一種脂蛋白編碼基因的用途
2023-09-19 22:57:35 1
一種脂蛋白編碼基因的用途
【專利摘要】本發明披露了一種脂蛋白編碼基因的用途，經鑑定該基因與十字花科黑腐病病菌致病相關，故用於防治植物十字花科黑腐病病害。該基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質的如序列表中序列1所示的DNA序列。
【專利說明】一種脂蛋白編碼基因的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物病原細菌的致病相關基因及其用途，尤其涉及一種脂蛋白編碼基因在防治植物病害方面的應用。
【背景技術】
[0002]植物病害一直是農作物減產、品質降低的主要因子之一。隨著病原菌對藥物抗性的增強，農藥用量在不斷增加，這不僅加劇了環境汙染、藥物殘留，也大大提高了農業成本，因此，亟待研發新的防病治病策略和新型的無公害藥物。弄清植物病原菌侵染寄主的遺傳機制是開發新型藥物和防病策略的關鍵。
[0003]十字花科黑腐病菌，也稱野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xcc，Xanthomonascampestris pv.campestris),是一種能 在全球範圍內引起所有十字花科植物黑腐病的革蘭氏陰性細菌。該菌能在寄主的任何生長期通過水孔或傷口侵入植物體內，引起病害，寄主包括甘藍、花椰菜、大白菜、蘿蔔、油菜等。典型的黑腐病症狀是在葉緣上形成V字形病斑，隨著病斑的擴大，葉脈變黑，因而被稱為黑腐病。黑腐病被認為是對十字花科植物危害最為嚴重的病害，尤其在熱帶和亞熱帶地區，溫度和溼度都適宜於該菌的生長繁殖，因此發病更加嚴重。由於遺傳穩定性和遺傳可操作性，十字花科黑腐病菌一直被用作研究微生物與植物相互作用分子機理的模式細菌，是在經濟和科學意義上最重要且研究得最為深入的10個植物病原細菌的種之一。因此，鑑定與十字花科黑腐病菌致病相關的新基因，對防治植物病害具有顯著的意義。
[0004]目前，脂蛋白編碼基因XC2522在植物病原細菌中還未見有過報導。如果鑑定了十字花科黑腐病菌的致病相關基因，便能夠為防治十字花科植物黑腐病病害提供藥物靶標。
[0005]參考文獻
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【發明內容】
[0011]本發明所要解決的技術問題是提供一種脂蛋白編碼基因的用途，通過鑑定該基因與十字花科黑腐病菌致病相關而為防治十字花科植物黑腐病病害提供藥物靶標。
[0012]為了解決上述技術問題，本發明提供了一種脂蛋白編碼基因的用途，該基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA序列，經鑑定該基因與十字花科黑腐病病菌致病相關，故用於防治植物十字花科黑腐病病害。
[0013]優選地，該脂蛋白編碼基因是序列表中序列I所不的DNA序列。
[0014]本發明鑑定了脂蛋白編碼基因XC2522與十字花科黑腐病致病相關，因而能夠為防治十字花科植物黑腐病病害提供藥物靶標。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為脂蛋白編碼基因XC2522克隆的酶切電泳圖譜；
[0016]圖2為脂蛋白編碼基因XC2522缺失突變體D2522構建的驗證凝膠圖；
[0017]圖3為脂蛋白編碼基因XC2522突變體的過敏反應檢測；
[0018]圖4為脂蛋白編碼基因XC2522突變體的致病性檢測。
【具體實施方式】 [0019]以下結合附圖和優選實施例對本發明的技術方案進行詳細地闡述。應該理解，以下列舉的實施例僅用於說明和解釋本發明，而不構成對本發明技術方案的限制。
[0020]本發明旨在提供與十字花科黑腐病菌致病相關的脂蛋白編碼基因XC2522。首先確定XC2522基因與十字花科黑腐病致病性的關係，並擬闡明該基因在Xcc中過敏反應(HR)的功能，由此得到該脂蛋白編碼基因在防治植物十字花科黑腐病方面的用途。
[0021]本發明所提供的脂蛋白編碼基因，是編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA序列。
[0022]本發明提供的脂蛋白編碼基因是序列表中序列I所不的DNA序列。
[0023]目前，該脂蛋白編碼基因(以下簡稱XC2522基因)的序列已在美國國家生物技術信息中心(NCBI, National Center of Biotechnology Information)公布，其基因組序列號為NC_007086，該基因編碼蛋白序列號為YP_243592。攜帶該基因的質粒(自命名ρΚ2522和pL2522)已在廣西大學生命科學與技術學院保存。
[0024]序列表中序列I的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的編碼蛋脂蛋白的基因，由801個鹼基組成，含完整的nlpD基因，自5'端的第I位至第801位核苷酸為該基因的開放閱讀框(0RF，Reading Frame),自5'端的第I位至第3位核苷酸為該基因的起始密碼子GTG,自5'端的第799位至第801位核苷酸為終止密碼子TGA。
[0025]序列表中序列2的蛋白質是XC2522編碼的脂蛋白產物，由266個胺基酸組成。
[0026]本發明通過以下方法步驟鑑定編碼脂蛋白的基因與十字花科黑腐病致病相關:
[0027]( 一 ) XC2522基因的克隆
