來自ulkenia的PUFA-PKS基因的製作方法

2023-09-19 23:04:00

來自ulkenia的PUFA-PKS基因的製作方法
【專利摘要】本發明涉及來自ulkenia的PUFA-PKS基因。具體而言，本發明涉及編碼特異於多酮化合物合酶(PKS)的序列的基因。由此合成的PKS特徵在於其產生PUFAs(多不飽和脂肪酸)的酶能力。本發明還涉及鑑定相應的DNA序列，以及所述核苷酸序列用於產生重組和/或轉基因生物的應用。
【專利說明】來自U I ken i a的PUFA-PKS基因
[0001]本申請為國際申請PCT/EP2005/003701於2006年12月8日進入中國國家階段、申請號為200580018878.7、發明名稱為「來自ulkenia的PUFA-PKS基因」的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明描述了對於多酮化合物合酶(polyketide synthase) (PKS)特異性的基因編碼序列。由它們合成的PKS的特徵是具有產生PUFAs (多不飽和脂肪酸)的酶學能力。本發明另外包括相應DNA序列的鑑定以及所述核苷酸序列對於生產重組和/或轉基因生物的用途。
【背景技術】
[0003]術語PUFAs (多不飽和脂肪酸)表示具有鏈長度>C12和至少兩個雙鍵的多重不飽和長鏈脂肪酸。有兩個PUFA的主要家族，其根據相對於烷基末端，在ω-3和在ω-6脂肪酸中的第一個雙鍵的位置而區別。它們是細胞膜的重要組分，在那裡它們以脂質，特別是磷脂的形式存在。PUFAs還作為在人和在動物中的重要分子，例如，前列腺素，白三烯和環前列腺的初級階段而起作用(Α.P.Simopoulos, essential fatty acids in health andchronic disease, Am.J.Clin.Nutr.1999 (70), pp.560-569)。ω -3 脂肪酸族的重要代表是DHA(二十二碳六烯酸)和ΕΡΑ( 二十碳五烯酸)，其可以在魚油和在海洋微生物中發現。ω-6脂肪酸的重要代表是ARA(花生四烯酸)，其出現在，例如，絲狀真菌中，但是也可以從動物組織如肝和腎中分離。DHA和ARA在人母乳中彼此相接出現。
[0004]PUFAs對於人 來說在適當發育方面，特別是對於發育腦，組織形成及其修復是必需的。因而，DHA是人細胞膜的重要組分，特別是神經的細胞膜。它在腦功能的成熟中發揮重要作用並且對於視力的發育是必需的。《-3PUFAS如DHA和EPA被用作營養添加劑，因為具有DHA充分供應的平衡營養對於某些疾病的預防有利(Α.P.Simopoulos, Essentialfatty acids in health and chronic disease, American Journal of ClinicalNutritionl999 (70)，pp.560-569)。例如，患有非胰島素依賴型糖尿病的成人呈現與後來出現的心臟問題相關的DHA平衡的缺陷或者至少是失衡的DHA平衡。同樣地，神經元疾病如，例如，阿爾茨海默病或精神分裂症伴隨著低的DHA水平。
[0005]有大量的DHA商業提取物的來源，例如，來自海洋冷水魚的油，蛋黃部分或海洋微生物。適於提取n-3PUFA的微生物發現於，例如，弧菌屬(Vibrio)的細菌中(例如，海產弧菌(Vibrio marinus))或腰鞭毛蟲(Dinophyta)中，其中特別是 Crypthecodinium 屬，如 C.cohnii 或在 Stramenopiles (或 Labyrinthulomycota)中，如 Pinguiophyceae 如，例如，Glossomastixj Phaeomonasj Pinguiochrysisj Pinguiococcus 和 PolypodochrysiS0其它生產PUFA的優選微生物特別屬於Thraustochytriales目，(Thraustchytriidea)具有 Japonochytrium 屬,Schizochytrium 屬,Thraustochytrium 屬,Althornia屬，Labyrinthuloides 屬，Aplanochytrium 屬和 Ulkenia 屬。
[0006]提取自商業上已知的PUFA來源如植物或動物的油的特徵經常是非常不均勻的組成。以這種方式提取的油必須進行昂貴的純化處理以便能夠富集一種或幾種PUFAs。另外，來自這些來源的PUFA的供應也會發生不可控制的波動。因而，疾病和天氣影響能夠減少動物也能夠減少植物的產量。從魚中提取PUFA出現季節波動並且甚至能夠由於過度捕撈或氣候變化(例如，厄爾尼諾現象)而暫時性地停止。動物油，特別是魚油，可以通過食物鏈從環境中積聚有害物質。已知動物受有機氯化物，例如，多氯化聯苯高度脅迫，特別是在商業性魚場中，其抵消了魚類消費的健康方面(Hites等,2004，Global assessment of organiccontaminants in farmed salmon, Science303, pp.226-229)。魚產品質量的所得損失導致消費者對於魚和魚油作為《-3PUFA來源的接受度下降。另外，從魚濃縮DHA因為高度技術需要而相對昂貴。另一方面，DHA存在於少數海洋微生物，佔細胞總脂肪組分的大約50%，並且它們能夠在大的發酵罐中進行相對經濟地培養。微生物的另一個優點是提取自它們的油的組成限於少數幾種組分。
