抗LewisY抗獨特型抗體及其用途的製作方法

2023-09-19 09:57:35 3

專利名稱：抗Lewis Y抗獨特型抗體及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，更特別地涉及抗體。
背景技術：
25年前單克隆抗體(mAb)技術的出現提供了大量有用的研究試劑並且創造了使用抗體作為癌症治療、自身免疫失調、移植排斥、抗病毒預防中的批准試劑以及作為抗血栓藥的機會(Glennie and Johnson2000)。運用分子工程將鼠mAbs轉變成嵌合mAbs(小鼠V-區域，人C-區域)和人源化試劑，其中只有鼠源的mAb互補決定區(CDR)對mAb治療的臨床成功是關鍵的。工程化mAbs已經顯著降低或失去了免疫原性、增加了血清半衰期並且mAb的人Fc部分增加了募集補體和細胞毒性細胞的免疫效應物的能力(Clark 2000)。研究生物分布、藥物動力學和任何對臨床施用的mAbs的免疫應答誘導都需要開發分析法來辨別藥用和內源性蛋白質。
抗體通常是根據它識別的抗原來確定的。抗體對特定抗原的特異性是通過它的抗原結合位點決定的，該位點是與抗原接觸的抗體分子的獨特區域。這個位點是在免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區裡發現的。儘管如此，抗體也可以由其獨特型確定，獨特型是與單一特異性的抗體分子群的特有重鏈和輕鏈區域相關的獨特位或表面標誌的集合。抗體特有的抗原決定簇稱為獨特位，通過抗獨特位抗體與具有獨特位的抗體的反應來確定。獨特型是有用的標誌，因為它們使研究者能夠跟蹤在免疫應答和遺傳性免疫球蛋白基因中的特定抗體的出現和持續。獨特型也是能夠刺激抗獨特型抗體產生的唯一決定簇。
抗獨特型抗體結合其它抗體的可變區，在免疫系統中結合針對內部(自身)抗原所產生的抗體方面起著主要作用(Jerne 1974)。由誘導性獨特型抗體的可變區所引起的抗獨特型抗體可以是三類中的一種1)識別抗原結合位點中的表位(互補位)；2)在互補位附近結合併空間上幹擾獨特型抗體-抗原的相互作用；或者3)結構上模擬由獨特型抗體所識別的抗原(「內部影像」抗獨特型抗體)。已經生產了後一類抗獨特型並且作為疫苗研究，給出了它們在調節宿主對細菌、病毒和寄生感染外的腫瘤相關抗原的免疫應答方面的潛力(在(Bhattacharya-Chatterjee，Chatterjee et al.2001)中綜述)。齧齒動物抗獨特型抗體需要佐劑並綴合到載體，通常是匙孔血藍蛋白(KLH)上以引起免疫或抗腫瘤應答。
抗獨特型抗體也可用作免疫治療試驗中的酶聯免疫吸附測定(以下稱為ELISA)試劑，用於檢測所注射的獨特型抗體的患者血清水平或對所施用的獨特型抗體的免疫應答。這樣的免疫應答包括人抗小鼠抗體、人抗嵌合抗體、以及人抗人源化抗體(下文分別稱為HAMA、HACA、HAHA)。抗獨特型抗體NUH-82針對鼠mAb G250的結合位點，其識別人腎細胞癌上的G250抗原(Uemura，Okajima 1994)。已經證明NUH-82用於測定接受了cG250抗體放射免疫療法的患者中的HACA應答是有用的(Steffens，Boerman et al.1997)，更為近來NUH-82已經用於夾心式ELISA中，用於藥物動力學分析測定患者血清中cG250的血清水平(Liu，Smyth et al.2002)。
開發了hu3S193抗體用於靶向表達二巖藻糖基化糖抗原Lewis Y的上皮腫瘤，包括乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌(Kitamura，Stockert et al.1994；Scott，Geleick et al.2000)。Lewis Y是在例如肺癌、腸癌、乳腺癌、前列腺癌或卵巢癌來源的上皮腫瘤分子表面上表達的糖分子。Lewis Y抗原在正常組織中表達，但是在某些腫瘤類型中的表達水平更高，所以該抗原可用作一些乳腺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、十二指腸癌、肺癌、膀胱癌和腎癌以及胃和胰島細胞神經內分泌腫瘤的細胞標誌。與Lewis Y有關的抗原是免疫療法的很有吸引力的目標，這是由於它們在原發性和轉移性病變中高密度的和均一的表達(Kim，Yuan et al.1986；Sakamoto，Furukawa et al.1986；Zhang，Cordon-Cardo et al.1997)。
Hu3S193在體外引起強烈的ADCC和CDC，這顯示了其作為臨床前研究中所選實體腫瘤的免疫療法的前景(Clarke，Lee et al.2000b；Clarke，Lee et al.2000a)，目前處於I期劑量增加臨床試驗。臨床前的生物分布研究追蹤了引導hu3S193的放射性標記來評估乳腺癌動物模型中的穩定放射性綴合物的腫瘤靶向能力(Clarke，Lee et al.2000a)。在臨床中，可以用放射性標記來追蹤諸如hu3S193的mAbs以評估生物分布和腫瘤圖像、以及血清中的放射性綴合物的清除、作為mAb藥物動力學的測定(Clarke，Lee et al. 2000a；Scott，Geleick etal.2000；Hoffman，Scott et al.2001)。然而，在沒有臨床症狀時不能檢測到HAHA免疫應答。
