抗藍藻重組抗體多肽及其基因與製備方法
2023-09-19 23:20:10 3
專利名稱：抗藍藻重組抗體多肽及其基因與製備方法
技術領域：
本發明涉及環保生物技術，特別是一種抗藍藻重組抗體多肽及其基因與製備方法。
背景技術：
水體過度營養化造成的藍藻增生、水體汙染是目前威脅世界範圍水環境的最大危害，給人類造成巨大的經濟損失，給地球生物圈造成無法修復的危害。隨著我國經濟發展造成的加速工業化和城鎮化，生態環境汙染和惡化日益加劇，水環境生態防治已成為我們必需面對和解決的重大問題。現用抗菌藥物對藍藻基本無效；藍藻屬細菌域第X門-藍細菌門的一類原核細胞，目前能夠控制藍藻的只有重金屬類化學製劑，如硫酸銅等。而在實際應用中，由於效果有 限，往往不惜超劑量多次重複用藥，造成的結果是在殺傷藍藻的同時也將水體中其他有益藻類、水生植物和生物破壞殆盡，給環境造成了無法逆轉的永久性破壞。同時重金屬類化學製劑在環境和農產品的殘留量越來越大，因此人類急需開發高效且使用安全的抗藍藻藥物。
發明內容
本發明的一個目的在於提供一種新型的重組抗藍藻多肽的基因、重組質粒、多肽；此種多肽能特異的殺滅藍藻細胞而不會傷害其他藻類細胞、植物和動物。本發明的再一目的是提供上述重組抗藍藻多肽的製備方法。雜交瘤細胞，其保藏號為CGMCC No. 4783。上述雜交瘤分泌的單克隆抗體。具有藍藻識別結合能力的模擬抗體多肽，是上述單克隆抗體的抗原結合片段，或根據上述單克隆抗體的抗原結合片段上的功能區域設計而得的小分子多肽。所述模擬抗體多肽其胺基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。編碼上述模擬抗體多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。抗藍藻重組抗體多肽，由上述具有藍藻識別結合能力的模擬抗體多肽可操作地線性連接在大腸菌素多肽的羧基端構成，所述大腸菌素選自大腸菌素El, la, lb, A, B或N。所述抗藍藻重組抗體多肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。編碼上述抗藍藻重組抗體多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。含有編碼上述抗藍藻重組抗體多肽的基因的重組表達載體。上述抗藍藻重組多肽的製備方法，其步驟如下將編碼抗藍藻重組抗體多肽的基因導入到大腸桿菌表達系統中，培養轉化的大腸桿菌，然後分離大腸桿菌表達的多肽。上述抗藍藻重組抗體多肽在治理水體過度營養化中的應用。
本發明提供一種抗藍藻重組抗體多肽，由大腸菌素多肽和抗藍藻細胞表面抗原的抗體模擬物多肽組合而成。在該多肽分子中，抗藍藻細胞表面抗原的抗體模擬物用於識別並結合藍藻使分子中的大腸菌素攻擊藍藻。由於抗體模擬物為識別藍藻表面抗原的抗體模擬物，因此本發明的多肽具有專門攻擊藍藻細胞而不損害其它水體生物，因而不會汙染水源，用於水體藍藻汙染的治理非常環保和安全。本發明的抗藍藻重組抗體多肽的基於CGMCCNo. 4783雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體的抗原結合片段(Fab)的輕鏈和重鏈的胺基酸序列及核苷酸序列設計出的具有藍藻識別結合能力的抗體模擬物，如單鏈抗體、抗體小分子模擬物等本領域已經熟知的抗體模擬物。在本發明中，設計的抗體模擬物只需要具有抗原識別能力即可實現發明目的，因為抗體模擬物的任務只是引導重組多肽分子到達目標生物細胞表面，然後由重組多肽中的大腸菌素在目標細胞膜上製造離子通道從而是目標細胞內溶物洩露而死。