促進外源蛋白在cho細胞中高效表達的核苷酸序列片段的製作方法

2023-09-19 23:25:00

專利名稱：促進外源蛋白在cho細胞中高效表達的核苷酸序列片段的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術應用領域，主要涉及一種來源於CHO細胞的核苷酸序 列。
背景技術：
按照宿主細胞的類型來分，基因表達系統大致可以分為原核、酵母、植物、昆蟲和 哺乳動物細胞表達系統。與其他系統相比，哺乳動物細胞表達系統的優勢在於能夠指導蛋 白質的正確摺疊，提供複雜的N型糖基化和準確的0型糖基化等多種翻譯後加工功能，因 而，表達產物在分子結構、理化性質和生物學功能方面最接近於天然的高等生物蛋白質分 子。在過去的十年間，利用哺乳動物細胞表達系統高效表達重組蛋白的研究取得了令 人矚目的進展。目前，哺乳動物細胞表達系統不僅已經成為多種基因工程藥物的生產平臺， 而且在新基因功能的發現、蛋白質的結構和功能研究中也起了極為重要的作用。常用的用於表達重組蛋白的動物細胞有CHO細胞、骨髓瘤細胞(如Sp2/0和 J558L)、COS細胞、293細胞等。CHO細胞即中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary)。 其中CHO和NSO細胞是目前應用最多的哺乳動物細胞表達系統細胞。不同的細胞對重組蛋 白的修飾可能會稍有差別，如CHO細胞表達的人白血病抑制因子和人組織因子旁路抑制劑 分別存在N端和C端胺基酸的缺失，而這些改變在另外的一些細胞株中並未出現。真核細胞中，CHO細胞體系是目前重組糖基蛋白生產的首選體系。因為與其他表 達系統相比，它具有許多優點①具有準確的轉錄後修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分 子結構、理化特性和生物學功能方面最接近於天然蛋白分子；②具有目的產物胞外分泌功 能，便於下遊的分離純化；③具有重組基因的高效擴增和表達能力；④具有貼壁生長特性， 又可以進行懸浮培養，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，而且表達水平較高；⑤CHO細 胞屬於成纖維細胞(fibroblast)，很少分泌自身的內源蛋白，利於外源蛋白的後分離。但缺 點是CHO細胞培養成本高，條件難掌握，易汙染。目前已有越來越多的藥用蛋白在CHO細胞 中獲得了高效表達。外源基因在哺乳動物細胞有兩種不同的表達方式，一種稱為瞬時表達，另一種稱 為穩定表達。瞬時表達完全由導入的質粒來執行，質粒並沒有插入到細胞的染色體DNA中， 不存在因為重排和染色體不同部位對導入基因表達的影響。外源基因導入到哺乳動物細胞 後1-4天，就可以檢測到基因的表達情況，這種表達是這是由於一部分導入的DNA進入細 胞核後被轉錄成mRNA，再進入胞質被翻譯的緣故；由於這一方法比較簡單易行，通過選擇 好的表達載體和轉染方法，蛋白表達量能達到較高的程度，是研究蛋白結構功能的常用蛋 白表達方法。瞬時表達是暫時的，由於絕大多數轉入的外源基因沒有整合到細胞染色體上 而被降解或隨細胞分裂丟失，因此數天後，在轉染的細胞群中將無法再檢測到外源基因的 表達；也有外源基因在受體細胞中的複製和表達最終導致細胞的裂解而無法得到永久表達 (如具有SV40複製起始區的表達質粒在COS細胞中)。因為瞬時表達是由轉染效率、質粒DNA的質量(瞬時轉染所用的質粒DNA通常是超螺旋的環狀質粒)以及表達水平的不穩定 性引起的，所以在具體的實驗中需要很好地控制實驗的條件來縮小實驗批次間的差異。在穩定表達中，要使得導入的基因能永久表達，需要導入的DNA能隨細胞的分裂 而複製，這要求被導入的基因DNA整合到細胞的染色體DNA中，因此需要通過大量篩選來富 集這類細胞，這通常是利用同時導入外源基因和篩選標記基因來完成的。這些篩選基因提 供細胞一種藥物的抗性，故可以用相應的藥物來篩選和富集外源基因整合的細胞系。在穩 定表達中，由於外源基因整合到細胞的染色體上這一過程通常涉及DNA重排，以及受到插 入位點周邊序列的影響，故外源基因在不同的細胞克隆中表達水平差異很大，需要對多個 克隆細 胞進行表達量的鑑定。建立永久表達系主要是用於長期製備或利用某個蛋白。穩定 表達有時也能利用一些病毒能長期以附加體形式存在於細胞中的特性來實現，如EB病毒 和牛乳頭瘤病毒。另外，由於逆轉錄病毒和腺病毒相關病毒可以高效完整地將病毒基因組 DNA插入細胞染色體上也被被用於建立永久的表達細胞系。哺乳動物細胞大規模培養是藥用蛋白生產中一個非常重要的平臺。然而，該平臺 的生產還存在著一些缺點，包括蛋白生產的可預見性差、長期表達的表達量不穩定和表達 量不足等。