假設hu3S193的免疫效應物功能，確定早期試驗中給予的抗體的血清水平將有助於將來治療方法的計劃並使得能夠確定未標記hu3S193的藥物動力學，同時測定HAHA的能力將有助於評估hu3S193的安全性。
特別地，本發明也涉及抗獨特型在免疫治療試驗中作為診斷試劑的用途，用於監測它們在患者循環中識別的所給予的獨特型的藥物動力學。類似地，抗獨特型可用作對所給予的獨特型mAb的HAHA、HACA或HAMA免疫應答的陽性對照。這樣的免疫應答可能對患者群體中的臨床結果沒有影響(Gruber，van Haarlem et al.2000)，或者可能與預防進一步治療的免疫治療mAb的藥物動力學和生物分布中的超敏反應和劇烈變化有關(Clark 2000)。
附圖簡述

圖1A-B抗hu3S193單克隆抗體LMH-1(●)、-2(△)、-3(◇)、以及抗hulgG-4(◇)的結合特異性由ELISA確定。檢查連續稀釋的雜交瘤培養物上清液結合到包被了A)hu3S193(圖1A)和B)hulgG(圖1B)的微量滴定板上的活性。也包括第二綴合物(▲)和單獨底物(o)的對照。用LMH-1、-2和-3、LMH-4觀察到的對hu3S193的特異結合證明了抗hulgG結合活性。
圖2.在克隆擴展之後，經ELISA對雜交瘤培養物上清液中和hu3S193抗原結合活性的能力進行三次檢查。平均值±標準差的結果證實了抗hu3S193mAbs、LMH-1、-2和-3的拮抗物活性，其阻斷了hu3S193結合到包被了合成Ley抗原的板上。
圖3A-D驗證LMH-2和LMH-3對3S193獨特位的特異性。圖3A.將蛋白質-A純化的LMH-3包被到ELISA板上，將10μg/mlhu3S193、mu3S193、BR55.2以及對照IgG1 mAbs huA33和muA33的三份連續稀釋樣品加入孔中以進一步表徵LMH-3的結合特異性。這個克隆的額外有利特徵是可以利用生物素化的LMH-3來檢測用LMH-3捕獲的被結合3S193mAb。圖3B.通過對hu3S193-Ley抗原結合的抗Ley和抗獨特型mAbs來防止結合到包被了Ley-四糖的板上的拮抗結合；圖3C.mu3S193-Ley抗原結合；以及圖3D.BR55.2-Ley抗原結合活性。
圖4A-C用於測定患者血清樣品中hu3S193的ELISA的開發。圖4A.在可得到抗獨特型之前的現有方法-用合成抗原Ley-BSA綴合物捕獲、用抗hulgG檢測，其證實了用hu3S193標準的低靈敏度和患者預輸注血清樣品中的高背景。圖4B.用抗hu3S193獨特型LMH-2捕獲並用LMH-2-生物素檢測。觀察到了很低的靈敏度。以及圖4C.用抗hu3S193獨特型LMH-3捕獲並用LMH-3-生物素檢測，證實了對血清中的3ng/ml hu3S193的最小背景和靈敏度。
圖5對hu3S193的血清HAHA應答的Biacore分析法進行優化，並使用抗獨特型LMH-3作為陽性對照來驗證。將hu3S193固定在生物傳感器晶片上，將抗獨特型mAb LMH-3(■)和人血清中的同種型匹配的對照抗體(▲)的三份連續稀釋物(μg/ml)從晶片上通過。
發明概述本發明涉及抗人源化抗Lewis Y單克隆抗體hu3S193的抗獨特型抗體。本發明也涉及由雜交瘤克隆產生的mAbs與hu3S193的可變區的特異性結合以及抗獨特型mAB抑制hu3S193結合到Lewis Y抗原的能力的ELISA篩選方法。
本發明也涉及用本發明的抗體來檢測HAMA、HACA和HAHA應答的方法。
本發明的一個方面是提供特異於抗Lewis Y單克隆抗體的抗獨特型抗體。本發明的另一方面是提供特異於抗Lewis Y抗體的抗獨特型抗體，其結合到抗Lewis Y單克隆抗體的可變區。類似地，本發明的另一方面是阻斷抗Lewis Y單克隆抗體結合的抗獨特型抗體。本發明的另一方面是提供特異結合hu3S193的抗獨特型抗體。特別地，本發明提供的抗獨特型抗體可選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或單鏈抗體。
本發明的另一方面是提供能夠產生特異於抗Lewis Y單克隆抗體的抗獨特型抗體的雜交瘤。本發明進一步的方面是提供特異於抗LewisY單克隆抗體的雜交瘤，其選自LMH-1、LMH-2和LMH-3。
本發明的另一方面是提供檢測抗獨特型抗體抑制抗體結合到抗原的能力的方法。本發明的另一方面是提供檢測抗獨特型捕獲並檢測被結合的獨特型抗體的能力的方法。本發明的另一方面是提供檢測抗獨特型抗體結合到獨特型抗Lewis Y抗體上的能力的方法。本發明的另一方面是檢測樣品血清中的抗體量的方法。
本發明包括通過ELISA測定血清樣品中的hu3S193的方法，其使用偶聯到BSA上的合成Lewis Y四糖作為捕獲hu3S193的抗原並使用商業上獲得的抗人抗體製劑作為被結合的hu3S193的檢測物。由在高背景中產生的第二抗hulgG抗體所檢測到的血清樣品hulgG的非特異結合極大限制了分析法的靈敏度。基於用抗獨特型NUH-82測定對cG250的HACA應答以及cG250血清水平的經驗，合適的抗獨特型hu3S193mAb的產生變得必要。
本發明也涉及使用本發明的抗體檢測HAMA、HACA和HAHA應答的方法。
