Eno2基因在植物生長發育調控中的應用的製作方法

2023-09-19 23:10:15 2

Eno2基因在植物生長發育調控中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供ENO2基因在植物生長發育調控中的應用，利用基因工程技術將ENO2基因整合至植物基因組中，從而調節植物的生長發育。研究表明：1、eno2產生的T-DNA插入突變使得擬南芥花粉形態異常，由此可見eno2在花粉的正常發育中起重要作用；2、eno2產生的T-DNA插入突變使得擬南芥的主根長度明顯變短、蓮座葉的葉片數目變少和總面積顯著變小、所有葉片都成為網狀葉和地上及地下部分重量明顯降低。由此可見eno2在擬南芥的正常營養生長發育中起重要作用。
【專利說明】EN02基因在植物生長發育調控中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，具體地說，涉及EN02基因在植物生長發育調控中的應用。
【背景技術】
[0002]烯醇化酶(enolase，eno)是參與糖酵解的一個關鍵酶，近年來發現烯醇化酶還表現出一些其他的、多樣化的新功能。在植物體中，研究者早已觀察到烯醇化酶在轉錄、轉錄後和翻譯後水平上應答高鹽、低溫、缺氧等非生物脅迫，因此，推測烯醇化酶可能在植物非生物脅迫應答過程中發揮重要作用。然而，目前為止鮮有文獻報導烯醇化酶在植物生長發育中起作用。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供EN02基因在植物生長發育調控中的應用。
[0004]為了實現本發明目的，本發明利用基因工程技術將EN02基因整合至植物基因組中，從而調節植物(優選擬南芥)的生長發育。其中，所述EN02基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示,或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
[0005]根據GenBank上公布的擬南芥基因組信息，設計用於擴增eno2基因的引物，最終克隆得到完整的基因序列。
[0006]本發明對烯醇化酶2基因在植物(擬南芥)營養生長發育和花粉發育中的功能進行了探索。
[0007]從擬南芥生物資源中心購買擬南芥烯醇化酶2基因(enolase2, eno2)的T-DNA插入突變體，經鑑定得到烯醇化酶2基因的純合T-DNA插入突變體，並進一步通過農桿菌介導的蘸花法用eno2分別轉化eno2-純合突變體和野生型擬南芥，得到回補型和過表達型擬南芥，結合其表型分析(主要包括花粉粒顯微鏡觀察和雜交等方法)來確定烯醇化酶2基因在擬南芥營養生長和花粉發育中的功能。結果如下:
[0008]eno2_純合突變體的花粉粒較小，且形態異常，回補型的花粉粒大小和形態則與野生型一致。此外，θηο2--合突變體的主根長度只有野生型的1/3，它的蓮座葉葉片數目只有野生型的1/2，蓮座葉葉片總面積也只有野生型的1/10，地上和地下部分的重量分別只有野生型的1/2和1/3，而回補型的這些表型差異得以恢復到野生型水平。
[0009]本發明還提供利用基因工程技術將ΕΝ02基因整合至擬南芥基因組中，從而促進植物根的生長發育。
[0010]本發明還提供利用基因工程技術將ΕΝ02基因整合至擬南芥基因組中，從而促進植物葉片的生長發育。
[0011]本發明進一步提供利用基因工程技術將ΕΝ02基因整合至擬南芥基因組中，從而促進植物花粉粒的發育。[0012]本發明的優點在於:
[0013](一)首次證明烯醇化酶2基因在植物花粉正常發育中具有重要的功能。
[0014](二)證明了烯醇化酶2基因除了在植物耐逆中起作用，進一步證明了烯醇化酶2基因在植物正常營養生長發育中發揮著關鍵作用，拓展了烯醇化酶2基因的功能。【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發明實施例1中基因組水平鑑定擬南芥烯醇化酶2純合突變體；其中，I和2為野生型擬南芥，3和4、5和6為雜合eno2_擬南芥，7-10為純合eno2_擬南芥，11為DNA Marker。
[0016]圖2為本發明實施例1中轉錄水平鑑定擬南芥烯醇化酶2純合突變體。
[0017]圖3為本發明實施例1中擬南芥烯醇化酶2純合突變體鑑定原理圖。
[0018]圖4為本發明實施例3中生長23天的擬南芥；其中，左上角植株為純合eno2_擬南芥，左下角植株為轉pCAMBIA-1302-GFP空載體的擬南芥，中間植株為野生型擬南芥，右上角為回補eno2基因的純合回補型擬南芥，右下角植株為過表達eno2基因的純合過表達型擬南芥。
[0019]圖5為本發明實施例3中生長28d的擬南芥的蓮座葉葉片。
[0020]圖6為本發明實施例3中生長15d擬南芥的主根的生長情況；其中，從左至右依次為回補型擬南芥、野生型擬南芥、純合eno2_擬南芥、純合回補型擬南芥和純合過表達型擬南芥，純合eno2_擬南芥的主根長度較短，回補型擬南芥的主根長度則恢復到了野生型的長度，過表達型擬南芥主根略長，但差異不明顯。
