Cpped1基因的用途的製作方法

2023-09-19 23:07:15 1

專利名稱：Cpped1基因的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及CPPEDl基因的用途。
背景技術：
結核病(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，結核分枝桿菌不僅可引起肺結核(85%)，而且可引起肺外多種器官的結核病。儘管目前已有有效的抗結核藥物，但結核病仍然是當前感染性疾病的頭號殺手，全球每年約200萬人死於結核病；全球約三分之一的人口感染結核分枝桿菌，在這些被稱為結核菌潛伏感染(LTBI)的人群中，有約10%最終將進展為活動性結核病。由於目前缺乏有效的結核病疫苗，結核病的預防控制主要依賴於早期發現、治療、隔離活動性結核病人。然而，現今診斷活動性結核病的檢測技術存在嚴重不足，不能滿足臨床和結核病預防控制的要求1)痰結核分枝桿菌微生物檢查特異性高，是當前診斷活動性肺結核的金標準，但存在敏感性低(不足40%)，耗時長(結核菌培養耗時I 一 2個月)，實驗室生物安全要求高的缺點。2)結核分枝桿菌基因檢測，雖然實現了快速診斷的目的(I天)，但直接從痰標本進行的基因檢測在敏感性方面沒有顯著提高，且存在假陰性，假陽性的問題。3)免疫學檢測中抗體檢測被世界衛生組織認定不適合結核病的診斷；細胞免疫學檢測包括結核菌素皮試(TST)和結核菌幹擾素釋放試驗(IGRA)，不能有效判別活動性結核患者和結核菌潛伏感染者，雖然後者在活動性結核患者檢測的敏感性顯著高於其他檢測。CPPEDl也叫CSTP1，鈣調樣磷酸酯酶結構域包含蛋白1，屬於金屬磷酸酯酶超家族，該基因的功能未知， 目前尚沒有關於CPPEDl基因作為結核診斷標誌物的報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種CPPEDl基因的用途，CPPEDl基因可作為判別結核潛伏感染和活動性結核的分子標誌物。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現本發明提供了一種CPPEDl基因的用途，用於製備判別結核潛伏感染和活動性結核的產品。所述判別結核潛伏感染和活動性結核的產品優選包括用實時定量PCR或基因晶片檢測判別結核潛伏感染和活動性結核的產品。所述用實時定量PCR判別結核潛伏感染和活動性結核的產品優選至少包括一對特異擴增CPPEDl基因的引物。所述特異擴增CPPEDl基因的引物，優選為CPPEDl-F :5，-AGAAACTCGCTCGCCATGT-3，，CPPEDl-R :5，-CGCCCAGGATGAAGTAGAAT-3，；所述用基因晶片檢測判別結核潛伏感染和活動性結核的產品優選包括與CPPEDl基因的核酸序列雜交的探針。
利用本發明的試劑盒，可以檢測病人CPPEDl基因的表達情況，從而診斷病人是否患有活動性結核病。在本發明中，術語「引物」是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發DNA合成的起始點，在合適條件下誘發合成與核酸鏈互補的引物擴增產物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉錄酶)存在下，在一種合適的緩衝液中並在合適的溫度下進行擴增反應。優選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決於該引物的設計用途，但一般在15 25個核苷酸之間。在本發明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可以。經實驗證明，本發明CPPEDl基因在結核病人血液中的表達明顯高於健康人群以及潛伏感染人群，因此CPPEDl基因可作為診斷結核的特異標誌基因，使結核診斷更加準確、快速。