發明詳述本發明提供特異於抗Lewis Y單克隆抗體的抗獨特型抗體。這些抗獨特型抗體特異於抗Lewis Y抗體，其結合到抗Lewis Y單克隆抗體的可變區。類似地，本發明的另一方面是阻斷抗Lewis Y單克隆抗體結合的抗獨特型抗體。本發明的另一方面是提供特異結合抗Lewis Y單克隆hu3S193的抗獨特型抗體。特別地，本發明提供的抗獨特型抗體可以選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或單鏈抗體。
另外，本發明提供能夠產生特異於抗Lewis Y單克隆抗體的抗獨特型抗體的雜交瘤。本發明進一步的方面是提供特異於抗Lewis Y單克隆抗體的雜交瘤，其選自LMH-1、LMH-2和LMH-3。
如這裡所使用的術語「人源化」抗體是指具有源自非人物種免疫球蛋白的CDR′s(互補決定區)並且抗體分子的其它部分主要源自人免疫球蛋白的分子。
如這裡所使用的術語「抗體」，除非另外指出，它被廣泛用於指抗體分子和各種抗體衍生的分子。這樣的抗體衍生的分子包括至少一個可變區(重鏈或輕鏈可變區)，包括分子例如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fd碎片、Fabc片段、Fd片段、Fabc片段、Sc抗體(單鏈抗體)、雙抗體、單獨的抗體輕鏈、單獨的抗體重鏈、抗體鏈和其它分子之間的嵌合融合體以及類似物。
這裡所使用的關於免疫球蛋白分子的術語「可變區」具有由免疫學普通技術人員給予該術語的通常意義。抗體重鏈和抗體輕鏈都可以分成「可變區」和「恆定區」。可變區和重鏈區的分隔點可以很容易由本領域普通技術人員根據描述抗體結構的標準文字來確定，如Kabatet al.″Sequences of Proteins of Immunological Interest5th Edition″U.S.Department of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office(1991)。
這裡所使用的術語「獨特型」表示能夠決定其對抗原的特異性的抗體分子片斷。獨特型位於Fab區，其表達通常需要組成抗原結合位點的重鏈和輕鏈的可變區的參與。
這裡所使用的術語「同種型」是指決定免疫球蛋白分子重鏈的類或亞類或者輕鏈的型和亞型的抗原。例如，IgG的四種同種型被命名為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
人源化抗Lewis Y單克隆抗體hu3S193特異性靶向Lewis Y上皮抗原。為輔助hu3S193的藥物動力學分析並確定對臨床施用的hu3S193的任何免疫應答，產生了抗獨特型hu3S193抗體並表徵為適合作為ELISA試劑，用於測定患者血清樣品中的hu3S193以及作為HAHA分析中的陽性對照。將用hu3S193免疫的來自小鼠的脾細胞與SP2/0-AG14漿細胞瘤細胞融合，由所得雜交瘤產生的抗獨特型抗體通過ELISA選擇與hu3S193的特異結合以及與Lewis Y抗原的競爭性結合。初步選擇出九個雜交瘤，其中三個命名為LMH-1、-2和-3的雜交瘤示出特異結合到hu3S193、以及與hu3S193競爭性結合Lewis Y抗原。hu3S193獨特位的識別是特異性的，如用抗Lewis Y單克隆抗體BR55.2和用其它非相關的人IgG、鼠IgG、人源化或嵌合單克隆抗體缺乏交叉反應性所證明。
產生了抗Lewis Y單克隆抗體hu3S193的小鼠單克隆抗獨特型，它們確定的特異性使得能夠選擇出特定的抗獨特型，用於臨床中監測藥物動力學和對所施用的hu3S193的免疫應答的分析。
產生了三種抗獨特型hu3S193抗體，命名為LMH-1、-2和-3，它們能夠特異結合hu3S193並抑制hu3S193和mu3S193的結合，但不抑制BR55.2與Lewis Y抗原的結合。也分離到了抗hulgG mAbLMH-4，證實了結合到所有被測試的嵌合人源化mAbs或純化的hulgG上的強活性。所有四種Abs都被確定為鼠IgG1 kappa同種型。雜交瘤LMH-3在滾瓶培養物中每ml培養上清液產生13μg純化的LMH-3，LMH-4產生15μg/ml，表明這些克隆經可以進行大規模生產。LMH-4具有在實驗室中作為檢測hulgG的試劑、或者在汙染了牛IgG的組織培養上清液的單克隆抗體的親和純化中作為試劑的潛力。BIAcore分析法確定了LMH-3對hu3s193很高的表現親和力，Ka＝4.76×108M-1(Kd＝2.10×10-9M)。這個親和力使得能夠開發高度可重複的、靈敏的、特異性的ELISA分析法，用於確定使用純化的LMH-3進行捕獲和生物素化LMH-3以進行檢測的hu3S193的血清濃度。通過BIAcore建立的血清樣品HAHA分析使用LMH-3作為患者血清中免疫應答定量的陽性對照是可能的，也可以使用這些抗獨特型通過腫瘤活組織檢查物的免疫組織化學分析來研究hu3S193對腫瘤細胞的滲透和結合。能夠同時結合靶抗體每個可變結構域的抗獨特型抗體的產生提供了高靈敏度的試劑，用於評估臨床施用的靶抗體的安全性和藥物動力學圖譜。已經產生了抗獨特型hu3S193mAbs，其作為診斷性實驗室試劑具有有意義的用途，用於研究來自接受了hu3S193免疫療法的患者的臨床樣品。