因此，基於上述單克隆抗體設計的抗體模擬物，只要能起到識別目標抗原的目的，這些抗體模擬物與大腸菌素連接而成的重組多肽都屬於本發明保護的範圍。在本發明的優選實施方式中，抗體模擬物為抗藍藻原生質體表面抗原的單克隆抗體(由CGMCC No. 4783的雜交瘤細胞分泌)的幾個結構域VfDRl、VHFR2和Vl⑶R3按 VHCDRl-VHFR2-VfDR3結構連接而成的28肽抗體模擬物。室內外實驗證明，該抗體模擬物構成的抗藍藻多肽可以在水介質中自由遊動，具有自動尋找藍藻細胞表面抗原的生物學活性。28肽抗體模擬物構成具有易於克隆和表達且具有與原始抗體相同的識別活性的優點，可以引導重組多肽中的大腸菌素到達藍藻細胞膜上形成離子通道來殺傷這些藍藻細胞，該重組多肽具有現用治理水汙染藥物(如硫酸銅等)所無法比擬的、具有生態-環境安全性。本發明中，構建重組抗藍藻多肽的大腸菌素可選自能形成離子通道的大腸菌素El, la, lb, A，B或N，在本發明的實施例驗證了大腸菌素Ia與抗藍藻抗體模擬物構建的重組多肽，但但發明利用的是這些大腸菌素在細菌胞膜上形成離子通道來殺死細菌的這一共性，因此，按照本發明的構思，這些大腸菌素與抗藍藻的抗體模擬物多肽線性連接構成的重組多肽都能夠實現本發明的目的-即提供能夠殺死藍藻的重組多肽。本發明還提供了包含重組多肽的基因的重組質粒的製備方法，是將編碼抗體模擬物的核苷酸序列經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術插入大腸菌素的羧基端形成本發明的重組質粒。以選用大腸菌素Ia為例，將編碼抗體模擬物的核苷酸序列插入Ia基因的第626位胺基酸後(羧基端)而形成本發明的重組質粒。構建重組質粒的原始商用質粒pSELECT-1來自於Promega公司，其中裝載了大腸菌素Ia和相應的Immunity蛋白基因，針對抗體模擬物基因設計了數對引物，其序列見實施例I。利用雙鏈寡聚核苷酸點突變技術，按照Strategene公司試劑盒操作獲得重組質粒,例如pCHCcyanoMAl。本發明的又一方面，提供本發明所述抗藍藻多肽的製備方法，將編碼抗體模擬物的基因可操作地與大腸菌素基因連接獲得編碼重組抗藍藻多肽基因的重組質粒，將獲得的重組質粒轉染入大腸桿菌工程菌中而獲得可產生重組抗藍藻多肽的工程菌細胞。用離子交換柱分離純化即獲得本發明所述的抗藍藻多肽。本發明所述抗藍藻多肽可用於治理水汙染。可以通過將本發明中的多肽添加可接受的載體或賦形劑或可選的其它成分而製成適於環境使用的藥物組合物。其機理是多肽中可與藍藻細胞表面抗原識別的抗體模擬物誘導大腸菌素到達藍藻細胞膜附近，然後大腸菌素離子通道結構域的疏水區段插入藍藻細胞膜中，進而大腸菌素離子通道結構域在藍藻細胞膜上形成離子通道，使藍藻細胞內容物洩漏而致藍藻細胞死亡，從而達到殺死藍藻細胞的目的。本發明所述的抗藍藻多肽相較於傳統抗藍藻藥物的優點在於，其具有特異的靶向性，因而在治理過程中不會攻擊其他藻類、植物和動物細胞，其毒性和不良反應遠低於傳統抗藍藻藥物。再由於它是 在藍藻細胞膜上直接形成離子通道來殺傷藍藻細胞，因此在抗藍藻多肽-離子通道造成洩漏而致藍藻細胞死亡的這一較短時限內，藍藻細胞較難利用突變基因-蛋白表達方式來修復抗藍藻多肽-離子通道在藍藻細胞膜上造成的幾何缺損，所以藍藻細胞對本發明的抗藍藻多肽產生耐藥性的概率較低。這預示本發明所述抗藍藻多肽具有良好的應用前景。雜交瘤保藏信息保藏號CGMCCNo. 4783雜交瘤名稱抗藍藻細胞表面抗原的單克隆抗體雜交瘤細胞保藏日期2011年4月20日保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
