檢測特定dna序列的方法和裝置的製作方法

2023-09-19 23:19:00

專利名稱：檢測特定dna序列的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及基於生物-化學-物理轉換方法和超聲微生物檢測裝置，通過採用互補DNA序列和與纖維蛋白原裂解酶連接的特定DNA序列的結合檢測微生物的特定DNA序列的存在，從而檢測樣品中微生物的存在。
背景技術：
生物分析物的存在的檢測存在很多方法，例如，酶免疫分析法(EIA)、放射免疫檢定法(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、聚合酶鏈反應(PCR)、實時PCR(RT-PCR)等。這些方法已經用於測量激素水平、抗原、抗體、酶、蛋白質、藥物、DNA的特定片段和汙染物等。在這些方法中，最常用的方法是PCR和RT-PCR，在這兩種方法中，提取含有感興趣的微生物的樣品的DNA。然後，將基因組的雙鏈DNA加熱至94-96°C並保持1_9分鐘，以便 DNA鏈的互補鹼基對之間的氫鍵斷裂，生成單鏈DNA。為了檢測樣品中感興趣的微生物的存在，添加互補的DNA寡聚核苷酸引物(例如F#1與R#1分別代表正向序列與反向序列)，與 DNA序列的相鄰片段相結合，該DNA序列的相鄰片段位於感興趣的DNA (單鏈DNA)的這一特定片段(序列#1)的上遊或下遊。當引物序列與模板序列密切匹配時，穩定的DNA-DNA氫鍵將形成，這一過程被稱為退火。然後，在保持20-40s前，將反應溫度降至50-65°C。添加脫氧三磷酸核苷，通過DNA聚合酶的作用(例如Taq聚合酶)，將生成與感興趣的DNA這一特定片段(序列#1)互補的、表明感興趣的微生物存在的DNA片段(稱為序列#2)。序列#1 稱為被轉錄，序列#2形成。這稱為延伸/延長步驟。隨著升溫(90°C )與降溫(50-60°C ) 的重複循環，在最終的延長步驟(70-75°C持續15分鐘)前，序列#1將多次被轉錄(通常 30-35次)。這確保任一剩餘的單鏈DNA充分延伸。採用PCR方法，使用瓊脂糖凝膠的瓊脂糖凝膠電泳將溶解含有特定DNA的轉錄片段的混合物。這些DNA片段和引物將根據他們的分子量溶解(resolve)。在紫外光(UV)下通過添加溴化乙錠實現DNA片段的可視化。如果感興趣的微生物存在於樣品中，在PCR步驟後，與互補DNA(序列#2)分子大小相同(right)的吸收紫外線的DNA帶將出現。隨後，在宿主細菌(例如大腸桿菌)中表達前， 將這一 PCR產物(假設序列#2)插入噬菌體載體系統(例如I^gem-Τ)中。然後可以使用傳統的雙脫氧法研究這一 DNA帶的DNA序列(例如序列#2)。如果以及當獲得的這一 PCR產物(實驗性獲得的序列#2)的測序結果與序列#1的測序結果互補時，該試驗被認為是肯定的。另一方面，採用RT-PCR方法，在起始的加熱步驟，將DNA結合染料(比如花青綠色染料) 加入到反應混合物中(與所有其他試劑)。採用與PCR方法類似的實驗條件，如果DNA(序列#1)的特定片段存在於樣品中，它將被存在的DNA聚合酶轉錄。重複轉錄將產生多個序列#2。隨著DNA序列的增加和DNA結合染料的存在，與DNA結合的染料的數量將增加。這一染料具有唯一的螢光特性，當其與DNA結合時將發螢光。因此，增加的螢光不僅表明這一互補DNA序列(序列#2)的存在，而且表明感興趣的微生物中DNA的這一片段的複製數目， 所述互補DNA序列表明這一感興趣的微生物的序列(序列#1)的存在因此表明感興趣的微生物的存在。