本發明的另一方面提供檢測抗獨特型抗體抑制抗體結合到抗原的能力的方法。本發明的另一方面提供檢測抗獨特型捕獲並檢測被結合的獨特型抗體的能力的方法。本發明的另一方面提供檢測抗獨特型抗體結合到獨特型抗Lewis Y抗體的能力的方法。本發明的另一方面是檢測樣品血清中的抗體量的方法。本發明也涉及用本發明的抗體檢測HAMA、HACA和HAHA應答的方法。
研究了兩種確定血清hu3S193水平的ELISA分析法。第一種分析法涉及捕獲合成的Lewis Y抗原；第二種採用抗獨特型抗體。比較了分析法的靈敏度和特異性，發現使用LMH-3的分析法較好，因為其比合成抗原具有更高的對hu3S193的親和力、沒有非特異性結合的低背景使其具有高靈敏度，能夠定量3ng/ml的血清hu3S193極限。BIAcore分析法確定了LMH-3對hu3S193的表觀結合親和力，Ka＝4.76×108M-1(Kd＝2.10×10-9M)。雜交瘤產生高水平的抗體LMH-3。
提供以下實施例是為了說明發明，不應被解釋為對發明的限定。
實施例實施例1細胞培養所有分析級試劑購自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO，USA)，除非另外指出。
SP2/0-Ag14漿細胞瘤細胞系購自美國典型培養物保藏中心(ATCC；Manassas，VA，USA)。SP2/0和所選雜交瘤克隆在標準RPMI-1640培養基中培養；它是含有10％熱滅活的胎牛血清(FCS，TRACE Biosciences Pty Ltd，Sydney，Australia)、100μg/ml鏈黴素、100U/ml青黴素(Gibco)和4mM L-穀氨醯胺的RPMI-1640培養基(Gibco Invitrogen Corp.，Mt Waverley，Victoria，Australia)。融合產物初始的少量傳代用上述含有20％FCS、青黴素、鏈黴素和L-穀氨醯胺的RPMI-1640來培養。使用HAT培養基來選擇雜交瘤；它是含有20％FCS、HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)、OPI(草醯乙酸鹽、丙酮酸鹽、胰島素培養基補充物)(Sigma)、青黴素、鏈黴素、L-穀氨醯胺的RPMI-1640培養基。對於雜交瘤擴展，在HT培養基中培養細胞；它是含有20％FCS、HT(次黃嘌呤、胸腺嘧啶)、青黴素、鏈黴素、L-穀氨醯胺的RPMI-1640培養基。
實施例2用於免疫和篩選的抗體人源化抗Lewis Y IgG1抗體hu3S193(批號D01097，10mg/mlPBS)、鼠3S193(mu3S193)、對照的同種型匹配人源化mAb huA33(批號5GMA3310mg/ml)以及無關的同種型匹配的小鼠人嵌合IgG1抗體由 Biological Production Facility，Ludwig Institute for CancerResearch，Melbourne，Australia提供。純化的人IgG購自SigmaChemical Co.。根據廠商說明(Pierce，Rockford，IL，USA)用固定化的胃蛋白酶消化來製備F(ab)′2片段，由未消化的hu3S193和含有Fc的片斷通過1ml蛋白質-A柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)來純化。純化的片斷在Millipore離心濾器(Biomax 10k membrane，Millipore，Sydney，Australia)中濃縮到1mg/ml。
實施例3免疫方案購自Breeding Facility，Walter and Eliza Hall Institute，Melbourne，Australia的六到八周齡的雌性BALB/c小鼠用不限量提供的食物和水餵養。所有用於這個研究的對動物執行的步驟都經Austin and Repatriation Medical Centre的動物倫理委員會批准。從每個動物收集預免疫靜脈血樣品(200μl)，在室溫凝結1小時，4℃過夜。收集所得血清(約100μl/小鼠)並在-20℃下貯存。
用六隻小鼠進行免疫步驟。第0天通過腹膜內注射200μl含有40μg純化的hu3S193完全弗氏佐劑(1∶1，v∶v)免疫BALB/c小鼠。小鼠在第14和28天接受加強注射含有40μg hu3S193的不完全弗氏佐劑。在第35天，從尾部靜脈收集免疫後的血樣，小鼠抗hu3S193抗體的血清滴度由ELISA確定。包括了作為對照的預免疫血清樣品。在最後靜脈內單獨加強注射含40μg hu3S193後的4天的三個時候處死小鼠。無菌收集脾臟放入5ml PBS/G中，製備用於融合的脾細胞懸浮液。
實施例4融合和雜交瘤產生所有步驟都在室溫下進行並基於以前公開的方法(12)。收集脾細胞並用RPMI-1640培養基清洗3次，確定細胞濃度。同時收穫融合配偶體SP2/0細胞，在無血清培養基中清洗並計數。將每個細胞沉澱重懸浮在5ml無血清RPMI中，然後在50ml管中以5∶1的脾細胞SP2/0比例組合。在300xg離心細胞混合物10分鐘，通過輕輕敲打使所得細胞沉澱逐漸碎裂。試管在37℃的水浴中溫育，在1分鐘時間內逐滴加入培養基(1ml)中的50％PEG。然後在2分鐘時間內加入預熱的無血清RPMI(2ml)，然後在3分鐘時間內加入8ml培養基。在300xg下將細胞離心10分鐘，然後輕輕地重懸浮在HAT培養基中(60ml HAT培養基/小鼠脾，含有約1×105脾細胞、2×104SP2/0骨髓瘤細胞)。混合的細胞懸浮液分成小份(100μl/孔)到六個96孔組織培養板(Falcon；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)中，在溼潤的5％CO2/空氣培養箱中於37℃培養。