與傳統的小分子藥物的生產相比，治療用蛋白的生產成本非常昂貴，因此，一個 能改善蛋白生產可預見性、產量和穩定性的方法，對哺乳動物細胞大規模表達外源蛋白是 非常有價值的。導致以上各種問題的一個主要的原因是與染色質有關。染色質在基因表達過程中 有著重要的影響。如果導入細胞的外源基因隨機整合進或靠近非親和染色質(異染色質) 的時候，這個外源基因的表達會被沉默掉。一個解決的辦法是把一些基因組邊界元件加在 外源基因的兩側，來消除異染色質的阻遏作用。迄今為止，已經發現的邊界元件主要有如下幾種核骨架結合區(matrix attachment regions, MARs)或稱為染色體支架區(scaffoldattachment regions, SARs)，座位控制區(locus control region, LCR)，隔離子(insulator)和抗阻遏子元件 (anti-repressor elements)等。這些元件為大小几十到幾千個鹼基組成的核苷酸序列，對 目的基因的表達提高和抵抗沉默方面有積極的意義。在實際操作過程中，為促進外源基因在動物細胞中高效表達，又不影響目的外源 基因的正常表達，這些邊界元件都被構建在質粒載體中外源目的基因轉錄本的外側，例如 增強子，經常位於轉錄本的一側，而抗阻隔子元件則被構建到轉錄本的兩側。另外，為了篩選得到最佳的邊界元件用於動物細胞大規模生產，對獲得的侯選元 件進行篩選評估，例如抗阻隔子元件的發現者Kwaks對採用鳥槍法獲得的來源於人骨肉瘤 細胞U20S的基因組中的幾十條候選序列進行研究分析，最後得到能顯著促進外源基因表 達的若干條抗阻遏子元件，大小不超過2100bp，並證明這些元件在鼠與人中有高度同源性， 能促進外源基因在人源和鼠源的細胞中高效表達。

發明內容
本發明的目的是公開了一種促進外源蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中高效表達的核 苷酸序列，該核苷酸序列見序列表SEQ ID N0. 1。本發明公開的這種促進外源蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中高效表達的核苷酸序列，自行命名為KH序列。KH序列也是一種邊界元件，被應用在構建入質粒載體中外源目的基因表達轉錄 本的一側或兩側，為首次公開的來源於CHO基因組的能應用於促進外源基因表達的邊界元 件。該序列是採用如下方法獲得首先設計的特異性上下遊引物KHF :5，> TGCTTTGAATGTTCAAGTAG GATCTAATGTACATCATGAG < 3'；取培養的CH0-dhfr_細胞約IX IO7個，採用基因組抽提試劑盒獲得CHO基因組，然 後以基因組DNA為模板，採用如下PCR反應體系CHO基因組DNA 2ul，dNTP2ul，KHF2ul，KHR 2ul, LA-taqO. 5ul, 10XLA-taq Buffer 2uIjH2O 9. 5ul，總體積 20ul ；以及如下 PCR 反應程 序-MV IOmin 之後，94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 45sec，共 32 個循環，最後是 72°C IOmin 等擴增而獲得的。本發明所公開的核苷酸序列KH，可以在構建含外源基因的重組表達質粒時，加在 外源基因轉錄本的任一側或兩側；含有該KH序列的重組真核表達質粒，可以轉染任何來源 於中國倉鼠的貼壁或懸浮型細胞株，如CH0-K1，CHO/dhfr-，DG44等，並有促進外源基因高 效表達的作用。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明將KH序列克隆到不同的表達載體的轉錄本兩側或者一側，然後再克隆入 相應的外源基因，將採用表達不同外源基因的表達載體分別轉染CH0-K1，CHO/dhfr-, DG44 等來源於中國倉鼠卵巢細胞的細胞株，經檢查相應的單克隆細胞形成率、單克隆細胞傳代 穩定性、外源基因表達水平等，數據顯示加了 KH序列能夠提高外源基因的表達水平以及提 高外源基因的傳代穩定性。以下採用具體的實施例對本發明進一步的詳細說明。


圖1為從CHO細胞基因組中PCR擴增獲得KH序列；第1列PCR產物；第2列DNA 分子量標準；圖2為重組質粒載體構建圖；圖3為不同質量的重組質粒分別轉染DG44細胞分泌表達FGF2比較；圖4為不同重組質粒轉染CHO-Kl後各單克隆細胞表達外源sPDGFR α -Fc的Q-PCR 結果示意圖；圖5為重組質粒pINKH-sPDGFR α -Fc轉染CHO-Kl後部分單克隆細胞表達外源 sPDGF-Fc的免疫印跡結果。
