一種與植物耐鹽性相關的miRNA——gma-miRN261及其應用的製作方法

2023-09-19 23:14:15 3

專利名稱：一種與植物耐鹽性相關的miRNA——gma-miRN261及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與植物耐鹽性相關的miRNA，尤其是一種來源於大豆根瘤的、能夠調節大豆耐鹽性的新miRNA ；本發明還涉及此miRNA的前體、其前體的編碼基因及其用途。
背景技術：
miRNA是近年來研究發現的一種長20 M nt的內源性非蛋白編碼RNA。miRNA 基因最初轉錄產生具有頸環結構的pre-miRNAs。隨後pre-miRNA被轉運出核，在細胞質中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過序列互補與特定靶基因的mRNA結合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻譯從而對基因的表達起到負調節作用(Llave et al. , 2002; Palatnik et al. , 2003; Tang et al. , 200 。土壤鹽漬化嚴重影響著植物的生長與發育，制約著農業生產。大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。植物在應對鹽脅迫時會有一系列的保護機制，研究大豆抗鹽的分子機制，培育大豆耐鹽新品種是提高大豆產量的一個主要途徑。目前，在植物抗鹽機制研究中， 研究較為清楚的是SOS途徑(Qiu et al. , 2002; Quintero et al.，2002)，大豆中也克隆到了一些抗鹽相關的基因(Li et al. , 2005; Liao et al. , 2008; Xie et al. , 2009; Cheng et al.，2009)。另外，有研究表明，microRNA (miRNA)在植物抗鹽機制中也發揮重要作用(Zhu et al. , 2004; Jung et al. , 2007; Zhao et al. , 2009)。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種與植物耐鹽性相關的miRNA、其前體序列及其前體序列的編碼基因，利用此miRNA能夠提高大豆的耐鹽性，對提高大豆產量具有重大的意義。為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案如下。一種與植物耐鹽性相關的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO 1所示的序列。上述與植物耐鹽性相關的miRNA的前體序列，其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。編碼上述與植物耐鹽性相關的miRNA前體序列的DNA序列，其具有序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。上述與植物耐鹽性相關的miRNA在培育耐鹽轉基因植物中的應用。作為上述應用的一種優選技術方案，所述耐鹽轉基因植物為大豆。作為上述應用的一種優選技術方案，在大豆中過表達SEQ ID NO :1所示的miRNA， 或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表達，培育出具有高耐鹽性的轉基因大豆。採用上述技術方案所產生的有益效果在於本發明提供了一種新的大豆miRNA， Solexa測序和實時螢光定量PCR檢測結果表明，本發明miRNA的表達受到鹽脅迫的調節，說明其在大豆適應高鹽脅迫機制中起重要作用，基於此，可利用其培育具有高耐鹽性的轉基因大豆，對提高大豆產量具有重大的意義。


圖1為gma-miRN261在Solexa測序中鹽脅迫和非鹽脅迫條件下表達次數的較， 結果顯示，gma-miRN261在正常生長條件下表達數為489，鹽處理後表達次數為97，表明 gma-miRN261的表達受到鹽脅迫的調節，說明其在大豆適應高鹽脅迫機制中起重要作用。圖2為gma-miRN261前體序列的莖環結構圖，可見其前體序列摺疊成一種穩定的莖環結構，屬於miRNA前體典型的二級結構，符合miRNA前體的結構特徵。圖3為實時螢光定量PCR對gma-miR擬61在鹽脅迫條件下和非鹽脅迫條件下表達特徵的分析結果，結果顯示gma-miR擬61的表達受鹽脅迫抑制明顯，說明其在大豆適應高鹽脅迫機制中起重要作用。