實施例5單克隆抗體選擇雜交瘤培養物上清液經ELISA篩選與hu3S193mAb和純化的人IgG的陽性結合活性。所選克隆在24孔培養板(Falcon)中擴展，它們的結合活性和競爭性結合活性經ELISAs進一步表徵。用小鼠單克隆抗體同種型試劑盒(IsoStrip，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)來確定培養物上清液中所選抗獨特型hu3S193抗體的亞類。
實施例6經有限稀釋克隆雜交瘤初次稀釋系列。所選雜交瘤克隆以100細胞/孔的密度鋪板到96孔板的內部60個孔中的200μl HAT培養基中。外部孔用含有抗生素的RPMI-1640培養基填滿以防止脫水以及HAT培養基/含有細胞的孔的濃縮。當細胞的生長差不多匯合時(約7天)，收集上清液並測試對hu3S193的特異結合以及Lewis Y抗原對hu3S193的拮抗結合。選擇陽性克隆用於繼續的分析和克隆。
第二次稀釋系列。這個步驟的目的是建立由單個細胞長成的雜交瘤，以及利用了脾細胞飼養層的培養。從未免疫的BALB/c小鼠製備脾細胞，重新懸浮在補充了100mM 2-巰基乙醇的106細胞/ml的HAT培養基中，在無菌環境中室溫溫育過夜以確保沒有汙染物感染。第二天只使用板的內部60個孔來製備兩個96孔微量滴定板用於每個所選克隆，如之前所描述的一樣。分成小份(100μl)的HAT培養基被加入到第1排，將脾細胞懸浮液加入到2-6排(105細胞/孔)，板在37℃下溫育過夜。所選細胞在HAT培養基中稀釋，分別將100μl含有100、10、5、1、或0。5細胞的小份加入2到6排含有飼養細胞的孔中。板在37℃下溫育10-14天，從接種1或0.5細胞/孔的孔選擇克隆集落。
第三次稀釋系列。為確保所選克隆是源自單個細胞的，所有所選細胞系都重複第二次稀釋步驟一輪。擴展優選的細胞系並製備儲液，然後在液氮下貯存。
實施例7抗體生產產生雜交瘤的所選出的並再克隆的抗獨特型抗體在滾瓶(Corning，Corning Incorporated，NY，USA)中培養，無菌收穫培養物上清液。抗獨特型抗體的純化通過在5ml蛋白質-A瓊脂糖快速流動柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)親和層析進行，柱在pH 8的50mM Tris-HCl(緩衝液A)中預平衡。在用20倍柱體積的緩衝液A清洗之後，用100mM含有200mM NaCl的甘氨酸-HCl、pH 2.7洗脫被結合的抗體，立即用1M的Tris-HCl、pH 8中和。4℃下在PBS中透析過夜後，用離心濾器(Millipore，Biomax 10k膜)濃縮抗體。在還原和非還原條件下經SDS-PAGE檢查純度。通過考馬斯亮藍染色觀測蛋白質。根據廠商說明(Amersham PharmaciaBiotech.)用ECL蛋白質生物素化模塊試劑盒製備生物素化的抗獨特型抗體。
實施例8ELISA分析結合特異性雜交瘤上清液或純化的抗獨特型抗體的結合特異性經ELISA分析表徵。用hu3S193(100μl，4.0μg/ml)、純化的人IgG或碳酸鹽緩衝液(0.05M，pH 9.6)中的其它對照單克隆抗體包被96孔板(NuncMaxiSorp，Roskilde Denmark)，4℃過夜。在室溫(23℃)用3％BSA/PBS阻斷非特異性結合2小時。製備上清液或純化的抗體的連續稀釋物(1∶2-1∶6300)，將100μl的小份加入每個孔中。每次分析中包括陽性(hulgG)和陰性(單獨的綴合物和底物)對照。室溫下將板溫育1小時，用0.05％Tween 20/PBS清洗三次，然後用第二抗體(綴合鹼性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG)(100μl/孔，1∶3000稀釋在1％BSA/PBS))溫育1小時。用發色團底物磷酸對-硝基苯酯底物(ICN Biomedicals Inc.，Aurora，Ohio，USA)檢測被結合的抗體。用Vmax動力學微量滴定板讀數器(Molecular Devices Corporation，Sunyvale，California)測定450nm下的光密度。
實施例9ELISA分析拮抗活性測試了所選抗獨特型抗體阻斷hu3S193mAb結合到包被Lewis Y-抗原的板上的能力。可得到以約32∶1的摩爾比偶聯到BSA上的合成Lewis Y四糖(Alberta Research Council，Edmonton，Alberta，Canada)。用Lewis Y-BSA抗原(50μl，3.0μg/ml PBS)包被ELISA板(Nunc MaxiSorp)，並在4℃溫育過夜。用3％BSA/PBS在室溫下阻斷板上的非特異性結合2小時。將半對數連續稀釋的樣品(上清液或純化的抗獨特型mAbs)加入到每個孔中，接著加入hu3S193mAb(50μl；1μg/ml的終濃度)。室溫溫育1小時後，用山羊抗人IgG-HRP來檢測被結合的hu3S193mAb，在大量清洗之後用ABTS底物(2，2′-連氮基-雙-(3-乙基-苯並噻唑啉-6-磺酸；100μl，40pM/孔；ICN)進行觀測。用Vmax動力學微量滴定板讀數器在415nm下讀取光密度(OD)。
