。馬來醯亞胺己醯-N-羥基琥 珀醯亞胺酯(MHS)溶於DMSO,以l:50(IgM:MHS)的摩爾比加入至抗體溶 液中。調整pH至pH 7.1 ，混合物在25°C孵育60分鐘。通過加入L-賴氨 酸至終濃度為10 mM停止反應。調整pH至pH 6.2,通過以含有200 mM NaC1、1 mM EDTA，pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩衝液透析除去剩餘的MHS。
步驟3: aa-IL-6R pAb-SATP與多複製人免疫球蛋白M-MH的綴合通過用2 % (v/v)l M羥胺，pH 7.5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去 乙醯基為aa-IL-6R pAb-SH,在25匸孵育45分鐘。脫去乙醯基抗體與多 複製人免疫球蛋白M-MH混合(摩爾比為aa-IL-6R pAb-SH:IgM-MH = 1:2)，用含有200mMNaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩衝 液稀釋至終濃度為約0.9 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和9.1 mg/ml多複製人免 疫球蛋白M-MH。調整pH至pH7.1，在25。C孵育混合物。用分析性i^ 過濾柱(例如TSK 5000)監測綴合過程。通常在60分鐘後通過加入半胱氨 酸至終濃度為1 mM停止綴合反應。再經過30分鐘孵育時間後，加入終濃 度為5 mM的N-曱基馬來醯亞胺(NMM)，並調整pH至pH 7.5。在25匸 孵育60分鐘後，用S400凝膠過濾層析純化綴合物，除去未綴合的抗體。
製備兔aa-IL-6R pAb與多複製人免疫球蛋白E的綴合物 步驟1:製備兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150 mM NaCl， pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩衝液透析aa-IL畫6R pAb,將蛋白質溶液調整至蛋白質濃度為約15 mg/ml。 N-琥珀醯亞胺-3-乙醯硫代丙酸酯(SATP)溶於DMSO,以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調整pH至pH 7.1,混合物在25X:醉育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應，以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩衝液透析除去剩餘的SATP。
步驟2:製備多複製人免疫球蛋白E-MH
以pH 7.4的30 mM磷酸鉀緩衝液透析多複製人抗體，將得到的蛋白 質溶液調整至最終蛋白質濃度為約13 mg/ml。馬來醯亞胺己醯-N-羥基琥 珀醯亞胺酯(MHS)溶於DMSO，以l:6(IgE:MHS)的摩爾比加入至抗體溶 液中。調整pH至pH7.1，混合物在25"C孵育60分鐘。通iti口入L-賴氨 酸至終濃度為10 mM停止反應，調整pH至pH 6.2，通過以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA,pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩衝液透析除去剩餘的MHS。 步驟3:兔aa-IL-6R pAb-SATP與多複製人免疫球蛋白E-MH的綴合 通過用2 % (v/v)l M羥胺，pH 7.5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去25。C孵育45分鐘。脫去乙醯基抗體與多 複製人免疫球蛋白E-MH混合(摩爾比為aa-IL-6R pAb-SH:IgE-MH = 1:1.7)，用含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA, pH 6.1的10 mM磷酸鍾緩 衝液稀釋至濃度為2.9 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和6.3 mg/ml多複製人免疫 球蛋白E-MH。調整pH至7.1，在25X:孵育混合物。用分析性^過濾 柱(例如TSK 4000)監測綴合過程。通常在90分鐘後通過加入半胱氨酸至 終濃度為1 mM停止綴合過程。再經過30分鐘孵育時間後，加入N-甲基 馬來醯亞胺(NMM)終濃度至5 mM，並調整pH至pH 7.5。在25。C孵育 60分鐘後，用S300凝膠過濾層析純化綴合物，除去未綴合的抗體。
製備兔aa-IL-6R pAb與多複製人免疫球蛋白A的綴合物 步驟l:製備兔aa-IL-6RpAb-SATP
以含有150 mM NaCl, pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩衝液透析aa-IL-6R pAb，將蛋白質溶液調整至蛋白質濃度為約15 mg/ml。 N-琥珀醯亞胺-3-乙醯硫代丙酸酯(SATP)溶於DMSO，以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調整pH至pH 7.1，混合物在25。C孵育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應，以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM鱗酸鉀緩衝液透析除去剩餘的SATP。