[0007]對於長鏈PUFA如二十二碳六烯酸(DHA ;22: 6，n_3)和二十碳五烯酸(EPA ；20:5，n-3)的生物合成已知多種生物催化途徑。在真核生物中生產長鏈PUFA的常規生物合成途徑起始於亞油酸(LA ;18:2，n-6)和α亞油酸的δ-6去飽和作用。它導致由亞油酸合成Y亞油酸(GLA;18:3，n-6)以及由α亞油酸合成十八碳四烯酸(0ΤΑ ; 18:4，η_3)。對於η-6以及n-3脂肪酸來說，此去飽和作用後接延伸步驟以及δ-5去飽和作用，致成花生四烯酸(ARA ;20:4，η-6)和二十碳五烯酸(EPA ;20:5，η_3)。起始自二十碳五烯酸(EPA ；20:5, n-3)的二十二碳六烯酸(DHA ;22:6，n_3)的合成隨後能夠通過兩種不同的生物合成途徑發生。在所謂的線性生物合成途徑中，發生二十碳五烯酸(EPA ;20:5，n-3)延伸另外兩個碳單位，隨後發生S-4去飽和作用以形成二十二碳六烯酸(DHA ; 22:6，n-3)。這種生物合成途徑的存在能夠通過生物如破囊壺菌屬(Thraustochytrium)和裸藻屬(Euglena)中 δ -4 去飽和酶的存在而確證(Qiu,等,Identification of a delta4fattyacid desaturase from Thraustochytrium sp.1nvolved in the biosynthesis ofdocosahexaenoic acid by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae andBrassica juncea., J.Biol.Chem.276 (2001), pp.31561-31，566 和 Meyer 等,Biosynthesisof docosahexaenoic acid in Euglena graciI is:Biochemicaland molecular evidencefor the involvement of a delta4fatty acyl groupdesaturase.Biochemistry42 (2003)，pp.9779-9788)。起始自二十碳五烯酸(EPA ；20:5, n-3)的二十二碳六烯酸(DHA ;22:6, n-3)合成的第二條途徑，所謂的Sprecher途徑，獨立於δ -4去飽和作用。它由兩個連續延伸步驟，每步延伸2個碳單位至二十四碳五烯酸(24:5，n-3)以及隨後δ-6去飽和作用至二十四碳六烯酸(24:6，n-3)組成。隨後通過過氧化物酶體β氧化作用縮短兩個碳單位而接著發生二十二碳六烯酸的形成(H.Sprecher, MetaboIismof highly unsaturated n_3and n-6fatty acids.Biochimica et BiophysicaActal486(2000),pp.219-231)。這一第二生物合成途徑是在哺乳動物中佔優勢的DHA合成途徑(Leonard 等,Identification and expression of mammalian long-chainPUFA elongation enzymes.Lipids37 (2002)，pp.733-740)。對於 C20PUFA 形成的備選生物合成途徑存在於少數缺δ-6變性酶活性的生物中。這些生物包括，例如，原生生物Acanthamoeba sp.和Euglena gracilis。在備選的C20PUFA合成中的第一步在於C18脂肪酸，亞油酸(LA ;18:2，n-6)和α亞油酸(ALA ; 18:3，η_3)延伸兩個碳單位。隨後通過δ 8去飽和作用和接下來的δ 5去飽和作用將得到的脂肪酸二十碳二烯酸(20:2，η_6)和二十碳三烯酸(20:3，η-3)轉化成花生四烯酸(ARA ；20:4, η_6)和/或二十碳五烯酸(EPA ；20:5，n_3) (Sayanova和 Napier, Eicosapentaenoic acid:Biosynthetic routes and thepotential for synthesis in transgenic plants.Phytochemistry65 (2004), pp.147-158 ；ffallis 和 Browse ；The delta-8desaturase of Euglena gracilis:An alternatepathway for synthesis of20-carbon polyunsaturated fatty acids.Arch.Biochem.Biophys.362(1999)，pp.307-316)。