但是，雖然這些PCR與RT-PCR方法能夠現場用於室外操作，但是由於他們依靠螢光檢測和定量存在的分析物的水平，他們需要相對較重的儀器。因此，這些使用相對較重的儀器的方法不適合現場室外操作。本發明不需要螢光源以檢測感興趣的微生物的存在。另外，圖1中所示的每一部件可以僅僅為幾釐米大。就這一點而言，微生物檢測裝置的體積相對地可以是小的(例如在我們的樣機中為18cm長、8cm寬和5cm高)。另外，微生物檢測裝置可以全部是電池驅動。 因此，該裝置可以在沒有常規的電源供給的遠端位置操作。由於它的輕重量、可攜帶性和操作的簡單性，該裝置適合於手持現場室外操作。通過本發明，克服了現有檢測方法和裝置的缺點，可認識到其在生物分析物的分析領域中的優點。

發明內容
根據本發明的一個方面，本發明提供嵌入裝置中檢測樣品中微生物的存在的方法，所述裝置包括殼體，其包括與第一 DNA引物固定的基底，所述第一 DNA引物具有與感興趣的微生物的特定DNA序列互補的核苷酸序列；與第二DNA引物結合的纖維蛋白原分裂劑， 所述第二 DNA引物具有同樣與感興趣的微生物的DNA序列互補的核苷酸序列；用於用於清洗所述殼體的清洗單元；用於向所述殼體添加纖維蛋白原的纖維蛋白原添加單元以便纖維蛋白原與纖維蛋白原分裂劑發生化學反應產生粘性物質；用於向所述殼體發射超聲信號的超聲發射器；以及用於接收來自於所述殼體的超聲信號並將接收的超聲信號傳送給超聲分析器的超聲接收器，其中所述超聲分析器基於接收的超聲信號確定樣品中是否存在感興趣的微生物。根據本發明的另一方面，提供檢測樣品中微生物的存在的方法，所述方法包括固定第一 DNA引物與殼體中的基底，所述第一 DNA引物具有與感興趣的微生物的DNA序列互補的核苷酸序列；結合纖維蛋白原分裂劑與第二DNA引物，所述第二DNA引物具有與感興趣的微生物的DNA序列互補的核苷酸序列；通過緩衝液清洗所述殼體；向所述殼體添加纖維蛋白原以便纖維蛋白原與纖維蛋白原分裂劑發生化學反應產生粘性物質；影響從超聲發射器向超聲分析器的超聲信號的傳輸，其中，所述超聲分析器內的算法基於接收的超聲信號確定樣品中是否存在微生物。從以下將參照附圖介紹的示例性實施例，本發明的進一步的特點和方面是顯而易見的。


說明書中包含的且作為說明書一部分的附圖示出本發明的實施例，並與具體實施例一起解釋本發明的原理。圖1是依據本發明的實施例的超聲微生物檢測裝置的結構示意圖；圖2是DNA引物一端與殼體206固定、另一端從201至205與感興趣的微生物的互補DNA固定的實例的示意圖；感興趣的微生物上互補DNA的另一段與第二組DNA引物連接，在所述第二套DNA引物中，其自身通過雙功能的化學鍵與纖維蛋白原分裂劑連接；圖3A是具有多個孔的塑料(包括聚苯乙烯)微孔板的實例的示意圖，在所述孔中，所述第一組DNA引物與所述殼體結合；所述微孔板的孔不限於圓形；
圖:3B是微孔板的孔的實例的示意圖；所述孔包含DNA引物的(第一)鏈與感興趣的微生物的互補DNA的一段，這一微生物的DNA的另一段與互補的DNA引物的(第二)鏈結合，所述DNA引物與纖維蛋白原分裂劑連接；圖4是採用時間對信號繪製的圖形的實例的示意圖，所述信號是超聲接收器中接收的以接收的電壓或振幅量化的信號；圖5是根據本發明的實施例的示例性流程圖。
具體實施例方式本發明的各個實施例將在以下參照附圖描述。圖1是根據本發明的實施例的超聲微生物檢測裝置100的示意圖。檢測裝置包括殼體110、超聲發射器105、超聲接收器106、加熱/冷卻板103、一或多個溫度傳感器108、試劑傳遞管101與試劑移除管102和磁力攪拌機構104。殼體110用於確定其中的樣品中是否存在微生物。殼體110包含聚合物基底，比如塑料(包括聚苯乙烯)(例如用於製造酶標板)。所述殼體的形狀不限於矩形、圓柱形或圓形。所述殼體可以是任意適合於容納液體並允許DNA引物固定的封閉結構。另外，殼體 110適合於經過其中的超聲傳播。「樣品」指用於測試感興趣的微生物的存在的物質。例如，樣品可以是取白水庫、湖泊、河流、水潭、海洋、食物表面、任意容器表面、生物流體、組織勻漿或空氣樣品的物質(例如，來自感興趣的病原菌的DNA)。合適的過濾器將用於容納(trap)及濃縮樣品中的微生物，以通過本發明作進一步分析。