具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發明。本發明所使用的各種原料及各項設備均為常規市售產品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗， 結果取平均值。本發明提供的miRNA來源於大豆成熟根瘤，命名為gma-miR擬61，其長度為21nt ； 參看附圖2，其前體序列可摺疊成一種穩定的莖環結構，屬於miRNA前體典型的二級結構， 符合miRNA前體的結構特徵。實施例1 :Solexa測序分析驗證gma_miRN261在大豆耐鹽機制中的作用一、材料培養及NaCl處理
猴子毛大豆種子用70%的酒精滅菌30 S，dH20衝洗6遍後播種於無菌培養皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH20浸溼，28 °C暗萌發3天；芽長至2 cm時，移至放有溼潤濾紙的試管中，芽長至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接種30 min，低N水培，10，000 lx，溫度為26 °C，相對溼度為70%，培養觀天，125 mM NaCl處理5小時，對照為正常環境，取根瘤， 液氮冷凍，_80°C儲藏。二、Solexa 測序分析
上步所得樣品送往華大基因公司，進行solexa測序及分析，參看圖1，結果顯示，gma-miRN261在正常生長條件下表達數為489，鹽處理後表達次數為97，這表明 gma-miRN261的表達受到鹽脅迫的調節，說明其在大豆適應高鹽脅迫機制中起重要作用，在大豆中過表達gma-miR擬61，或抑制gma-miR擬61的表達，將影響大豆對鹽脅迫的適應能力，培育出具有高耐鹽性的轉基因大豆，對提高大豆的產量具有重大的意義。實施例2 實時螢光定量PCR (Real-time PCR)分析驗證gma_miRN261在大豆耐鹽機制中的作用
一、材料培養及NaCl處理
猴子毛大豆種子用70%的酒精滅菌30 S，dH20衝洗6遍後播種於無菌培養皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH20浸溼，28 °C暗萌發3天；芽長至2 cm時，移至放有溼潤濾紙的試管中，芽長至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接種30 min，低N水培，10，000 lx，溫度為沈°C，相對溼度為70%，培養觀天，125 mM NaCl處理5小時，對照為正常環境，取根瘤，液氮冷凍，"80°C儲藏；
二、miRNA的分離，用microRNA提取試劑盒(百泰克公司，Cat# RP5301)取樣提取小片段RNA，提取方法如下
(1)勻漿處理所取根瘤用液氮在研缽內快速磨碎，每50 100mg組織加1 ml試劑盒內的裂解液後勻漿；
(2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15 30°C條件下孵育5min以使核蛋白體完全分
解
(3)在4°C的條件下12，000rpm離心10 min，小心取上清轉入一個新的RNase free 的離心管中；
(4)每1ml裂解液加0. 2 ml氯仿；蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩1 並將其在室溫下孵育 3min ；
(5)樣品於4°C、12，000rpm離心10 min，會分成三層下層有機相，中間層和上層無色的水相，RNA存在於水相中；水相層的容量大約為所加裂解液體積的60%，把水相轉移到新管中，進行下一步操作；
(6)加入0.6倍體積70%乙醇，顛倒混勻(此時可能會出現沉澱)；得到的溶液和可能沉澱一起轉入microRNA提取試劑盒內的吸附柱RA中；
(7)10，000rpm離心45 s，收集下濾液(下濾液中含有miRNA)，準確估計下濾液的體積，加入2/3倍體積的無水乙醇，顛倒幾次混勻，將混合液倒入到microRNA提取試劑盒內的吸附柱RB中，10，000 rpm離心30 s，棄掉廢液；
(8)加入700μ 1試劑盒內的漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s，棄掉廢液；
(9)加入500μ 1試劑盒內的漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s，棄掉廢液；
(10)將吸附柱RB放回空收集管中，12，000rpm離心2 min，儘量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下遊反應；
(11)取出吸附柱RB，放入一個RNasefree離心管中，在吸附膜中間部位加60 80 μ 1 RNase free water (事先在65 70°C水浴中加熱)，室溫放置2 min，然後12,000 rpm離心1 min ；收集得到純淨microRNA保存於-80 °C冰箱；
三、反轉錄為cDNA，利用天根miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒將純化的miRNA反轉錄為 cDNA