圖I.是含有抗體模擬物和大腸菌素Ia基因的重組質粒pCHCcyanoMAl的結構示意圖。圖2.為抗藍藻多肽結構示意圖。圖3.是含有部分基因顛倒N-C順序的抗體模擬物基因和大腸菌素Ia基因的重組質粒pCHCcyanoMA2的結構示意圖。圖4.為本發明抗藍藻多肽對生長於液體培養基中銅綠微囊藻的抑制試驗結果。圖中A，空白對照液，B，氨苄青黴素50ii g/ml，C，廣譜信息菌素(Ph-NM) 50 y g/ml，D，抗藍藻多肽(l)50iig/ml，E，抗藍藻多肽(2)50iig/ml。圖5.為本發明抗藍藻多肽(I)對生長於液體培養基中銅綠微囊藻的抑制試驗結果。圖中A，處理48小時後，B，處理72小時後，C，處理96小時後。圖中每一列從左至右共6個燒瓶，依次為1，對照，2，0. Iii g/ml抗藍藻多肽(1)，3，0. 5iig/ml抗藍藻多肽(1)，4,1 u g/ml抗藍藻多肽(I), 5, 5 ii g/ml抗藍藻多肽(I), 6,10 y g/ml抗藍藻多肽⑴。圖6.為本發明抗藍藻多肽⑴對生長於液體培養基中柵藻的抑制試驗結果。處理10日後，圖中每一列從左至右共6個燒瓶，依次為1，對照，2，Iii g/ml抗藍藻多肽(I), 3, 5 ii g/ml抗藍藻多肽⑴，4,10 ii g/ml抗藍藻多肽(I), 5,15 y g/ml抗藍藻多肽
(I),6, 20 u g/ml抗藍藻多肽⑴。圖7.為本發明抗藍藻多肽⑴對生長於液體培養基中銅綠微囊藻、柵藻的抑制試驗結果。上圖為銅綠微囊藻的結果，下圖為柵藻的試驗結果。圖8.為本發明抗藍藻多肽對生長於液體培養基中銅綠微囊藻、魚腥藻、小球藻、柵藻的抑制試驗結果。圖中左側燒瓶為對照，右側燒瓶為35 U g/ml抗藍藻多肽(I)。A，銅綠微囊藻，B，魚腥藻，C，小球藻，D，柵藻。圖9.為本發明抗藍藻多肽對藍藻汙染的自然水體抑制試驗結果。圖中A,空白對照,B,抗藍藻多肽(I) I V- g/ml, C,抗藍藻多肽(I) 5 U g/ml, D,抗藍藻多肽(I) 10 u g/ml, E,硫酸銅 0. 7 u g/mlo圖10.為圖9抑制試驗的部分測試結果。A，水體中光密度變化，B，水體中葉綠素a變化，C，水體中pH變化，D，水體中優勢
藻類種群變化。D-1,對照組,D-2,1 ii g/ml抗藍藻多肽⑴處理組,D_3,0. 7 ii g/ml硫酸銅處理組。圖11.為圖9中抗藍藻多肽對藍藻汙染的自然水體抑制試驗的顯微鏡觀察結果 (放大400倍)。分別為對照、抗藍藻多肽(I) I U g/ml和硫酸銅0. 7 U g/ml處理水體中藻類(魚腥藻)在A，第一日，B，第二日，C，第三日，D，第四日，E，第五日的變化。
具體實施例方式實施例I表達抗藍藻多肽的質粒的構建和重組抗藍藻多肽的製備材料雜交瘤細胞CGMCC No. 4783。步驟I.抗體模擬物的核苷酸序列及胺基酸序列的獲得收集雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，採用常規方法對單克隆抗體進行測序獲得抗原結合片段Fab重鏈和輕鏈序列後，根據抗原互補決定區的胺基酸序列設計得到抗體模擬物胺基酸序列，如SEQ ID NO. 3所示，編碼該抗體模擬物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。步驟2.