可以使用從合適的營養瓊脂或細胞生長的細胞培養板直接獲得的微生物的菌落並將其直接加入殼體110中。通過加熱/冷卻板103加熱至大約 95 0C，微生物的DNA成分將釋放。圖2是DNA引物和樣品中感興趣的目標微生物的結合的例子的示意圖。在這一例子中，塑料聚合物207(例如聚苯乙烯)用於構成所述殼體110的基底，並且它也與DNA引物201結合。DNA引物201與基底207化學結合(206)。DNA引物201的鏈可能通過共價結合或非共價結合與塑料基底(比如聚苯乙烯)固定，結合方式取決於塑料(例如聚苯乙烯底部)和DNA引物間的反應。DNA引物201可能是具有6_30鹼基長的核酸鏈，比如化學合成的寡聚核苷酸。它包含與感興趣的目標微生物的部分DNA序列205互補的特定核苷酸序列。雖然僅僅闡述了 DNA引物的單鏈，但是DNA引物的多個鏈可能以相似的方式固定在塑料基底上(例如聚苯乙烯)。所述殼體還包括與第二 DNA引物202通過雙功能化學鍵203結合的纖維蛋白原分裂劑204(例如，各種類型的毒液包括拉塞爾蝰蛇的毒液中的凝血酶或活性組分，或其他天然的或合成的纖維蛋白原分裂化學製劑或酶)。DNA引物202也包含與樣品中感興趣的目標微生物的另一部分DNA序列(205)互補的特定核苷酸序列。雖然僅僅闡述了 DNA引物202 的單鏈，但是DNA引物的多個鏈可能以相似的方式與纖維蛋白原分裂劑結合。塑料基底207可能是例如，圖3A所示的微孔板孔300的形式或矩形或其他形狀。 微孔板包含唯一的或多個孔310。微孔板的每一個孔包含至少如圖:3B中所所示的DNA引物的單鏈。以示意性為目的，具有與DNA引物互補的DNA序列的微生物如圖;3B中所示。因此，樣品中感興趣的微生物的DNA的鏈與兩個DNA引物結合。
本發明還包括攪拌機構104，比如通過磁力攪拌器攪拌。所述磁攪拌器能夠輕輕地混合殼體110中的混合物。就這一點而言，該移動使得DNA樣品的鏈與DNA引物的鏈雜交與退火。加熱/冷卻板103能夠加熱或冷卻殼體以便殼體內部的混合物在期望的適合於化學反應的溫度範圍內(例如96°C至室溫)運行。加熱/冷卻板103可進一步包括監控殼體溫度的溫度傳感器108，以便殼體在期望的溫度運行。如果DNA樣品205與DNA引物201互補，(樣品中)微生物的DNA205鏈將如圖2 中所示與DNA引物201雜交(結合)。同樣，DNA205鏈的另一部分將與DNA引物202雜交 (結合)。換言之，形成了由DNA引物201、加上感興趣的目標微生物的互補DNA、加上另一互補的DNA引物、加上雙功能化學鍵203、加上纖維蛋白原分裂劑204組成的複合體。整個複合體與塑料基底207(例如，聚苯乙烯)共價或非共價連接206。但是，如果DNA樣品的鏈與DNA引物不互補，雜交將不會發生並且將不會形成複合體。其後，混合物經歷水浴處理，該水浴處理清洗掉沒有與DNA引物附著的過多的微生物。水浴可包含通過試劑管開口 101進入的PH常數水溶性緩衝液。如前所述，與DNA引物不互補的DNA鏈將不會與DNA引物結合。在這一水浴處理過程中，沒有結合的DNA鏈、纖維蛋白原分裂劑和其他鬆散物質被清洗掉並通過試劑管開口 102從殼體離開。就這一點而言，只有成功雜交的DNA鏈(例如，以複合體的形式)將保留在殼體中。在水浴處理後，純化的纖維蛋白原溶液或包含天然纖維蛋白原或合成的類纖維蛋白原物質的混合物通過試劑管開口 101添加至殼體110中。繼水浴處理之後，如果纖維蛋白原分裂劑仍然保留在殼體110中(由於與複合體連接，目標微生物是所述複合體中的部分)，纖維蛋白原分裂劑將將天然的或合成的纖維蛋白原化學轉換為粘性類型的混合物的纖維蛋白凝塊(或膠體)。一般而言，化學反應處理取決於樣品量的數量，需要幾分鐘來完成。然後，超聲發射器發出超聲信號(或波)穿過殼體110。雖然超聲發射器/接收器可能在纖維蛋白原的添加之前或之後的任一時間被激活，但是超聲發射器/接收器必須在殼體的混合物成為粘性的之前被激活。