[0008]高等植物不具有由初級階段合成C20PUFA的能力。它們通過各種去飽和酶起始自硬脂酸(18:0)，形成油酸(C18:1 ； δ -9去飽和酶)，亞油酸(18: 2，η_6，δ 12去飽和酶)和α亞油酸(18: 3，η-3 ； δ 15去飽和酶)。
[0009]不過，某些海洋微生物採取完全不同的生物合成途徑來產生EPA和DHA。這些產生PUFA的微生物包括Y蛋白細菌的海洋代表以及少數幾種cytophaga fIavobacteriumbacteroides族和到目前為止的真核性原生生物，Schizochytrium sp.ATCC20888 (Metz等，2001，Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthasesin both prokaryotes and eukaryotes.Science293:290-293)。它們通過所謂的多酮化合物合酶(PKS)來合成長鏈PUFA。這些PKSs代表催化由酮化合物(ketide)單位組成的次級代謝產物合成的大酶(G.ff.Wallis, J.L.Watts 和 J.Browse, Polyunsaturatedfatty acid synthesis:what will they think of next ? Trends in BiochemicalSciences27(9) (2000)pp.467-473)。多酮化合物的合成包含許多與脂肪酸合成類似的酶反應(Hopwood&Sherman Annu.Rev.Genet.24 (1990) pp.37-66 ；Katz&Donadio Annu.Rev.0fMicrobiol.47(1993)pp.875-912)。
[0010]已知不同PUFA-PKSs (PUFA-合成的PKSs)的基因序列。由此，從海洋細菌Shewanella sp.分離出38kb基因組片段含有生產EPA的信息。隨後對這一片段的測序導致鑑定了 8 個開放閱讀框(ORFs) (H.Takeyama等，Microbiologyl43 (1997) pp.2725-2731)。來自Shewanella的這些開放閱讀框,其中五個與多酮化合物合酶基因密切相關。同樣,美國專利號 5，798，259 描述了來自 Shewanella putrefaciens SCRC-2874 的 EPA 基因簇。PUFA-PKS基因也發現於海洋原核生物Photobacterium profundum株SS9中(Allen和Bartlett, Microbiology2002, 148pp.1903-1913)和 Moritella marina 株 MP-1,早期的 Vibriomarinus (Tanaka 等,Biotechnol.Lettersl999, 21, pp.939-945)。類似的產生 PUFA 的 PKS樣ORFs也能夠在真核性原生生物Schizochytrium中鑑定(Metz等，Science293 (2001)pp.290-293，US 專利 N0.6，556，583 及 W002/083870A2)。在 Schizochytrium 中確定了三種ORFs，其與來自Shewanella的EPA基因簇呈現部分同一性。在少數原核生物和真核生物Schizochytrium中存在這些保守性PKS基因給出了暗示，PUFA-PKS基因可能在原核生物和真核生物之間進行了水平轉移。
[0011] 即使是使用正常情況下不產生PUFAs的微生物中分離的基因簇對PUFAs進行轉基因生產也已經能夠得以顯示了。因而，存在於來自Shewanella sp.SCRC-2738的簇中的上述五種ORFs (開放閱讀框)足以在非IPA生產者大腸桿菌(E.coli)和Synechoccus sp.中生產可測量量的 EPA (Yazawa, Lipidsl996, 31, pp.297-300 和 Takayama 等，Microbiologyl997，143,pp.2725-2731)。[0012] 通常，對於大規模生產PUFAs的新的PUFA生產者總是存在需要。首先這種生產是否發生在，例如，原核生物，原生生物或在植物中並不重要。目標始終是儘可能經濟地和以儘可能保護環境的方式大量生產高質量的PUFAs。本發明追求這一目標，因為它介紹了來自特別有效的PUFA生產者Ulkenia sp.的合適的PUFA-PKS基因。

【發明內容】

[0013]考慮到技術狀態，所以本發明的任務是從生產DHA的微生物Ulkenia sp.中鑑定和分離另外的PUFA-PKS基因，其極適於生產PUFAs。此外，應當獲得關於這些基因的位置和排列以及它們的調控元件的知識。由此獲得的知識，特別是由此獲得的核酸物質，應當使得PUFA-PKS基因在同系生物以及在轉基因生物中的加強表達成為可能。
[0014]通過本發明的權利要求書中所定義的主題解決了這些任務以及其它未曾被明確地說明但可以從本文件初始討論的聯繫中輕易得到或總結的其它任務。
[0015]1.PUFA-PKS，其特徵是它們