具體實施例方式以下所述的實施例，其限制性酶切酶購買自大連Takara公司和美國NEB公司， 質粒小提試劑盒、DNA切膠回收試劑盒、細胞基因組DNA抽提試劑盒購自廣州OMEGA公司， 去內毒素的質粒大抽試劑盒購自上海碧雲天生物技術公司，RNA提取試劑盒及相關試劑、 One-step RT-PCR試劑盒購自美國QIAGEN公司；細胞培養用的培養基DMEM/F12和新生牛血清、G418均購自美國Gibco公司，FGF2標準品、抗FGF2抗體和抗FC購自美國R&D公司， Dual-LuciferaseReporter Assay System的螢光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司； 轉染試劑Lipofectamine2000購自美國invitrogen公司。質粒pIRESneo3購買自美國Clotech公司，pcDNA3. 1購買自美國invitrogen公 司，pMD 19-T購自大連寶生物公司；細胞株CHO/dhfr-和CHO-Kl購自美國ATCC，細胞株 DG44及其無血清培養基購自美國invitrogen公司。其他常用化學試劑均為國產分析純。實施例1 :KH序列的獲得和序列鑑定 取培養的CHO細胞約IX IO7個，採用基因組抽提試劑盒獲得CHO基因組，然後 設計特異性的上遊引物KHF :5，> TGCTTTGAATGTTCAAGTAG GATCTAATGTACATCATGAG 90 %，離心收集細胞，調整細胞密度至 1 X 107/ml ；選用4mm的電擊杯，含細胞400 μ L，將去內毒素化的重組表達載體按5、10、15、 20、25、30、35和40 μ g分別加入各個電擊杯，每次電擊電壓為280V，電擊時間為20ms，室溫 操作，電擊後將電擊杯置至於冰上5min，之後補加1. 5mL培養基於37°C的5% FBS培養基 貼壁24h後，換液去死細胞，繼續培養至細胞融合率達到8(Γ90%左右，胰酶消化細胞，再重 新懸浮培養於20ml的無血清培養基中，至細胞密度達到7. 5XlOVml左右，細胞活力達到 95%左右，收集上清。2. 3ELISA鑑定外源TOF2的表達以 R&D 公司的 FGF2 作為標準品，將其稀釋為 2000ng/ml，1000ng/ml, 500ng/ml, 250ng/ml，125ng/ml，62. 5ng/ml，31. 3ng/ml 的各 100 μ □依次加入一排 7 孔中，另 1 孔只 加樣品稀釋液的作為零孔，再另一孔留空不加作為TMB空白顯色孔，每個樣設3個復孔 』另 取2. 2中各組的細胞培養上清，離心2000轉30min，收集上清，取100 μ □/孔直接加入酶 標板，每個樣設3個復孔。一酶標板加上蓋，置於溼盒中，37°C反應90分鐘或者4°C過夜一甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下，0. 1 % Tween20-PBS洗3次一加入10A BSA的PBS 室溫封閉lh，之後0.1 % Tween20-PBS洗3次一加入效價為1 5000的抗Fc抗體，工作液 按每孔0. Iml依次加入，(TMB空白顯色孔除外)，37°C反應2h，之後0. 1% Tween20-PBS洗 3飛次一按每孔IOOul依次加入TMB顯色液，室溫慢搖至顯色，加入2M的H2S04終止液終止 反應一用酶標儀在450nm波長測定0. D.值。通過標準蛋白的已知濃度系列稀釋，測出OD值後繪製出標準曲線，根據標準曲線 可推算出TOF2的含量。表3. DG44培養基上清中分泌表達的FGF2含量(ng/ml) 實施例4 應用KH序列使PDGFR- □融合蛋白在CHO-Kl中高效表達3. 1重組表達載體的構建與鑑定以可溶性血小板衍生因子膜外區並融合了人Fc蛋白(sPDGFRa -Fe)的核苷酸序 列為模板，PCR擴增sPDGFR α -Fe, Nhe I和BglII雙酶切，取真核表達載體pIRES_Neo3禾口 pIN-KH，採用Nhe I和BamHI (與BglII同為同尾酶)雙酶切，二者連接轉化感受態大腸桿菌 DH5 α後，塗布LB-AMP+平板，37°C 16 18h，篩選挑取3 5個單菌落，於5ml的LB-AMP+ 中擴培，抽提質粒，採用酶切鑑定和PCR擴增目的序列兩種方法鑑定重組子，並測序鑑定獲 得正確的重組表達載體，分別命名為pIN-sPDGFRa -Fc和pIN-KH-sPDGFRa -Fe。3. 