超聲發射器包含一或多個產生超聲信號的超聲換能器。發射的超聲信號由如圖1中所示的在殼體110另一端的超聲接收器接收。接收的超聲信號傳輸至超聲分析器(未示出)用於分析。圖4是在示波器上顯示的典型的接收的超聲信號的示意圖。如圖中所示，接收的電壓形式的超聲信號在10分鐘後顯著減少至大約0. 25V。因此，在短的一段時間內，可以確定存在複合體的粘度的改變。當超聲信號穿過凝塊時，超聲信號幅度將顯著降低。基於粘度的變化，可以確定感興趣的目標微生物是否存在於混合物中。超聲中的衰減根據穿過介質的距離測量超聲信號的幅度的下降。接收的超聲信號的衰減可以通過以下方程計算衰減=20 (log (V 接收的/V傳輸的)/d(dB/cm) (1)，胃中，V接收的是接收的超聲電壓，是傳輸的超聲電壓，以及d是超聲發射器和接收器之間的距離。基於衰減值，可以確定殼體110內部的內容物是否具有增強的粘度。當衰減值顯著減少時，例如低於10dB，可以確定殼體110內部的內容物具有增強的粘度。本發明不限制衰減範圍。圖5中闡述了檢測感興趣的目標微生物的DNA序列的示範性處理流程圖。在步驟 S501中，設置殼體110的溫度條件。殼體110包括與DNA引物的鏈結合的塑料聚合物基底(包括聚苯乙烯)207，所述DNA引物與特定類型的微生物的DNA序列互補。通過激活加熱 /冷卻板103，將殼體110調整至合適的溫度(例如，在大約90°C)。其後，在步驟502中添加樣品至殼體110。可通過試劑管101的開口添加樣品。然後，樣品在殼體中被混合，例如， 通過磁攪拌機構104攪拌。一般而言，整個混合物允許混合10分鐘。隨後，在添加DNA引物的鏈至殼體110前，將殼體110冷卻至大約56°C或更低，所述DNA引物與與纖維蛋白原分裂劑結合的特定類型的微生物的DNA序列互補。整個混合物允許再混合10分鐘。其後，在步驟503中，殼體用pH常數的水溶性緩衝液清洗以清洗掉未與DNA引物雜交的任意材料。在清洗後，再次激活加熱/冷卻板(培養箱)103以將殼體110帶至合適的溫度，所述合適的溫度用於纖維蛋白原裂解酶運轉和阻止纖維蛋白原的快速降解(例如，在大約37°C)。隨後，添加纖維蛋白原溶液至殼體110(步驟S505)。另外，激活超聲發射器105以發射超聲信號穿過殼體110(步驟S504)。請注意，可能在纖維蛋白原的添加之前或之後激活超聲發射器/接收器。所述系統允許混合物與添加的纖維蛋白原(天然的或合成的類纖維蛋白原物質) 化學反應一段預定的時間。然後，超聲接收器接收傳輸的超聲信號並將接收的超聲信號傳輸至超聲分析器109，用於分析。超聲分析器可能安裝在超聲微生物檢測裝置中或通過有線或無線連接與超聲微生物檢測裝置外部連接。其後，在步驟S506中，超聲分析器基於接收的來自於超聲接收器的超聲信號幅度，確定殼體110中是否有粘度變化。如果有粘度變化(步驟S506中的YEQ，超聲分析器確定微生物存在於樣品中(S508)。另一方面，在一段預定的時間後，如果複合體的粘度未改變(步驟S507中的NO)，超聲分析器確定微生物不存在於樣品中(S507)。然後，處理結束。本發明可能還包括基於接收的超聲信號、表明微生物是否存在於樣品中的顯示器 (例如，IXD顯示器)。例如，如果有粘度變化，超聲分析器109確定微生物存在並且顯示器將表明微生物存在。另一方面，在一段預定的時間後，如果殼體110內部的內容物的粘度未改變，超聲分析器109確定微生物不存在並且顯示器將表明微生物不存在。超聲分析器109的操作可能通過確定是否有粘度變化的計算機可執行程序代碼實現。計算機可執行程序代碼可能存儲在超聲分析器109的計算機可讀存儲媒介中。例如， 可以以系統、裝置、方法、程序、記錄媒介等的形式實現體積可以很小的本發明。通過使用本檢測方法和裝置，通過使用相應組的DNA引物可以檢測各種微生物， 所述DNA引物具有與感興趣的目標微生物的DNA序列互補的DNA序列。另外，本超聲微生物檢測裝置的用戶不需要具有生物化學和分子生物學的廣博知識，其對於執行基於螢光的檢測方法(例如，PCR和RT-PCR)是必須的。雖然本發明參照示範性實施例描述，應該明白的是本發明並不受限於公開的示範性實施例。以下的權利要求的範圍被認為是對本發明的最寬廣的解釋，以包括所有的改變和等同的結合和功能。