實施例10抗獨特型對Hu3S193的特異性用hu3S193和鼠mAbs mu3S 193以及BR55.2(Ludwig Institute forCancer Research，New York)hu3S193進一步檢查純化的所選克隆結合抗Lewis Y mAbs的特異性。用兩種ELISAs檢查特異性。第一種利用抗獨特型捕獲並檢測被結合的獨特型mAb，第二種檢查抗獨特型mAb結合溶液中的獨特型抗Lewis Y mAbs和抑制Lewis Y抗原結合的能力。
對於第一種分析方法，用所選抗獨特型mAb包被ELISA Maxisorp板在4℃下過夜(100μl 4μg/ml 0.05M碳酸鹽緩衝液，pH9.6)。用3％FCS/PBS阻斷後，將10μg/ml hu3S193、mu3S193、BR55.2以及對照無關mAbs huA33和muA33的連續稀釋的三份樣品加入孔內，然後室溫溫育1小時。清洗之後，用生物素化的抗獨特型mAb檢測被結合的mAb(LMH-3-Bt；100 μl/孔、4μg/ml，在1％FCS/PBS中，4℃過夜)。為檢測被結合的複合物，在加入抗生物素蛋白鏈菌素-HRP(在1％FCS/PBS中1∶1000稀釋，100μl/孔)之後通過ABTS產生顏色。如之前所描述的一樣測定OD415。
對於第二種特異性測試，用合成Lewis Y-BSA抗原(4.0μg/ml，在PBS中，4℃過夜)包被三個ELISA板。然後將連續稀釋的抗Lewis YmAbs分成小份到板的每排；板1，hu3S193；板2，mu3S193；板3，BR55.2，終濃度範圍(0.003-1oμg/ml)。為測試對Lewis Y抗原的競爭結合，加入其它兩種抗Lewis Y mAbs和兩種抗獨特型mAbs各兩份(終濃度10μg/ml)，然後室溫溫育1小時。清洗之後，使用抗hulgG-HRP(Sigma；100μl，1∶1000於1％FCS/PBS中)、然後通過ABTS產生顏色並測定A415nm來檢測板1中被結合的hu3S193。用山羊抗mIgG-鹼性磷酸酶和對硝基苯酚發色團在A405測定來檢測板2上被結合的mu3S193和板3上的BR55.2。
實施例11血清中的Hu3S193的ELISA測定開發了兩種ELISA分析法來檢測血清樣品中的hu3S193mAb。對於第一種分析法，利用合成Lewis Y-BSA抗原(3.0μg/ml於PBS中，50μl/孔)捕獲hu3S193。在與健康供體血清或3％BSA/PBS中的hu3S193連續稀釋樣品溫育之後，用山羊抗人IgG-HRP第二抗體和ABTS底物來檢測結合到抗原上的hu3S193mAb的量。
第二種分析法涉及用抗獨特型抗體包被和用生物素化的抗獨特型抗體檢測。用抗獨特型hu3S193抗體(3.0μg/ml於0.05M碳酸鹽緩衝液中，pH 9.6，100μl/孔)包被板，4℃過夜，然後用3％BSA/PBS室溫(23℃)阻斷2小時。將3％BSA/PBS或健康供體血清中的hu3S193連續稀釋樣品(0.0315-10μg/ml)三份加入板中，並室溫溫育1小時。清洗之後，加入生物素化的抗獨特型hu3S193抗體(100μl3μg/ml於1％BSA/PBS中)，並室溫溫育1小時。為檢測被結合的複合物，加入抗生物素蛋白鏈菌素-HRP(1∶1000在1％BSA/PBS中稀釋，100μl/孔)之後通過ABTS產生顏色。如前面所述的一樣測定OD415。
生物傳感器分析法用包被了羧甲基葡聚糖的傳感器晶片(CM5)上的BIAcore 2000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)進行生物傳感器分析。用標準NHS/EDC胺偶聯化學法，用通道2上的hu3S193、通道3上的LMH-3以及通道4上偶聯到牛血清白蛋白(Alberta ResearchCouncil，Edmonton，Canada)上的Lewis y四糖來衍生化晶片。hu3S193和LMH-3的樣品在HBS緩衝液(10mMHEPES，pH7.4；150mMNaCl；3.4mM di-Na-EDTA；0.005％Tween-20)中稀釋，將小份(30μl)以5μl/分鐘的流速注射到傳感器晶片表面上。注射階段後，通過在晶片表面上流過HBS緩衝液300秒來檢測解離。將被結合的抗體洗脫，在加樣之間通過注射pH為2.7的20μl100mM甘氨酸/100mM NaCl來再生晶片表面。對於結合的動力學分析，將不同濃度的hu3S193和LMH-3注射到傳感器晶片表面。使用二價分析物模型來計算表觀締合速度常數(ka)和表觀解高速度常數(kd)，使用BIAevaluation v3.0軟體(Pharmacia Biosensor，Uppsala，Sweden)經整體和局部擬合來計算Rmax。
患者對施用的單克隆抗體的免疫應答可通過對患者血清的Biocore分析來評估(Ritter，Cohen et al.2001)。抗獨特型抗體在這些分析中作為陽性對照試劑是有用的。因此，將LMH-3加入健康供體血清中(3-50μg/ml)，驗證了對固定化的hu3S193的結合應答。