原始質粒為裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECT_l質粒(購自Promega公司，上述基因由本實驗室裝載)，經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChange Kit, Strategene公司)將編碼抗藍藻的抗體模擬物的基因(序列表中SEQ ID N0.2所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia基因的1626位點後，得到重組質粒pCHCcyanoMAl (如圖I所示)，重組質粒轉染入E. coli B834(DE3)工程菌裡表達製備多肽，獲得序列表如SEQ ID NO. 7所述的抗藍藻多肽，在後續的實施例中稱為「抗藍藻多肽(I) 」，其分子量約70，000。突變程序按Strategene QuickChange Site-Directed MutagenesisKit(catalog#200518)藥箱手冊進行I、準備點突變反應物5ul IOx buffer2ul (IOng)野生型大腸菌素Ia質粒Iul (125ng)設計的5』 -3』寡聚核苷酸引物Iul (125ng)設計的3』 -5』寡聚核苷酸引物Iul dNTP雙蒸水50ulIul pfu(除質粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)2、進行PCR擴增，擴增條件變性95°C，35秒，退火53°C，70秒，延伸68°C，17分共20個循環；3、加入Dpnl內切酶Iul消化母體DNA鏈後(37°C，I小時)，取Iul反應物與HMS174感受態細胞50ul冰孵30分鐘，行熱衝擊42V，45秒，再置入冰中2分鐘；4、加入NZY培基0. 5ml後220rpm，37°C搖菌I小時後，取50_100ul反應物鋪板(LB培基加1%瓊脂加50ug/ml氨苄青黴素，37 °C過夜)；5、18小時後挑菌,循Qiagene,Gibco等公司的各種商用提取質粒藥箱提取質粒均可，測序確定突變成功；6、將質粒50ng與製備的E. coli B834(DE3)工程菌感受態細胞50ul冰孵30分，42°C，30秒熱衝擊，取50-100ul反應物加入SOC培基0. 5ml，220rpm，37°C搖菌I小時後鋪板(LB培基加1%瓊脂加50ug/ml氨苄青黴素)37°C孵育，12-16小時後挑取菌落； 7、大量增菌，8-16升LB培基，250rpm，37°C，6-8小時；離心沉澱菌體，4°C，6000g,20 分鐘，取 4°C，50mM Borate, 2mM EDTA, pH 9. 0) 50_80ml 懸浮菌體，加入 0. 2M PMSF 250微升後行超聲破碎(4°C，400W, 2分鐘)，高速離心沉澱破碎菌體(4°C，75000g, I. 5小時)，取上清經硫酸鏈黴素沉澱DNA，裝入分子量15，000的透析袋於4°C，50mMBorate, 2mM EDTA,pH 9. 0緩衝液10升透析過夜後，將上清上樣於CM柱(Amersham Biosciences),經50mMBorate,0. 3M NaCl,2mM EDTA, pH 9. 0緩衝液，4°C )洗脫後即可得到重組抗藍藻多肽(I)(請見圖2)。