權利要求
1.一種檢測樣品中微生物的存在的裝置，其特徵在於，包括 殼體，所述殼體包括與第一 DNA引物固定的基底，所述第一 DNA引物具有與感興趣的微生物的DNA序列互補的核苷酸序列；與第二 DNA引物結合的纖維蛋白原分裂劑，所述第二 DNA引物具有與感興趣的微生物的DNA序列互補的核苷酸序列； 用於清洗所述殼體的清洗單元；用於向所述殼體添加纖維蛋白原的纖維蛋白原添加單元，以便添加的纖維蛋白原與纖維蛋白原分裂劑發生化學反應產生粘性物質；用於向所述殼體發射超聲信號的超聲發射器；以及用於接收來自於所述殼體的超聲信號並將接收的超聲信號傳輸至超聲分析器的超聲接收器，其中所述超聲分析器基於接收的超聲信號確定樣品中是否存在感興趣的微生物。
2.根據權利要求1所述的檢測樣品中微生物的存在的裝置，其特徵在於，所述基底是塑料，所述塑料包括聚苯乙烯或其他聚合物。
3.根據權利要求2所述的檢測樣品中微生物的存在的裝置，其特徵在於，所述基底是具有一或多個孔的微孔板。
4.根據權利要求1所述的檢測樣品中微生物的存在的裝置，其特徵在於，所述裝置還包括控制所述殼體的溫度的加熱/冷卻板和一或多個溫度傳感器。
5.根據權利要求1所述的檢測樣品中微生物的存在的裝置，其特徵在於，所述超聲分析器基於接收的來自於超聲接收器的超聲信號幅度確定粘度改變是否發生。
6.根據權利要求1所述的檢測樣品中微生物的存在的裝置，其特徵在於，所述裝置還包括用於混合所述殼體內部的物質的磁攪拌機構。
7.根據權利要求1所述的檢測樣品中微生物的存在的裝置，其特徵在於，所述裝置是可攜式的且可用於現場操作。
8.—種檢測樣品中微生物的存在的方法，其特徵在於，包括固定第一 DNA引物與殼體中的基底，所述第一 DNA引物具有與感興趣的微生物的DNA 序列互補的核苷酸序列；結合纖維蛋白原分裂劑與第二 DNA引物，所述第二 DNA引物具有與目的微生物的DNA 序列互補的核苷酸序列；添加包含感興趣的微生物的樣品以形成混合物； 在預定的持續時間內，培養所述混合物； 通過緩衝液清洗所述殼體；向所述殼體添加天然的或合成的纖維蛋白原，以便纖維蛋白原與纖維蛋白原分裂劑發生化學反應產生粘性物質； 向所述殼體發射超聲信號；接收來自於所述殼體的超聲信號並將接收的超聲信號傳輸至超聲分析器， 其中所述超聲分析器基於接收的超聲信號確定樣品中是否存在微生物。
9.根據權利要求8所述的檢測樣品中微生物的存在的方法，其特徵在於，所述基底是由聚苯乙烯或其他聚合物製成的塑料基底。
10.根據權利要求8所述的檢測樣品中微生物的存在的方法，其特徵在於，所述超聲分析器基於接收的來自於接收的超聲信號的超聲信號幅度確定粘度改變是否已發生。
全文摘要
檢測樣品中微生物的存在的裝置包括殼體，所述殼體包括與第一DNA引物固定的基底，所述第一DNA引物具有與感興趣的微生物的特定DNA序列互補的核苷酸序列；與第二DNA引物結合的纖維蛋白原分裂劑，所述第二DNA引物具有同樣與目的微生物的DNA序列互補的核苷酸序列；用於清洗所述殼體的清洗單元；用於向所述殼體添加纖維蛋白原的纖維蛋白原添加單元以便纖維蛋白原與纖維蛋白原分裂劑發生化學反應產生粘性物質；用於向所述殼體發射超聲信號的超聲發射器；以及用於接收來自於所述殼體的超聲信號並將接收的超聲信號傳輸至超聲分析器的超聲接收器，其中所述超聲分析器基於接收的超聲信號確定是否存在感興趣的微生物。
文檔編號C12M1/34GK102329723SQ20111015500
公開日2012年1月25日 申請日期2011年6月9日 優先權日2010年6月10日
發明者盧俊立, 柯少榮 申請人:香港理工大學