步驟2:製備多複製人免疫球蛋白A-MH
以pH 7.4的30 mM砩酸鉀緩衝液透析多複製人抗體，將得到的蛋白 質溶液調整至最終蛋白質濃度為約13 mg/ml。馬來醯亞胺己醯-N-羥基琥 珀醯亞胺酉旨(MHS)溶於DMSO，以l:6(IgA:MHS)的摩爾比加入至抗體溶 液中。調整pH至pH7.1，混合物在25X:孵育60分鐘。通過加入L-賴氨 酸至終濃度為10 mM停止反應，調整pH至pH 6.2，通過以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA, pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩衝液透析除去剩餘的MHS。 步驟3:兔aa-IL-6R pAb-SATP與多複製人免疫球蛋白A-MH的綴合 通過用2 % (v/v)1 M羥胺，pH 7.5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去 乙醯基為aa-IL-6R pAb-SH，在25。C賻育45分鐘。脫去乙醯基抗體與多複製人免疫球蛋白A-MH混合(摩爾比為aa-IL-6R pAb-SH:IgA-MH = 1:2)，用含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩衝 液稀釋至濃度為2.9 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和6.3 mg/ml多複製人免疫 球蛋白A-MH。調整pH至7.1,在25'C孵育混合物。用分析性凝膠過濾 柱(例如TSK 4000)監測綴合過程。通常在90分鐘後通過加入半胱氨酸至 終濃度為1 mM停止綴合過程。再經過30分鐘孵育後，加入終濃度為5 mM 的N-曱基馬來醯亞胺(NMM)，調整pH至pH 7.5。在25C孵育60分鐘後， 用S300凝膠過濾層析純化綴合物，除去未綴合的抗體。
實施例2
將生物素化的抗IL-6R抗體偶聯到鏈黴抗生物素蛋白包被的晶片上 抗IL-6R抗體用緩衝液透析(100mM磷酸鉀緩衝液，pH8.5)。之後將 溶液調整至蛋白質濃度為10 mg/ml。 D-生物素-氨基己酸-N-羥基琥珀醯亞 胺酯溶於DMSO，以1:5的摩爾比加入至抗體溶液中。60分鐘後通過加入 L-賴氨酸停止反應。通過以補充有150 mM氯化鈉，pH 7.5的25 mM砩 酸鉀緩衝液透析除去剩餘的標記試劑。
第一步，用NHS-EDC混合物活化CM5晶片流動池(flow cell)的表 面。表面活化後，注入100ng/ml的中性鏈親和素(Neutravidin)溶液(用pH 4.5的緩衝液稀釋；Pierce),以使其與活化的表面酯之間得以形成共價鍵。 然後，通過注入lM乙醇胺實現剩餘的未偶聯的酯的失活。將生物素化的 抗體注入單個流動池，以20 pl/分鐘的流速和20照/ml的濃度流動5分鐘。 這使得抗體固定到流動池上。
實施例3
檢測Ajk清中的IgG類抗-抗IL-6R抗體的抗體
將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 pl的體積、流速20 inl/分鐘注 入到如實施例2中製備的晶片上。注入樣品之後，抗IgG類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白G抗體以20 pl/分鐘的流速和20 jig/ml的濃度注入。最後，開始時測量標準樣 品。20 pi兔抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體(aa-IL-6R pAb)與人IgG的綴 合物作為陽性標準，以流速20 inl/分鐘注入到具有固定化的抗IL-6R抗體 完整抗體、F(ab，)2片段，和/或Fc片段的免疫原性晶片上。標準注射之後， 任選地以相同流速注入抗IgG類抗體即單克隆抗人免疫球蛋白G抗體。
實施例4
檢測人血清中的IgE類抗-抗IL-6R抗體的抗體
將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 |nl的體積、流速20 pl/分鐘注 入到如實施例2中製備的晶片上。注入樣品之後，抗IgE類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白E抗體以20 pl/分鐘的流速和20 ng/ml的濃度注入。最後， 進行一次再生溶液(100 mM HbP04)的注射。在各測量開始時測量標準樣 品。20 pi兔aa-IL-6R pAb與人IgE的綴合物作為陽性標準，以流速20 p1/ 分鐘注入到具有抗IL-6R抗體的固定化完整抗體、F(ab，)2片段，和/或Fc 片段的免疫原性晶片上。標準注射之後，任選地以相同流速注入抗IgE類 抗體即單克隆抗人免疫球蛋白E抗體。
實施例5
檢測人血清中的IgM類抗-抗IL-6R抗體的抗體