下面列出為製備pCHCcyanoMAl質粒的抗體模擬物基因所設計的具體雙鏈寡聚核苷酸序列pCHCcyanoMAl1、5， -3，gcg aat aag ttc tgg ggt att TCT TAT TGG ATG CAG TGG GTT AAG CAAtaa ataaaa tataag aca ggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta TTG CTT AAC CCA CTG CAT CCA ATA AGA aat acccca gaa cttatt cgc2、5， -3’tat tgg atg cag tgg gtt aag caa AGA CCG GGG CAA GGG CTG GAG TGG ATT GGCtaa ata aaa tataag acaggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta GCC MT CCA CTC CAG CCC TTG CCC CGG TCT ttgctt aaccca ctg cat cca ata3、5， -3』ggg caa ggg ctg gag tgg att ggc CAG CAG TAT YGG TCT ACG CCC CCG TGG ACGtaa ata aaa tataag acaggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta CGT CCA CGG GGG CGT AGA CCA ATA CTG CTG gccaat ccactc cag ccc ttg ccc實施例2表達抗藍藻多肽的對照質粒的構建和對照重組抗藍藻多肽的製備
原始質粒為裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECT_l質粒(購自Promega公司，上述基因由本實驗室裝載)，經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChange Kit, Strategene公司)將編碼抗藍藻的抗體模擬物的基因(序列表中SEQ ID N0.4所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia基因的1626位點後，得到重組質粒pCHCcyanoMA2(如圖3所示)，重組質粒轉染入E. coli B834(DE3)工程菌裡表達製備多肽，獲得序列表如SEQ ID NO. 9所述的抗藍藻多肽，在後續的實施例中稱為「抗藍藻多肽(2)」，其分子量約70，000。製備PCHCcyanoMA2質粒的模擬物基因的雙鏈寡聚核苷酸序列按實施例I的方法設計。其製備方法同實施例2。實施例3抗藍藻多肽對銅綠微囊藻的抑制試驗結果試驗(I)
步驟I.準備試驗藻藍藻為購自中國科學院水生生物研究所的FACHB-978銅綠微囊藻(Microcustis aeruginosa)。試驗藻的培養方法將藻種接種到裝有250ml BGll培養基的500ml容積錐形瓶中，置於光照培養箱中。接種初始藻細胞密度為5 X IO4個/mL，錐形瓶用透氣膜封蓋，以防汙染。培養溫度為25°C，光照強度為(2500±10% )Lux ;光暗比為12h/12h。為減少因光照不均勻可能造成的影響，每隔2 3h搖動並更換各實驗組錐型瓶的位置I次。自接種的第5天起，每隔24h取樣、測定I次。待藻細胞數密度達到IO6個/mL數量級左右時，即可開始下一步試驗。步驟2.在五個試管A、B、C、D、E中分別加入製備好的藍藻液lml，然後加入抑制劑A空白對照液，B氨苄青黴素50 u g/ml，C廣譜信息菌素(申請號為200910092128. 4中公開的Ph-AMl) 50 V- g/ml, D抗藍藻多肽(I) 50 u g/ml, E抗藍藻多肽(2) 50 u g/ml後,五個試管置於孵箱中低速振蕩培養12小時後，都加入吖啶橙(按50nM加入)和碘化丙啶(按600nM加入)孵化30分鐘，吸取數微升置於載玻片上，螢光顯微鏡(Nikon90i，DM505和DM565濾光鏡片)觀察活藍藻染色情況。