下面結合附圖和具體實施 方式對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明實施例1的CPPEDl基因在人外周血單個核細胞(PBMC)中差異表達的定量RT-PCR結果圖。圖2是本發明實施例2的CPPEDl基因在PBMC中差異表達的晶片結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明進行進一步描述實施例1本實施例將人群分為三組結核病患者、潛伏感染人群和健康人群(各20例)，通過檢測每例外周血單個核細胞(PBMC)中CPPEDl基因mRNA變化，發現其在結核病患者中呈明顯的上調表達趨勢。本實施例用定量RT-PCR方法檢測每例CPPEDl基因的表達變化。具體步驟如下步驟一外周血單個核細胞(PBMC)懸液的製備在離心管中加入淋巴細胞分離液(Fresenius Kabi NOrge As:LYS3773)5ml ;取上述確診的結核病患者，潛伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝靜脈血各2ml與等量IM的磷酸緩衝液(PBS)充分混勻得到混合液，用移液器將混合液沿管壁緩慢疊加於淋巴細胞分離液液面上，保持清晰的界面，2000轉/分離心20分鐘；用吸管吸取中間雲霧層置入另一離心管後接著加入5倍體積的IM PBS, 1500轉/分離心10分鐘洗滌細胞，棄上清，相同條件重複洗滌細胞一次，接著加入含小牛血清體積百分比為10%的的RPMI1640 (Thermo scientific SH30807. 01b) 1ml，重懸細胞，得到三組人群的各20例PBMC懸液；每例取20 μ I的PBMC懸液於血球計數板上，計數細胞濃度。步驟二 RNA抽提採用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit (貨號74106)對上述得到的三組人群的各20例PBMC懸液進行RNA抽提。具體操作是取上述含I X IO6個細胞的PBMC懸液於去DNA酶和RNA酶的離心管中，3000轉/分離心10分鐘，棄上清；在細胞沉澱中加入350 μ IBuffer RLT,充分混勻裂解；加入250 μ I無水乙醇，混勻，把液體轉移到RNeasy柱子中，8，OOOg離心30秒，棄廢液；加入350 μ I Buffer Rffl以8，OOOg離心30秒，棄廢液；加入80 μ I DNase 溶液(10 μ I DNase+70 μ I Buffer RDD),柱上消化 15min，8，OOOg 離心 30 秒，棄廢液；加入 350 μ I Buffer RWl, 8，OOOg 離心 30 秒，棄廢液；加入 500 μ I Buffer RPE,8，OOOg離心30秒，棄廢液；空甩，8，OOOg離心I分鐘；把柱子轉移到一個去DNA酶和RNA酶的1. 5ml離心管，加入40 μ I無RNase的ddH20,10，OOOg離心I分鐘，收集三組人群的各20例的RNA於-80 ° C保存、待用。步驟三反轉錄採用TAKARA公司的反轉錄試劑盒(DRR047)，取步驟二得到的RNA0. 5μ g進行反轉錄，該試劑盒較傳統反轉錄試劑盒增加了去除基因組DNA的步驟，可在最大程度上保證RNA的純度和擴增的特異性。分步如下(I)基因組DNA的去除反應表I
權利要求
1.一種CPPEDl基因的用途，其特徵在於，用於製備判別結核潛伏感染和活動性結核的產品
2.根據權利要求1所述的CPPEDl基因的用途，其特徵在於，所述判別結核潛伏感染和活動性結核的產品包括用實時定量PCR或基因晶片檢測判別結核潛伏感染和活動性結核的產品。
3.根據權利要求2所述的CPPEDl基因的用途，其特徵在於，所述用實時定量PCR判別結核潛伏感染和活動性結核的產品至少包括一對特異擴增CPPEDl基因的引物。
4.根據權利要求3所述的CPPEDl基因的用途，其特徵在於， 所述特異擴增CPPEDl基因的引物，為CPPEDl-F :5』 -AGAAACTCGCTCGCCATGT-3』，CPPEDl-R :5』 -CGCCCAGGATGAAGTAGAAT-3』。
5.根據權利要求2所述的CPPEDl基因的用途，其特徵在於，所述用基因晶片檢測判別結核潛伏感染和活動性結核的產品包括:與CPPEDl基因的核酸序列雜交的探針。
全文摘要
本發明提供了一種CPPED1基因的用途，用於製備判別結核潛伏感染和活動性結核的產品。所述判別結核潛伏感染和活動性結核的產品優選包括用實時定量PCR或基因晶片檢測判別結核潛伏感染和活動性結核的產品。經實驗證明，本發明CPPED1基因在結核病人血液中的表達明顯高於健康人群以及潛伏感染人群，因此CPPED1基因可作為診斷結核的特異標誌基因，使結核診斷更加準確、快速。
文檔編號C12Q1/68GK103045745SQ20121059182
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者陳心春, 周伯平, 楊倩婷, 張明霞, 蔡毅, 張國良 申請人:深圳市第三人民醫院