[0028]根據XC2522基因序列，利用Vector NTI軟體設計引物對C2522-F (B) /C2522-R (H)(BP aaaggatcctttccggtcccgccggaagtga/gggaagcttcagcccaaggccgttacgattc),以十字花科黑腐病菌8004菌株總DNA為模板，用PCR法擴增該基因片段序列，並將其克隆至克隆載體pK18mobsacB中，獲得重組質粒pK2522,經BamHI/Hindlll雙酶切驗證正確後進行測序；將測序驗證正確的XC2522基因片段克隆至穿梭載體pLAFR6中，獲得了含該基因的重組質粒PL2522，經PCR法驗證正確。請參見圖1，其中M為IOObp標準DNA(片段大小從大到小依次為 3kb，2kb，1.5kb, 1.2kb, lkb，0.9kb，0.8kb，0.7kb) ；1 為 XC2522 基因 PCR 產物；2 為酶切驗證 pK2522 (BamHI/Hindlll) ;3_4 為 PCR 驗證 pL2522 重組質粒。
[0029]( 二)XC2522基因缺失突變體的構建
[0030]根據XC2522基因序列，利用設計引物對D2522_LF/D2522_LR(即aaaggatcccaagaggttctggcgccggtc/aaatctagatgcgccctgctcatccgttcg)和 D2522-RF/D2522-RR(即 gggtctagactgtatctgcccaagaagtga/gggaagcttagatcatcgaacacactggct),以Xcc8004菌株總DNA為模板，用PCR法擴增該基因兩旁側片段序列(片段大小分別為718bp和722bp)，並將其先後克隆至pK18mobsacB中，獲得重組質粒pKD2522，經PCR驗證和BamHI/Hindlll雙酶切驗證正確後進行測序；將測序驗證正確的pKD2522通過三親接合導入Xcc8004菌株中，在加卡那黴素NYG平板上篩選獲得整合中間體，然後在含5%蔗糖NYG平板(不加抗生素)上篩選獲得缺失突變體D2522，經PCR驗證正確。請參見圖2，其中M 為 IOObp 標準 DNA (片段大小從大到小依次為 3kb，2kb，1.5kb, 1.2kb, lkb，0.9kb，0.8kb,
0.7kb) ；1為XC2522左旁側PCR擴增片段；2為XC2522右旁側PCR擴增片段；3為PCR驗證pKD2522(引物 D2522-LF/D2522-RR) ；4 為酶切驗證 pKD2522 (BamHI/Hindlll) ；5~6 為 PCR驗證 Xcc8004 和 D2522 (引物 D2522-LF/D2522-RR)。將 pL2522 三親導入 D2522，獲得互補菌株C2522。
[0031](三)XC2522基因突變體的過敏反應(HR)檢測
[0032]實驗所用非寄主植物為辣椒苗(種名為Capsicum annuum cV.ECff-1 OR)，接種方法為壓滲法。
[0033]將辣椒栽種於 室外約2到3個月至成株期後，選取六至八葉齡的全展葉片供試；
[0034]接種供試的Xcc菌株至加有相應抗生素的NYGB過夜培養至OD6tltl = 1.0以上；收集ImL的菌液，用ImL無菌水清洗並重懸；調OD600至0.3，用無針頭的針筒吸取10 μ L菌液壓滲到辣椒葉片背面的葉肉中，形成一個可見的浸潤斑；接種後保溼80%並置於螢光燈下按晝16h/夜8h的時間分配照射，24h後觀察結果並為結果照相；正對照選用十字花科黑腐病菌野生型8004菌株，負對照用avrBsl缺失突變體。
[0035]結果顯示，XC2522缺失突變體過敏反應(HR)基本喪失，互補菌株能基本恢復野生型表型。請見圖3，其中A為野生型Xcc8004 ；B為avrBsl缺失突變體；C為XC2522缺失突變體D2522 ；D為互補菌株C2522。
[0036](四)XC2522基因突變體的致病性檢測
[0037]實驗所用寄主植物為滿身紅蘿蔔苗(種名為Raphanus sativus var.radiculacv.Manshenhong)，所用接種方法為剪葉法。
[0038]將Xcc8004野生型菌株、XC2522基因缺失突變體D2522和互補菌株C2522在28°C下用NYGB培養基進行液體培養15至18h，用NYGB稀釋到0D600 = 0.001，用滅過菌的剪刀在菌液浸泡5秒後，在健康葉片距葉尖I至2cm垂直葉脈的方向剪到中軸處，停留5秒，被接種的植物在25至30°C培養一周後觀察結果。
[0039]該致病試驗表明，XC2522基因的缺失突變體D2522致病性顯著降低，互補菌株C2522能基本恢復野生型表型。請參見圖4。
【權利要求】
1.一種與十字花科黑腐病病菌致病相關的編碼脂蛋白的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，所述基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA序列。
2.按照權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述編碼脂蛋白的基因是序列表中序列I所示的DNA序列。
【文檔編號】C12N15/31GK103966239SQ201410212306
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】姜伯樂, 何勇強, 唐紀良, 楊麗超, 王凜, 陽麗豔, 周樂, 杭小紅 申請人:廣西大學