結果如圖4所示。結果顯示只有抗藍藻多肽(I)殺傷了培養的銅綠微囊藻。而抗藍藻多肽(2)、氨苄青黴素、Ph-NM對所培養的銅綠微囊藻均無作用。試驗(2)步驟I同試驗(I)步驟I。步驟2.直接在6個接種了試驗藻的500ml的錐形瓶中按濃度梯度加入抗藍藻多肽。銅綠微囊藻加入抗藍藻多肽的劑量為0、0. l、0.5、l、5、10ug/ml，每日觀察對藍藻的生長抑制情況。結果如圖5所示。由於各處理組所用的抗藍藻多肽(I)濃度不一樣，錐形瓶中銅綠微囊藻液由綠色變成淺黃色之時間快慢與多肽的濃度成正比，然在72小時內，肉眼可觀察到各處理組均可有效殺滅所試之銅綠微囊藻。上述結果證明，抗藍藻多肽⑴具有靶向殺傷藍藻的效力，而抗藍藻多肽2幾乎無效。試驗(3)材料購自中科院水生生物研究所的FACHB-417斜生柵藻(Scenedesmusobliqnus)採用試驗(I)中步驟I的方法培養試驗藻。步驟2.直接在6個接種了試驗藻的500ml的錐形瓶中按濃度梯度加入抗藍藻多肽(I)，劑量分別為:0、l、5、10、15、20ug/ml。每日觀察對柵藻的生長抑制情況。結果如圖6所示。雖然加入的抗藍藻多肽(I)劑量相對銅綠微囊藻處理組大了 10倍，肉眼在試驗期間(190小時)未觀察到抗藍藻多肽⑴表現出任何對所試柵藻的殺傷作用。結果如圖6所示。雖然加入的抗藍藻多肽(I)劑量相對銅綠微囊藻處理組大了 10倍，肉眼在試驗期間(190小時)未觀察到抗藍藻多肽⑴表現出任何對所試柵藻的殺傷作
用。 試驗(4)以上試驗(I) (3)每瓶取0. ImL培養液，置於血球計數板中，在顯微鏡下觀察、計數。圖7所示的藻細胞計數顯示與對照相比較，I U g/ml抗藍藻多肽(I)在72小時內即可殺滅所試之銅綠微囊藻。而I U g/ml抗藍藻多肽(I)對所試之柵藻幾乎無任何作用。實施例4.抗藍藻多肽對抗銅綠微囊藻、魚腥藻、小球藻、柵藻的液體培養基試驗所試藻類為購自中科院水生所的銅綠微囊藻、魚腥藻、小球藻和柵藻。藻類培養和加入處理劑之方法同實施例3的試驗(I)的步驟I。取藻細胞數密度達到IO6個/mL數量級的培養藻液40ml分裝於300ml錐形瓶中，各加入A :加入等量的空白對照液，B :加入抗藍藻多肽(I) 35 y g/ml，繼續培養4日，觀察其生長情況。結果如圖8所示。24小時後，銅綠微囊藻和魚腥藻藻液顏色開始變淺，至第4日藻液已變清亮。而小球藻和柵藻藻液顏色和濁度均無變化。該結果顯示抗藍藻多肽I抑制了所試銅綠微囊藻、魚腥藻的生長，卻不能抑制小球藻、柵藻的生長。上述結果證明，抗藍藻多肽(I)具有靶向殺傷藍藻的效力。實施例5抗藍藻多肽對自然水體中藍藻的殺滅試驗自然水體採自被藍藻嚴重汙染的蘇州陽澄湖沼蝦養殖池，25-35升分裝於60x40x30釐米塑料養殖盆中，每隔20分鐘氣泵送氣10分鐘；加熱器自動調溫至27°C，光照強度為(2500 ± 10 %) Iux ;光暗比為12h/12h，每日採樣檢測養殖水體pH、650nm光吸收值、葉綠素a吸收值(請見圖9)。將採樣液置於可見分光光度計中測定650nm光吸收值(請見圖10)。利用熱乙醇-反覆凍融-分光光度法測定葉綠素a含量(請見圖10)。用分光光度計於665、700nm下測其吸光度，計算葉綠素a的濃度。其公式為[Chla] = [12. 12(D66