實施例12小鼠免疫和雜交瘤克隆選擇重複用hu3S193mAb免疫三組BALB/c小鼠，分析其血清中的小鼠抗hu3S193mAb活性。血清樣品免疫前和免疫後的免疫活性表明了高滴度小鼠抗完整的和F(ab)′2hu3S193mAbs的發展。用同種型對照人源化IgG(huA33)或嵌合IgG F(ab)′2包被的板也顯示出強陽性結合(結果未顯示)。處死小鼠並取出它們的脾。脾細胞和融合配偶體Sp2/0漿細胞瘤細胞進行融合，篩選來自這三個融合的雜交瘤。只有證實了對hu3S193mAb的強結合活性、但是對對照huA33或純化的人IgG弱結合或沒有結合的3-4孔被選擇並擴展。擴展之後，用ELISA分析法進一步測試抗體特異性(圖1)。在從第一個融合選擇克隆期間，使用三種對照人源化或嵌合抗體。因為用包被了純化的人IgG的板通常觀察到了交叉結合活性，所以在隨後的篩選中，除了hu3S193外，主要使用純化的人IgG。
實施例13所選抗獨特型抗體的結合和阻斷活性進一步分析所有所選雜交瘤的結合和拮抗活性以識別產生抗獨特型hu3S193抗體的雜交瘤。從每個雜交瘤培養物上清液製備半對數連續稀釋物，並通過ELISA進行評價。在最初選擇的12個克隆中，識別出三個能夠結合hu3S193、但是不能結合hulgG並抑制hu3S193結合到Lewis Y抗原(圖1)。這些雜交瘤F1-1、F2-3和F3-27是通過有限稀釋從單個細胞克隆的，分別命名為Ludwig Institute for CancerResearch Melbourne Hybridoma(LMH)-1、LMH-2和LMH-3。這些克隆之一(FS2-1)證實了對所有測試的嵌合人源化mAbs或純化hulgG的強抗hulgG結合活性(圖1)，隨後被用作hulgG結合的陽性對照。該克隆是從單個細胞製備的，被稱為LMH-4。LMH-1到-4抗體經小鼠單克隆抗體同種型分析試劑盒識別為同種型IgG1ê，通過蛋白質-A親和層析從培養物上清液純化。這四個克隆的結合特異性通過ELISA確認(圖4A-C)。沒有觀察到LMH-1、-2或-3與hulgG恆定鏈的交叉反應性(圖4B)，所有三種抗體僅特異結合hu3S193mAb(圖4A)。通過競爭性ELISA分析法來分析這些抗體的拮抗活性。LMH-1、-2和-3抗hu3S193獨特型抗體以劑量依賴性方式結合hu3S193mAb並抑制hu3S193mAb對Lewis Y抗原的結合(圖2)。
實施例14抗體結合親和力的確定用於固定化hu3S193與溶液中的LMH-3相互作用的生物傳感器結合實驗的表現親和力確定的Ka為4.76×108M-1(Kd＝2.10×10-9M)。在用晶片表面上固定化的LMH-3進行的交互實驗中，流過表面的hu3S193作為分析物，確定的Ka為9.12×108M-1(Kd＝1.10×10-9M)。
實施例15抗獨特型對Hu3S193的特異性克隆LMH-2和LMH-3對3S193獨特型的特異性在這些實驗中得到驗證(圖5)。將蛋白質-A純化的LMH-3包被到ELISA板上，將10μg/ml hu3S193、mu3S193、BR55.2和對照IgG1 mAbs huA33和muA33的連續稀釋的三份樣品加入孔中以進一步表徵LMH-3的結合特異性。這個克隆的另一額外的有利特徵是，可以利用生物素化的LMH-3來檢測用LMH-3捕獲的被結合3S193mAb。ELISA結果(圖3A)表明，LMH-3特異性結合抗Lewis Y 3S193獨特型，沒有檢測到與鼠抗Lewis Y BR55.2的反應，並且與對照muA33和huA33的鼠和人IgG1恆定結構域沒有交叉反應。hu3S193和mu3S193對Lewis Y抗原的結合在溶液中被10μg/ml LMH-2和LMH-3有效競爭，但是抗獨特型結合位點一旦飽和，就現察到了一些hu3S193和mu3S193對抗原的結合(分別是圖3B和3C)。儘管更高親和力的mu3S193完全阻斷hu3S193結合到Lewis Y抗原上，除了在最高濃度(10μg/ml)外，鼠BR55.2mAb會實現一些競爭性結合(圖3B)。在板2的交互實驗中，當mu3S193首先加入孔中時，更低親和力的hu3S193不能競爭Lewis Y抗原(圖3C)。板3的結果(圖3D)證實了BR55.2對LewisY抗原的結合不能被hu3S193或抗獨特型克隆LMH-2和-3競爭或抑制。因此確認了這些克隆對3S193獨特型的特異性。圖3B中觀察到的BR55.2競爭可能是通過高親和結合到它的不同Lewis Y表位的位阻來實現的。
實施例16用於臨床樣品中Hu3S193測定的ELISA分析法的開發第一種研究的ELISA分析法採用合成抗原(Lewis Y四糖-BSA綴合物)來捕獲血清中的hu3S193，並用綴合了過氧化物酶的第二山羊抗人IgG來檢測。合成Lewis Y抗原具有對hu3S193mAb比較低一些的親和力，這會降低分析法的靈敏度，如記錄的低光密度值所顯示的。第二綴合抗體檢測所有的人免疫球蛋白，因此觀察到了所有分析樣品的高背景(圖4A)。高背景幹擾顯著降低了分析法的靈敏度和準確性，特別是對於低血清hu3S193濃度來說。第二種ELISA分析法使用純化的抗獨特型hu3S193抗體LMH-1、2和-3來包被，生物素化的LMH-1、-2或-3作為第二抗體，用抗生物素蛋白鏈菌素-HRP和ABTS底物來觀測結合的複合物。LMH-1和LMH-2抗獨特型抗體顯示出在血清或3％BSA/PBS中對mu3S193mAb的強結合，但是對hu3S193mAb弱結合。然而沒有觀察到與對照抗體，包括人源化mAb、嵌合mAb、鼠mAb、人血清中的Ig或小鼠血清中的Ig(圖4B)的交叉結合活性。研究嘗試了通過改變包被抗體或第二抗體的濃度、以及使用不同的包被緩衝液來優化或改進具有LMH-1和LMH-2的ELISAs。一些改進已經實現，但是沒有實現對應答模式的改變(數據未顯示)。然而使用LMH-3抗獨特型mAb來捕獲、LMH-3-生物素作為第二抗體，在具有最小非特異性背景活性的血清中觀察到了hu3S193和mu3S193mAbs的特異性強結合(圖4C)。高度可重複的分析法證明了極好的靈敏度，對血清樣品中的hu3S193或mu3S193mAbs的檢測極限是3ng/ml。