將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 jal的體積、流速20 jal/分鐘注 入到如實施例2中製備的晶片上。注入樣品之後，抗IgM類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白M抗體以20 nl/分鐘的流速和20 pg/ml的濃度注入。最後， 進行一次再生溶液(100 mM H3P04)的注射。在各測量開始時測量標準樣 品。20 pl兔aa-IL-6R pAb與人IgM的綴合物作為陽性標準，以流速20 p1/ 分鐘注入到具有抗IL-6R抗體的固定化完整抗體、F(ab，)2片段，和/或Fc 片段的免疫原性晶片上。標準注射之後，任選地以相同流速注入抗IgM類 抗體即單克隆抗人免疫球蛋白M抗體。實施例6
檢測人血清中IgE、 IgG和IgM類抗-抗IL-6R抗體的抗體 將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 pl的體積、流速20 inl/分鐘注 入到如實施例2中製備的晶片上。注入樣品之後，抗IgE類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白E抗體以流速20 jtU/分鐘和20 jig/ml的濃度注入。注射之 後，記錄反應。之後抗IgM類抗體即單克隆抗人免疫球蛋白M抗體以20 p1/ 分鐘的流速和20照/ml的濃度注入。注射之後，記錄反應。之後抗IgG類 抗體即單克隆抗人免疫球蛋白G抗體以流速20 n!/分鐘和20照/ml的濃度 注入。注射之後，記錄反應。最後，進行一次再生溶液(IOO mM H3P04) 的注射。在各測量開始時測量所述的三種標準樣品(綴合物)。標準物1: 20 nl 兔aa-IL-6R pAb與人IgM的綴合物作為陽性標準，注入到免疫原性晶片 上；標準物2: 20 pl兔aa-IL-6R pAb與人IgE的綴合物作為陽性標準注入 到免疫原性晶片上；標準物3: 20 pl兔aa-IL-6R pAb與人IgG的綴合物作 為陽性標準注入到免疫原性晶片上。
實施例7
用標準綴合物對IgE類抗親本抗體進行ELISA測定 第一步，將生物素化的針對IL-6受體(親本抗體)的抗體結合到鏈黴抗 生物素蛋白包被的微量滴定板(SA-MTP)的孔表面上。用廣域緩衝液洗滌除 去未結合的抗體。之後，將樣品和參考標準物(綴合多複製人IgE的針對抗 IL-6受體抗體的兔抗體)加入不同孔中並孵育。來自樣品的抗親本抗體和參 考標準物分別與固定化親本抗體結合。洗滌步驟之後，結合的抗親本抗體 和參考標準物分別用洋地黃毒苷化的針對人IgE的抗體進行檢測，而後與 辣根過氧化物酶標記的抗洋地黃毒香抗體孵育。抗體-酶綴合物催化ABTS 底物的顯色反應。用ELISA讀板器在波長405 nm處(參考波長490 nm ) 測量信號。以一式三份測定各血清樣品的吸光值。標準物獲得陽性信號， 在抗親本抗體為IgE亞類的情況下，樣品也得到陽性信號(圖5和6)。
權利要求
1.綴合物，其包含與單克隆治療性抗體的CDR區特異性結合的抗獨特型抗體和屬於單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白，其中所述參考免疫球蛋白為人免疫球蛋白或人免疫球蛋白的Fc區。
2. 權利要求1所述的綴合物，其特徵在於所述參考免疫球蛋白不與所 述抗獨特型抗體特異性結合，且不與所述治療性抗體特異性結合。
3. 權利要求1所述的綴合物在免疫測定中作為標準物或陽性對照的用 途，所述免疫測定用於測定樣品中抗親本抗體的抗體。
4. 權利要求3所述的用途，其特徵在於所述免疫測定為包含捕獲抗體 和示蹤抗體的夾心免疫測定法，其中捕獲抗體或示蹤抗體為所述親本抗體。
5. 權利要求3或4所述的用途，其特徵在於所述抗親本抗體的抗體為 針對所述親本抗體的抗獨特型抗體。
6. 權利要求3至5中任一項所述的用途，其特徵在於所述捕獲抗體選 自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區、Fab、 Fab，、 F(ab)2或F(ab，)2片段。
7. 測定樣品中與親本抗體的CDR區特異性結合的抗獨特型抗體的免 疫球蛋白類別的方法，所述方法使用包含捕獲抗體和示蹤抗體及本發明的 綴合物的夾心免疫測定法，所述方法包含下列步驟a) 所述樣品在適合形成捕獲抗體/抗獨特型抗體複合物的條件下與 捕獲抗體接觸，b) 分別以i) 抗人免疫球蛋白A抗體，ii) 抗人免疫球蛋白E抗體，iii) 抗人免疫球蛋白M抗體，和iv) 抗人免疫球蛋白G抗體作為示蹤抗體與所述捕獲抗體/抗獨特型抗體複合物接觸，c) 測定所述示蹤抗體與所述複合物的結合，由此確定所述抗獨特型 抗體的免疫球蛋白類別，其中權利要求1所述的綴合物用作陽性對照。
全文摘要
本發明報導了包含綴合物的組合物以及所述組合物在免疫測定中作為標準物的用途，所述綴合物為特異性結合親本抗體CDR區的抗獨特型抗體和E、G、M或A類多複製人血清免疫球蛋白的綴合物。
文檔編號C07K16/42GK101541835SQ200780042996
公開日2009年9月23日 申請日期2007年11月19日 優先權日2006年11月21日
發明者K-G·施圖本拉赫, R·福格爾, U·韋塞爾斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司