(DmiRNA的Poly㈧加尾，反應液配方為(除miRNA外的各成分均取自上述試劑盒) miRNA, 6 μ 1 ；E-PAP (5U/y 1),0. 4 μ 1 ;10XPAP Buffer, 2 μ 1 ；5 XrATP solution, 4 μ 1 ；Nuclease-free Water, 7. 6 μ 1 ；總體積，20 μ 1 ；輕輕混勻上述配製的反應液，短暫離心使得管壁上的反應液沉落，37°C反應60min;所得反應液可以直接進行下遊實驗，也可以放置在-20°C短暫保存，如需長期保存存放於-80°C ；
(2) Poly(A)修飾的miRNA進行逆轉錄反應，反應液配方為(除Poly (A)反應液外的各成分均取自試劑盒):Poly(A)反應液，2 μ 1 ；10XRT primer,2y 1 ；10XRT Buffer,2y 1 ；超 ^ dNTP Mixture (2. 5Mm),1 μ 1 ；Rnasin(40U/μ 1)，1 μ 1 ；Quant Rtase,0. 5μ 1 ；RNase-free ddH20,1. 5μ 1 ；總體積，20 μ 1 ；輕輕混勻上述配製的反應液，短暫離心使得管壁上的反應液沉落，37。C反應60min ；合成的cDNA反應液放置_20°C保存，也可以直接進行下遊螢光定量檢測；四、實時螢光定量PCR:
混勻如下反應體系，然後分裝入96孔光學板中，並覆蓋上光學膜，擴增使用的儀器為 ABI公司的螢光定量PCR儀；
擴增程序為95 "C 30s ；95 "C 5 s，60 "C 34s,45 cycles ；95 "C 15 s，60 "C lmin, 95 "C 15 s ；
20 μ 1 反應體系配製如下DNA 模板，2 μ 1 ；SYBR Primix Ex taq (2X), 10 μ 1 ；PCR Forward PrimerClOy Μ),0. 4μ 1 ；PCR Reverse PrimerClOy M),0. 4μ 1 ；ROX Reference Dye II (50 X)，0. 4 μ 1 ;ddH20，6. 8 μ 1 ；總體積，20 μ 1 ;
弓I 物序列為擬61-F :TACTTGGTGAATTGTTGGATC (SEQ ID NO 4) ；5. 8S rRNA-F ACGCCTGCCTGGGTGTCACAC (SEQ ID NO 5) ；AMRM :GCGAGCACAGAATTAATACGACT (SEQ ID NO: 6) ；(5. 8S rRNA為內參，AMRM為反向引物)；
五、結果
參看圖3，實時螢光定量PCR分析的結果顯示gma-miRN261表達受鹽脅迫抑制明顯， 這同樣表明gma-miR擬61的表達受到鹽脅迫的調節，在大豆中過表達gma-miR擬61，或抑制 gma-miRN261的表達，將影響大豆對鹽脅迫的適應能力，培育出具有高耐鹽性的轉基因大豆，對提高大豆的產量具有重大的意義。 上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一限制條件。
權利要求
1.一種與植物耐鹽性相關的miRNA，其特徵在於其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的序列。
2.權利要求1所述的與植物耐鹽性相關的miRNA的前體序列，其特徵在於其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。
3.編碼權利要求2所述的與植物耐鹽性相關的miRNA前體序列的DNA序列，其特徵在於其具有序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。
4.權利要求1所述的與植物耐鹽性相關的miRNA在培育耐鹽轉基因植物中的應用。
5.根據權利要求4所述的與植物耐鹽性相關的miRNA的用途，其特徵在於所述耐鹽轉基因植物為大豆。
6.根據權利要求5所述的與植物耐鹽性相關的miRNA的用途，其特徵在於在大豆中過表達SEQ ID NO :1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO :1所示miRNA的表達，培育出具有高耐鹽性的轉基因大豆。
全文摘要
本發明公開了一種與植物耐鹽性相關的miRNA，其具有序列表中SEQIDNO1所示的序列；在大豆中過表達SEQIDNO1所示的miRNA，或抑制SEQIDNO1所示miRNA的表達，以培育出具有高耐鹽性的轉基因大豆，對提高大豆產量具有重大的意義。
文檔編號C12N15/11GK102226183SQ20111015505
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者李霞, 石磊, 董章輝 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所