[0016]a.包括在SEQ ID N0.6 (ORFl)，7 (0RF2)，8和/或80 (0RF3)中所示胺基酸序列的至少其中一種，以及具有與它們有至少70%，優選80%，特別優選至少90%和更加特別優選至少99%和最優選100%序列同源性的同源序列，其具有PUFA-PKS的至少一個結構域的生物學活性，或
[0017]b.包括在 SEQ ID N0.32，34，45，58，59，60，61，72，74 和 / 或 77 中所示胺基酸序列的至少其中一種，以及具有與它們有至少70%，優選80%，特別優選至少90%和更加特別優選至少99%和最優選100%序列同源性的同源序列，其具有PUFA-PKS的至少一個結構域的生物學活性。
[0018]2.具有10個或更多ACP結構域的根據權利要求1的分離的PUFA-PKS。
[0019]另外，本發明在優選的方面涉及這樣一種PUFA-PKS，其包含與序列SEQ IDN0.6 (ORFl), 7 (0RF2)和/或8和/或80 (0RF3)的至少500個直接連續胺基酸具有至少70%，優選至少80%，特別優選至少90%和更加特別優選至少99%同一性的至少一種氨
基酸序列。
[0020]在另一個優選的方面，本發明涉及分離的DNA分子，其編碼根據任一項在前權利要求的PUFA-PKS。
[0021]後者優選特徵為它編碼與序列SEQ ID N0.6 (ORFl)，7 (0RF2)和/或8和/或80 (0RF3)的至少500個直接連續胺基酸具有至少70%同一性的胺基酸序列。
[0022]另外，本發明涉及這樣的分離DNA分子，其與來自序列SEQ ID N0.3，4，5和/或9的至少500個連續核苷酸具有至少70%，優選至少80%，特別優選至少90%和更加特別優選至少95%的同一性。
[0023]在另一個優選的方面，本發明涉及一種重組DNA分子，其包含與控制轉錄的至少一種DNA序列功能性連接的先前所述DNA分子的其中之一，優選選自SEQ ID N0.3，4和5和/或9或其至少500個核苷酸的部分以及它們的功能性變體。
[0024]在又一個優選的方面，本發明涉及包含前述重組DNA分子的重組宿主細胞。
[0025]在又一個優選的視點下，本發明涉及內源性表達具有至少10個ACP結構域的根據本發明的PUFA-PKS的重組宿主細胞。[0026]另外，在又一個優選的方面，本發明涉及一種生產含有PUFA的油的方法，包括培養這種重組宿主細胞，以及涉及以此方式生產的油。
[0027]另外，在又一個優選的方面，本發明涉及一種生產含有PUFA，優選DHA的生物質量的方法，包括培養這種重組宿主細胞，以及涉及以此方式生產的生物質量。
[0028]所以，在又一個優選的方面，本發明還涉及根據權利要求15的重組生物質量，其包含根據權利要求8的核酸和/或根據權利要求1的胺基酸序列或與它同源的至少500個連續胺基酸的部分。
[0029]本發明在又一個優選的方面還涉及SEQ ID N0.32，33，34，45，58，59，60，61，72，74和/或77中所示、來自包含SEQ ID N0.6，7，8和/或80的PUFA-PKS的個別酶結構域的用途，用於生產人工多酮化合物，例如，多酮化合物抗生素和/或新的，變化的脂肪酸。
[0030]根據本發明，有關核酸的同一性指示在待比較鏈的特定位置上的相同鹼基對。不過，缺口是有可能的。以％計算同一'I"生值的可能性由程序blastn和fasta代表。
[0031]就胺基酸而言，概念同源性也包含，例如胺基酸序列的保守性交換，其絲毫不影響蛋白質的功能和/或結構。甚至是這些同源性值也通過本領域熟練技術人員已知的程序，例如，blastp, Matrix PAM30, Gap Penalties:9, Extension:1 進行計算(Altschul等，NAR25, 3389-3402)。
[0032]來自Ulkenia sp.的PUFA-PKS基因的序列信息可由SEQ ID N0.3-5和/或9中所定義的核酸序列和胺基酸序列獲得。SEQ ID N0.1和2代表目前分離的兩種粘粒上的完整基因組DNA序列(見實 施例2和3)。後者對其部分包含PUFA合成所必需的三種相關開放閱讀框ORFsl-3的信息以及它們的側翼調控序列。另外，作為其結果提出了能夠源自基因組序列的蛋白質序列。
[0033]本發明另外包括用根據本發明的核酸對宿主生物進行同源和異源轉化用來生產高純PUFAs的方法。分離的開放閱讀框優選導致在同系生物和轉基因生物中生產PUFA，特別是 DHA, EPA 和 DPA。
[0034]由此生產的PUFAs優選作為生物質量的組分或作為油而存在。
[0035]在本發明之前，只有真核生物，原生生物Schizochytrium的PUFA-PKS基因是已知的(美國專利號6，566，583，W002/083870)。隨後測定的序列數據部分源自cDNA和源自染色體DNA。在本發明中首次從染色體DNA完全描述了對於PUFA合成必需的真核性原生生物的所有PUFA-PKS基因。這不僅導致確定了以往未知的來自Ulkenia sp.的PUFA-PKS編碼基因信息，還另外提供了關於側翼調控元件如轉錄啟動子和終止子的數據。此外，染色體序列信息使得深入了解個別PUFA-PKS基因的位置和排列成為可能。