2重組子轉染CHO-Kl細胞將CHO-Kl細胞鋪板培養於6孔板(完全培養基為含10%小牛血清的DF12)，當 細胞匯合度為70%時，將去內毒素化的重組表達載體按每孔8ugDNA/8ul陽離子脂質體 (Lipofectamine TM 2000)轉染細胞，於不加血清的培養基中培養24h後，更換成完全培養 基，再24tT48h後加篩選抗生素G418 (700ug -ml-1)，2周後可見到明顯單克隆細胞團，逐個 挑取到96孔板培養，此時，將G418濃度降為500ug ·πι1-1，待細胞長滿後，依次放大到24孔 板和細胞培養瓶中培養。3. 3總RNA的提取與RT-PCR鑑定陽性單克隆細胞Trizol 法提取總 RNA。逆轉錄反應條件為65°C 5min,30°C 10min,42°C 60min, 72°C IOmin0 PCR 反應條件為預變性 95°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 20s，32 個循環； 72°C延伸lOmin。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑑定目的條帶。3. 4Real-Time PCR檢測各陽性單克隆細胞表達目的基因的差異反應體系為模板cDNA 2ul，上遊引物(IOpmol · L_1)0. 8ul，下遊引物 (IOpmol · L-1) 0. 8ul, Real-Time PCR MIX IOul，雙蒸水 6. 4ul。反應條件為:95°C IOmin ；95°C 10s,60°C 20s, 72°C 30s, 32個循環。溶解曲線分析溫度55°C _95°C，每分鐘讀一次， 每個樣設置3個復孔，取均值，數值越低，則表示表達量越高。不同重組質粒轉染CHO-Kl後 各單克隆細胞表達外源sPDGFRa -Fc的Q-PCR結果如圖4所示。表4不同重組質粒轉染CHO-Kl後各單克隆細胞表達外源sPDGFRa -Fc的Q-PCR
結果 * 備註數據處理採用□ CT = CT 值(sPDGFR a -Fe) -CT 值(18S rRNA)，18SrRNA 內參校正cDNA加樣量的誤差。3. 5ffestern blot鑑定pINKH-sPDGF-Fc轉染獲得的重組單克隆細胞株的目的蛋 白表達去編號Bl至B5的單克隆細胞培養，細胞密度到100%後，裂解細胞，收集裂解液， 並對其進行蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳，溼法轉至PVDF膜，封閉，分別用抗Fc的單克隆 抗體(1 10000)及β-actina 10000)抗體4°C孵育過夜，相應二抗為羊抗鼠-HRP抗 體(1 1000)，加入ECL化學試劑於暗盒中X光膠片曝光檢測。結果顯示，B2的sPDGF-Fc表達最高，B5的最低，其結果與3. 4中Realtime PCR 的結果相符，也同時說明Realtime PCR的結果能夠反映外源基因的蛋白表達量的情況， 故結合圖4和表4結果可知，應用pINKH-sPDGF-Fc轉染獲得的重組單克隆細胞株較 pIN-sPDGF-Fc轉染獲得的重組單克隆細胞株從整體評估可知表達量較高，故該序列能夠有 效提高外源sPDGF-Fc的表達。重組質粒pINKH-sPDGFR α -Fc轉染CHO-Kl後部分單克隆細 胞表達外源sPDGF-Fc的免疫印跡結果如圖5所示。Untitled_ST25SEQUENCE LISTING暨南大學促進外源蛋白在CHO細胞中高效表達的核苷酸序列片段1PatentIn version 3. 51532DNACH0 細胞
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促進外源蛋白在CHO細胞中高效表達的核苷酸序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有權利要求1所述核苷酸序列片段的重組質粒表達載體。
3.由權利要求2所述重組質粒表達載體而得的重組微生物。
全文摘要
促進外源蛋白在CHO細胞中高效表達的核苷酸序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明將KH序列克隆到不同的表達載體的轉錄本兩側或者一側，然後再克隆如相應的外源基因，將採用表達不同外源基因的表達載體分別轉染CHO-K1，CHO/dhfr-，DG44等細胞，經檢查相應的單克隆細胞形成率、單克隆細胞傳代穩定性、外源基因表達水平等，數據顯示加了KH序列的載體能夠提高外源基因的表達水平以及提高外源基因的傳代穩定性。
文檔編號C12N1/00GK101838646SQ20091021398
公開日2010年9月22日 申請日期2009年12月18日 優先權日2009年12月18日
發明者洪岸, 陳小佳 申請人:暨南大學