4-D750)-l. 58(D647-D750)-0. 08(D630-D750)]VE/VS d。對照組水體中的pH、650nm光吸收值、葉綠素a吸收值在試驗期間一直居高不下，而抗藍藻多肽(I)組和硫酸銅組水體的pH、650nm光吸收值、葉綠素a吸收值自第二日起即顯著下降。每日採樣30ml水樣用福馬林固定後，離心濃縮10倍，取0. ImL置於血球計數板中，在顯微鏡下觀察、計數(請見圖11)。鏡檢中可見在第一日，對照組、抗藍藻多肽(I)組和硫酸銅組水體中可見大量生長茂盛的魚腥藻；而自第二日起，抗藍藻多肽(I)組和硫酸銅組水體中的魚腥藻大量減少、碎裂；至第五日抗藍藻多肽(I)組和硫酸銅組水體中已找不到魚腥藻，而對照組水體中仍見大量魚腥藻生長。顯微鏡檢觀察藻類形態變化，同時對各種藻類計數以確定養殖水體中浮遊植物優勢種群的動態變化(請見圖10)。在對照組水體中，魚腥藻和銅綠微囊藻始終為優勢藻種；在抗藍藻多肽(I)組水體中，魚腥藻和銅綠微囊藻逐漸減少，小球藻變成為優勢藻種；在硫酸銅組水體中，魚腥藻和銅綠微囊藻逐漸減少，而另一種藍藻，顫藻變成為優勢藻種。表I抗藍藻多肽處理之浮遊植物細胞計數及形態變化(個/升)
權利要求
1.雜交瘤細胞，其保藏號為=CGMCCNo. 4783。
2.權利要求I所述的雜交瘤分泌的單克隆抗體。
3.具有藍藻識別結合能力的模擬抗體多肽，是權利要求2所述的單克隆抗體的抗原結合片段，或根據所述抗原結合片段上的功能區域設計然後人工表達分離而得的小分子多肽。
4.根據權利要求3所述的模擬抗體多肽，其胺基酸序列如SEQID NO. 3所示。
5.編碼權利要求3或4的模擬抗體多肽的基因。
6.根據權利要求5所述的基因，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
7.抗藍藻重組抗體多肽，由權利要求3或4所述的具有藍藻識別結合能力的模擬抗體 多肽可操作地線性連接在大腸菌素多肽的羧基端構成，所述大腸菌素選自大腸菌素El，Ia，Ib，A，B 或 N。
8.根據權利要求7所述的抗藍藻重組抗體多肽，其胺基酸序列如SEQID NO. 7所示。
9.編碼抗藍藻重組抗體多肽的基因。
10.根據權利要求9所述的編碼抗藍藻重組抗體多肽的基因，核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
11.含有編碼抗藍藻重組抗體多肽的基因的重組表達載體。
12.權利要求7或8所述的抗藍藻重組多肽的製備方法，其步驟如下將編碼抗藍藻重組抗體多肽的基因導入到大腸桿菌表達系統中，培養轉化的大腸桿菌，然後分離大腸桿菌表達的多肽。
13.權利要求7或8所述的抗藍藻重組抗體多肽在治理水體過度營養化中的應用。
全文摘要
本發明「抗藍藻重組抗體多肽及其基因與製備方法」，屬於環保生物技術。抗藍藻重組抗體多肽，由抗藍藻的抗體模擬物多肽可操作地線性連接在大腸菌素多肽的羧基端構成，所述抗藍藻的抗體模擬物多肽是基於CGMCC No.4783雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體的抗原結合片段設計的具有藍藻識別結合能力的多肽。本發明的新型抗藍藻多肽相較於現用治理水汙染藥物的優點在於，其直接在藍藻細胞膜上形成離子通道來殺傷藍藻，因此殺傷效率強於現用治理水汙染藥物數十倍；由於該多肽對藍藻(原核細胞)是靶向性殺傷，不會殺傷其他有益的真核細胞藻類；該多肽本身又可被蛋白酶、胃酸等降解；因此它具有現用治理水汙染藥物(如硫酸銅等)無法比擬的生態和環境安全性。
文檔編號C12R1/91GK102747041SQ20111015522
公開日2012年10月24日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年4月21日
發明者丘小慶 申請人:畿晉慶三聯(北京)生物技術有限公司