[0036]這裡完全令人吃驚的是簇同樣地不再存在，因為以往知道它是來自原核性PUFA-PKS 代表如 Shewanella, Photobacterium 或 Moritella。鑑定的粘粒(Seq ID N0.1)一開始顯示個別ORFs的線性排列在Ulkenia中被打亂並且還顯示個別ORFs的閱讀方向是反向的(圖1)。這可能是大段基因轉座的結果。作為轉座的結果，個別ORFs還清楚地呈現彼此的更大間隔。因而，兩個ORFsl和2具有大約13kb的間隔。第三個ORF直到在另一個粘粒上才能夠在此情況下得以鑑定(Seq ID N0.2)並且在兩種粘粒之間(Seq ID N0.1和2)沒能發現部分同一性(圖1)。這意味著來自Ulkenia sp.的ORF在空間上不再位於兩種ORFsl和2附近。這作出結論，即PUFA基因簇，已知來自上述原核代表，不再存在於真核生物Ulkenia sp.中。已經部分測定了原生生物Schizochytrium的個別PUFA-PKS基因在基因組上的位置和排列(W002/083870)並且還顯示了兩種ORFs A和B的相反方向。不過，它們彼此僅僅分離4224個鹼基對。在專利申請W002/083870中將這一序列片段討論為具有雙向啟動子元件的基因間隔區。至少對於Ulkenia在同源性ORFsI和2之間的雙向啟動子元件似乎是不可能的，這是因為對於Ulkenia測定的12.95kb的間隔區。沒有其它明顯ORFs存在於來自Ulkenia的ORFsl和0RF2之間的12.95kb區域之內。表明區域中發生了大的重組和/或轉座事件。轉座酶樣事件也能夠基於少數重複序列重複而發生。
[0037]更加令人特別吃驚的是與EPA生產者Shewanella (6x ACP)和Photobacterium(5xACP)的 PUFA-PKS 以及 DHA 生產者 Moritella(5x ACP)和 Schizochytrium(9x ACP)的PUFA-PKS相比，來自Ulkenia sp.的PUFA-PKS具有最大數目的醯基載體蛋白的重複，有10個ACP結構域(圖3 )。這意味著分離自Ulkenia sp.的PUFA-PKS相對於來自親緣性原生生物Schizochytrium的PUFA-PKS不僅具有偏移性胺基酸序列，而且在結構上也是獨特的。另一種特性是這樣的事實，即來自Ulkenia sp.的第三個ORF相對於來自Schizochytrium的ORF C短了 38個胺基酸並且另包含了丙氨酸富集的結構域，該結構域並不以此方式存在於Schizochytrium中(圖6)中。令人感興趣的是,這種序列類似存在於來自ORFl的個別ACT結構域之間的區域並且可能代表連接區。所述相似性在於序列長度以及丙氨酸連續僅被個別脯氨酸和纈氨酸打亂的事實。相對於Schizochytrium ORF C缺失的0RF3中胺基酸的最大部分是刪除的結果，有30個胺基酸長，位於脫水酶/異構酶結構域之間(圖6)。作為結果，這些結構域位於相應的蛋白質上，彼此相距短的間隔，這能夠對於酶學活性具有影響。對於0RF3來說，即使其它的5』位置上的ATG密碼子也可作為起始密碼子，從而在理論上甚至是最大為1848個胺基酸長的ORF也能夠存在(Seq ID N0.9和80)。在此情況下甚至同時出現0RF3的變體也是可能的。
[0038]特別地，來自Ulkenia sp.的ORFl (Seq ID N0.3和6)在一方面包含所謂的β酮醯基合成酶結構域(Seq ID N0.14和32)，其特徵是靶標(motive) (DXAC) (Seq ID N0.12和30)。Ulkenia ORFl中酶學結構域的活性中心的靶標能夠以優選的形式擴展到17個胺基酸的範圍(GMNCVVDAACASSLIAV) Seq ID N0.11和29)。完整的β酮醯基合成酶結構域可以分成N末端(Seq ID N0.10和28)和分成C末端(Seq ID N0.13和31)部分。β酮醯基合成酶結構域的生物學功能是催化脂肪酸和/或PKS合成的縮合反應。進行延伸的醯基基團通過硫酯鍵結合到酶學結構域的活性中心的半胱氨酸基團並且以幾個步驟轉移到醯基載體蛋白上的丙二醯基團的碳原子2上，釋放C02。β酮醯基合成酶結構域後接丙二醯CoA-ACP轉移酶結構域(Seq ID N0.15和33)。此結構域催化丙二醯CoA轉移到醯基載體蛋白(ACP)上的4』_phosphopantetheine基團。丙二醯CoA-ACP轉移酶結構域也將甲基或乙基丙二酸酯轉移到ACP上，期間它們將分枝導入其它的線性碳鏈上。隨後將連接區域後接富含丙氨酸序列的部分(Seq ID N0.16和34)，該部分包含10個重複的醯基載體蛋白結構域(ACP結構域)(17-26和35-44)。這些ACP結構域對於它們的部分彼此通過連接區域相互分離，所述連接區域主要由丙氨酸和脯氨酸組成。每個ACP結構域的特徵是4』_phosphopantetheine分子(LGXDS(L/I))的結合祀標。所述4』 -phosphopantetheine分子在這裡結合到祀標內的保守絲氨酸上。ACP結構域通過4』_phosphopantetheine基團作為載體起作用來生長脂肪酸和/或多酮化合物鏈。與酮還原酶具有部分同一'I"生的序列(Seq ID N0.27和45)隨後接上。這些結構域的生物學功能在於3-酮醯基-ACP化合物的NADPH依賴型還原作用。它代表脂肪酸生物合成中的第一次還原反應。這種反應在多酮化合物合成中也經常發生(還參見圖3)。