免疫應答的BIOCore分析用抗獨特型LMH-3對於hu3S193開發了血清中HAHA的測定。建立並驗證了靈敏的且可重複的方法(圖5)。
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權利要求
1.抗獨特型抗體，其針對抗Lewis Y單克隆抗體。
2.權利要求1的抗獨特型抗體，其結合到抗Lewis Y單克隆抗體的可變區上。
3.權利要求1的抗獨特型抗體，其阻斷抗Lewis Y單克隆抗體的結合。
4.權利要求1的抗獨特型抗體，其特異結合hu3S193。
5.權利要求1的抗獨特型抗體，其選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或單鏈抗體。
6.權利要求2的抗獨特型抗體，其選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或單鏈抗體。
7.權利要求3的抗獨特型抗體，其選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或單鏈抗體。
8.權利要求4的抗獨特型抗體，其選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或單鏈抗體。
9.能夠產生權利要求1的抗獨特型抗體的雜交瘤。
10.能夠產生權利要求2的抗獨特型抗體的雜交瘤。
11.能夠產生權利要求3的抗獨特型抗體的雜交瘤。
12.能夠產生權利要求4的抗獨特型抗體的雜交瘤。
13.權利要求12的雜交瘤，其選自LMH-1、LMH-2和LMH-3。
14.權利要求4的抗獨特型抗體，其是由選自LMH-1、LMH-2和LMH-3的雜交瘤產生的。
15.檢測抗獨特型抗體的結合特異性的方法，包括a.用抗Lewis Y抗體、純化的人IgG或其它對照Mab包被Elisa板；b.加入純化的抗獨特型抗體；c.與第二抗體溫育；以及d.檢測被結合的抗獨特型抗體的量，其中抗獨特型抗體與抗體的結合證明了結合特異性。
16.權利要求15的方法，其中mAB是hu3S193。
17.權利要求15的方法，其中抗獨特型抗體是針對抗Lewis Y抗原的。
18.檢測能夠阻斷抗Lewis Y單克隆抗體的結合的抗獨特型抗Lewis Y抗體的方法，包括a.用Lewis Y-BSA偶聯的抗原包被Elisa板；b.加入抗獨特型抗體；c.加入單克隆抗Lewis Y獨特型抗體；以及d.檢測被結合的抗Lewis Y單克隆抗體，其中在存在和不存在抗獨特型抗體時，結合到抗原上的抗Lewis Y抗體的量是抗獨特型抗體阻斷抗Lewis單克隆抗體結合的能力的證據。
19.權利要求18的方法，其中抗Lewis Y單克隆抗體是hu3S193。
20.權利要求18的方法，其中抗獨特型抗體是針對抗Lewis Y抗體的。
21.檢測血清樣品中的抗Lewis Y抗體的方法，包括a.用合成的Lewis Y-BSA抗原包被ELISA板；b.加入血清樣品到ELISA板；c.加入綴合了過氧化物酶的抗Lewis Y抗獨特型抗體到ELISA板；以及d.由結合到包被了抗原的ELISA板的綴合了過氧化物酶的抗Lewis Y抗獨特型抗體的量來確定抗Lewis Y抗體的存在。
22.權利要求21的方法，其中單克隆獨特型抗體是hu3S193。
23.檢測施用了人源化抗Lewis Y單克隆抗體的患者中的抗LewisY HAHA應答的方法，包括a.從患者收集血清樣品；b.在存在或不存在綴合了過氧化物酶的抗Lewis Y抗體時，將血清樣品與包被了Lewis Y抗原的ELISA板進行反應；以及c.由抗獨特型抗Lewis抗體的存在或不存在來確定，其中抗獨特型抗Lewis抗體的存在證明了HAHA應答。
全文摘要
本發明提供了特異於抗Lewis Y單克隆抗體的抗獨特型抗體。本發明也涉及由雜交瘤克隆產生的mAbs特異結合到hu3S193可變區，以及抗獨特型mAB抑制hu3S193結合到Lewis Y抗原的能力的ELISA篩選方法。此外，本發明提供了能夠產生特異於抗Lewis Y單克隆抗體的抗獨特型抗體的雜交瘤。發明進一步的方面是提供對選自LMH－1、LMH－2、LMH－3或LMH－4的抗Lewis Y單克隆抗體特異的雜交瘤。本發明也涉及使用發明的抗體檢測HAMA、HACA和HAHA應答的方法。
文檔編號C07K16/28GK1867587SQ200480030361
公開日2006年11月22日 申請日期2004年8月10日 優先權日2003年8月14日
發明者Z·劉, A·M·斯科特, F·E·史密斯 申請人:惠氏公司, 路德維格癌症研究所