[0021]圖7為本發明實施例3中生長23d擬南芥的側根的生長情況；其中，從左至右依次為回補型擬南芥、野生型擬南芥、純合eno2_擬南芥回補型擬南芥和過表達型擬南芥，純合eno2_擬南芥的側根較少，回補型擬南芥的側根數目則恢復到了野生型的水平。
[0022]圖8為本發明實施例2中擬南芥成熟花粉粒掃描電子顯微鏡下觀察結果；其中，從左至右依次為轉空載擬南芥、野生型擬南芥、純合eno2_擬南芥、純合回補型擬南芥和純合過表達型擬南芥，純合en02_擬南芥花粉發育不正常，花粉粒較小，且形態異常，回補型擬南芥花粉粒大小和形態則恢復正常。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0024]實施例1擬南芥烯醇化酶2純合突變體鑑定
[0025]1.1基因組水平鑑定
[0026]從擬南芥生物資源中心購買擬南芥烯醇化酶2基因(enolase2, eno2)的T-DNA插入突變體，經鑑定得到烯醇化酶2基因的純合T-DNA插入突變體。鑑定方法如下:
[0027]針對插入序列，設計特異性引物LP和RP，位於T-DNA插入序列的兩側，BP為根據T-DNA插入序列所設計的引物(一般含有LBal、LBbl和LBbl.3)，以待測擬南芥基因組DNA為模板，分別以LP、RP和RP、BP兩對引物進行PCR擴增。
[0028]其中引物LP 序列為:5』 -CCATCCAAATTTCAAACATGG-3』 ;引物 RP 序列為:5』 -CGATGATGTTGTTCACATTGC-3』。
[0029]引物BP (LBal)序列為:5』 -TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3』。
[0030]PCR鑑定原理圖如圖3所示。
[0031]若待測植株為野生型擬南芥，則只有LP、RP引物對可以擴增出條帶；若待測植株為雜合體，則兩對引物均能擴增出特異性條帶；若待測植株為純合突變體，則只有RP、BP引物對可以擴增出條帶。
[0032]結果如圖1所示,成功鑑定出烯醇化酶2基因的純合T-DNA插入突變體。
[0033]1.2轉錄水平鑑定
[0034]鑑定方法如下:
[0035]提取擬南芥葉片總RNA，反轉錄生成cDNA，然後以actin2為內參，並以反轉錄合成的cDNA為模板進行RT-PCR鑑定，所用的引物分別為:
[0036]eno2: sense: 5，-AATGGATGTTGCCGCTTCAGAGTTC-3』
[0037]antisense:5』 -TAAGTCAGCAATGAATGTGTCCTCG-3』
[0038]actin2: sense:5，-TAACTCTCCCGCTATGTATGTCGCC-3』
[0039]antisense:5』 -TTTCTGTGAACGATTCCTGGACCTG-3』
[0040]結果如圖2所示，從圖2可以看出，烯醇化酶2純合突變體的eno2表達量明顯下降。
[0041]1.3突變體中T-DNA插入位點
[0042]對RP和LBal擴增得到的片段進行測序，然後根據擬南芥基因組信息，通過生物信息學方法找到T-DNA插入的精確位點。結果見表1。
[0043]表1突變體中T-DNA插入位點
【權利要求】
1.EN02基因在植物生長發育調控中的應用，其特徵在於，利用基因工程技術將EN02基因整合至植物基因組中，從而調節植物的生長發育。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述EN02基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示,或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於，所述植物為擬南芥。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，利用基因工程技術將EN02基因整合至擬南芥基因組中，從而促進植物根的生長發育。
5.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，利用基因工程技術將EN02基因整合至擬南芥基因組中，從而促進植物葉片的生長發育。
6.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，利用基因工程技術將EN02基因整合至擬南芥基因組中，從而促進植物花粉`粒的發育。
【文檔編號】A01H5/00GK103725702SQ201310684729
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年1月31日
【發明者】張根發, 葉盼, 施子晗, 高飛, 周宜君, 李曉峰, 張永華, 程慧梅 申請人:北京師範大學