[0039]來自Ulkenia sp.的0RF2 (Seq ID N0.4和7)也以β酮醯基合成酶結構域(Seq ID N0.50 和 58)起始，其特徵是靶標(DXAC) (Seq ID N0.48 和 56)。Ulkenia0RF2中酶學結構域的活性中心的這種靶標能夠以優選的形式擴展到17個胺基酸的範圍(PLHYSVDAACATALYVL)Seq ID N0.47和55)。完整的β酮醯基合成酶結構域可以分成N末端(Seq ID N0.46和54)和C末端(Seq ID N0.49和57)部分。此結構域的生物學活性對應於ORFl中所述的β酮醯基合成酶結構域。Kethosynthases在延伸循環中發揮關鍵作用並且顯示了比脂肪酸合成的其它酶更高的底物特異性。這再次後接與β酮醯基合成酶結構域具有較小部分同一性的序列片段。另外，這一結構域缺少用於活性中心的靶標DXAC。它具有來自II型PKS類似系統的所謂鏈長因子(CLF)的特性(Seq ID N0.51和59)。CLF胺基酸序列與酮合成酶具有部分同一性，但是沒有具有相應的半胱氨酸基團的特徵性活性中心。PKS系統中的CLFs的部分目前正以爭論方式進行討論。最近的結果指出CLF結構的部分在於丙二醯ACP的脫羧作用。產生的乙醯基隨後可以結合到β酮醯基合成酶結構域的活性中心上並且因而代表了起始縮合反應的所謂引動分子(priming molecule)。還發現CLF同源性序列作為分子PKS系統中的負載結構域。具有CLF序列特性的結構域存在於所有先前已知的PUFA-PKS系統。這後接醯基轉移酶結構域(Seq ID N0.52和60)。這種結構域催化許多醯基轉移如從醯基轉移到輔酶A或轉移到ACP結構域。來自0RF2的終止結構域顯示與氧化還原酶的部分同一性(Seq ID N0.53和61)並且很可能代表了一種烯醯基還原酶結構域。烯醯基還原酶結構域的生物學活性存在於脂肪酸合成的第二次還原反應中。它催化脂肪酸醯基ACP的反式雙鍵的還原(也參見圖2)。
[0040]來自Ulkenia sp.的0RF3 (Seq ID N0.5和8)由兩種脫水酶/異構酶結構域(SeqID N0.66，68，72和74)組成。兩種結構域都包含「活性位點」組氨酸，直接相鄰半胱氨酸(Seq ID N0.67和73以及Seq ID N0.69和75)。這些結構域的生物學功能是反式雙鍵插入到脂肪酸或多酮化合物分子中，伴隨著H20的分解和雙鍵隨後轉化成順式異構形式。第二種脫水酶/異構酶結構域併入丙氨酸富集區(Seq ID N0.70和76)，所述丙氨酸富集區沒有已知的功能但是可能代表連接區。這後接烯醯基還原酶結構域(Seq ID N0.71和77)，其與來自Ulkenia的已經存在於0RF2中的烯醯基還原酶結構域具有高度部分同一性。它的生物學功能對應於上面已經介紹過的烯醯基還原酶結構域(也參見圖
[0041]優選在來自Ulkenia sp.的ORFl起始ATG密碼子前面給出2000bp (Sequence IDN0.62)作為啟動子序列。它們特別優選1500bp，更加特別優選1000bp在起始密碼子之前。
[0042]優選可以在終止密碼子TAA之後給出2000bp (Sequence ID N0.63)作為ORFl的終止序列。特別優選1500bp，更加特別優選1000bp在終止密碼子之後。具有鹼基序列AATAAA的ORFl的mRNA合成的潛在終止信號存在於終止密碼子TAA之後的412bp。
[0043]優選在來自Ulkenia sp.的0RF2起始ATG密碼子前面給出2000bp (Sequence IDN0.64)作為啟動子序列。它們特別優選1500bp，更加特別優選1000bp在起始密碼子之前。
[0044]優選可以在終止密碼子TAA之後給出2000bp (Sequence ID N0.65)作為0RF2的終止序列。具有鹼基序列AATAAA的0RF2的mRNA合成的潛在終止信號存在於終止密碼子TAA 之後的 1650bp。
[0045]優選在來自Ulkenia sp.的0RF3起始ATG密碼子前面給出2000bp (Sequence IDN0.78)作為啟動子序列。它們特別優選1500bp，更加特別優選1000bp在起始密碼子之前。
[0046]優選可以在終止密碼子TAA之後給出2000bp (Sequence ID N0.79)作為0RF3的終止序列。具有鹼基序列AATAAA的0RF3的mRNA合成的潛在終止信號存在於終止密碼子TAA 之後的 4229bp。
[0047]PUFA，例如，DHA可以在Ulkenia sp.中進行同源生產，此外還可以在宿主，例如，大腸桿菌中利用本發明測定的序列信息進行異源生產。根據本發明的核酸序列可以用來提高PUFA的產量，其中它們被用來，例如，提高生產PUFA的生物中PUFA-PKS基因的數目。自然地，甚至是個別核酸片段，例如，編碼ACP結構域的序列片段也可在同源或異源生產生物中進行擴增。特別地，ACP結構域呈現自己提高生產，因為輔因子4-phosphapantheteine的結合位點對於PUFA合成是必需的。自然地，即使是不同調控元件，例如，啟動子，終止子和增強子元件的使用也能夠導致經遺傳修飾的PUFA生產者內產量的提高。在個別序列片段中的遺傳修飾能夠導致獲得產物結構的變化並且因而導致不同PUFAs的生產。另外，PUFA合成酶與多酮化合物合酶的相似性使得混合系統的構建成為可能。這種所謂的組合性生物合成允許新的人工生物活性物質的生產。例如，通過PKS-和PUFA-PKS單位的混合系統在轉基因微生物中生產的新型多酮化合物抗生素是有可能的。
[0048]適於這裡給出的PUFA基因的異源表達的宿主除了大腸桿菌之外為，例如，酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia Pastoris)或者絲狀真菌，例如，構巢麴黴(Aspergillus nidulans)和 Acremonium chrysogenum。通過將根據本發明的基因導入，例如，大豆，油菜，向日葵，亞麻或其它的，優選富含油的植物中來生成生產PUFA的植物。為了 PUFA基因的有效異源表達，甚至也可以使用其它的附屬基因，例如，4-phosphopantheteine轉移酶。另外，可以使用宿主特異性啟動子/操縱系統進行加強的或可誘導的基因表達。
[0049]可以使用多種原核表達系統進行PUFA的異源生產。可以構建除了相應的PUFA基因之外還包含啟動子，核糖體結合位點和轉錄終止子的表達載體。將大腸桿菌色氨酸生物合成的啟動子/操縱子區和λ噬菌體的啟動子引證作為大腸桿菌中這些調控元件的例子。同樣地，可以將可選擇的標記，例如，對氨苄青黴素、四環素或氯黴素的抗性用於合適的載體上。對於大腸桿菌的轉化非常合適的載體為PBR322，pCQV2和pUC質粒以及它們的衍生物。這些質粒可包含病毒以及細菌元件。可以使用每種源自大腸桿菌K12的菌株，例如，JM101，JM109，RR1，HB101，DH1或AGl作為大腸桿菌宿主菌株。自然地，所有其它慣用的原核表達系統也可以用於異源PUFA生產(還參見Sambrook等)。還可以使用生油(oil-building)細菌作為宿主系統。
[0050]可以將哺乳動物 、植物和昆蟲細胞以及真菌，例如，酵母用作真核表達系統。對於酵母系統來說，可以使用來自於糖酵解酶基因的轉錄起始元件。這包括乙醇脫氫酶，甘油醒-3-磷酸脫氫酶，phosphoglukoisomerase,磷酸甘油酯激酶等的調控元件。不過，即使是來自基因如來自酸性磷酸酶，乳糖酶，金屬硫蛋白或葡糖澱粉酶基因的調控元件也可以使用。這裡還使用允許加強的或可誘導的表達的啟動子。可由半乳糖誘導的啟動子(GAL I, GAL7 和 GALI O)也是令人特別感興趣的(Lue 等，1987Mol.Cell.Biol.7，p.3446ff.和Johnstonl987Mircobiol.Rev.51，p.458ff.)。3，終止序列還優選源自酵母。由於緊鄰起始密碼子(ATG)的核苷酸序列影響酵母中基因的表達，還優選來自酵母的有效翻譯起始序列。在使用酵母質粒的情況下，它們包含來自酵母的複製起點並且包含選擇標記。這種選擇標記優選是營養缺陷型標記，例如，LEU，TRP或HIS。這種酵母質粒是所謂的YRps (酵母複製性質粒)，YCps (酵母著絲點質粒)和YEps (酵母游離質粒)。沒有複製起點的質粒是Yips (酵母整合質粒)，其用於整合轉化的DNA至基因組中。特別感興趣的是質粒pYES2和pYX424以及pPICZ質粒。
[0051]如果將絲狀真菌，例如，構巢麴黴用作異源PUFA生產者，也可以使用來自對應生物的啟動子。可以將用於加強表達的gpdA啟動子和用於可誘導表達的alcA啟動子用作實例。優選使用酵母質粒如 pHELP(D.J.Balance 和 G.Turner (1985)Development of ahigh-frequency transforming vector for Aspergillus nidulans.Gene36, 321-331)和可選擇標記如ura, bio或paba用於轉化絲狀真菌。甚至優選來自絲狀真菌的3』調控元件。
[0052]通過杆狀病毒表達系統可以在昆蟲細胞中生產PUFA。這些表達系統可由，例如Clonetech 或 Invitrogen 商購。
[0053]可以將載體，例如，來自土壤桿菌的Ti質粒或完整病毒如菜花樣花葉病毒(CaMV),雙粒病毒，番茄金黃花葉病毒或菸草花葉病毒(TMV)用於植物的轉化。優選的啟動子為，例如，CaMV的35S啟動子。對於植物轉化的其它可能性為磷酸鈣法，聚乙二醇法，微注射，電穿孔或原生質體的脂染。還優選通過用DNA帶電微粒轟擊(基因槍)進行的轉化。植物中備選的PUFA生產源自葉綠體的轉化。例如，N末端引導肽使得蛋白質在葉綠體中的轉運成為可能。優選的引導肽源自核酮糖雙磷酸酯羧化酶的小亞基但是也可以使用其它chloroplastidary蛋白的引導肽。葉綠體基因組的穩定轉化提供了另一種可能性。對此尤其可以考慮生物飛彈法還可以考慮其它方法(Blowers等Plant Celll9891pp.123-132，Kline 等.Naturel987327pp.70-73 和 Schrier 等 EmboJ.4pp.25-32) ο
[0054]對於哺乳動物細胞還可以使用可以商購的表達系統。其中，可以使用病毒性或非病毒性轉化和表達系統，例如，慢病毒或腺病毒系統或Invitrogen的T-Rex系統等作為例子。同樣，來自Invitrogen的Flp-1n系統,可以用於哺乳動物細胞中DNA的目的性整合。
[0055]下面利用幾個實施例介紹構成了根據本發明方法基礎的核酸和胺基酸。不過，所述序列和本發明並不限於這些實施例。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1描述了來自Ulkenia sp.的PUFA-PKS基因在基因組上的位置。另外，顯示了由這些基因編碼的PUFA-PKS的個別結構域。KS:酮合成酶，MAT:丙二醯-CoA = ACP醯基轉移酶，ACP:醯基載體蛋白，KR:酮還原酶，CLF:鏈長因子，AT:醯基轉移酶，ER:烯醯基還原酶和DH:脫水酶/異構酶。[0057]圖 2 顯不來自 Ulkenia sp.的 0RF2 和 0RF3 與來自 Moritella marina (GenBank 編號:AB025342.1), Photobacterium profundum SS9 (GenBank 編號:AF409100), Shewanellasp.SCRC-2783(GenBank 編號:U73935.1)和 Schizochytrium(GenBank 編號:AF378327，AF378328，AF378329)的相應同源性ORFs的比較。在進化過程中個別ORFs之中和之間的基因轉座也在結構域結構旁邊指出。
[0058]圖 3 顯不來自 Ulkenia sp.的 ORFl 與來自 Moritella marina (GenBank 編號:AB025342.1), Photobacterium profundum SS9 (GenBank 編號:AF409100), Shewanellasp.SCRC-2783 (GenBank 編號:U73935.1)和 Schizochytrium(GenBank 編號:AF378327，AF378328，AF378329)的相應同源性ORFs的比較。強調了 ACP結構域和胺基酸連續LGIDSIKRVEIL重複的數目。
[0059]圖4包含了來自Ulkenia sp.的ORFl與來自Schizochytrium的ORF A的序列比較。兩種序列的部分同一性的程度為大約81.5%。
[0060]圖5包含了來自Ulkenia sp.的ORF2與來自Schizochytrium的ORF B的序列比較。兩種序列的部分同一性的程度為大約75.9%。
[0061]圖6包含了來自Ulkenia sp.的0RF3與來自Schizochytrium的ORF C的序列比較。兩種序列的部分同一性的程度為大約80.0%。
[0062]圖7描述了由FASTAX進行的，實施例1中所述PCR產物與資料庫序列(Swiss-PROT全文庫)的序列比較。
[0063]圖8顯示了用於生產來自實施例2的粘粒庫的Cosmid SuperCosI (Stragagene)的載體圖(card)。
[0064]圖9描述了由BLASTX進行的，實施例3中所述PCR產物與資料庫序列(Swiss-PROT全文庫)的序列比較。
【具體實施方式】
[0065]實施例1:
[0066]從分離自Ulkenia sp.SAM2179的DNA擴增PUFA-PKS特異性序列
[0067]1.1包含編碼PUFA-PKS的基因的基因組DNA的分離
[0068]在250ml 帶有阻流板的 Erlenmeyer 燒瓶中用 Ulkenia sp.SAM2179 接種 50ml DHl培養基(50g/l 葡萄糖；12.5g/l 酵母提取物；16.65g/l Tropic Marin ；pH6.0)並於 28°C和150rpm培養48h。隨後用滅菌自來水洗滌細胞，離心下去並將細胞沉澱物冷凍於_85°C中。為了進一步的檢查(workup)，隨後將細胞沉澱物轉移入研缽中並以研棒在液氮下粉碎成精細粉末。隨後，將大約1/10研成粉末的細胞材料與2ml裂解緩衝液(50mM tris/Cl pH7.2 ；50mM EDTA ；3% (v/v) SDA ； 0.01% (v/v)2_巰基乙醇)混合併於68°C溫育lh。隨後加入2ml苯酹/氯仿/異戍醇(25:24:1),攪動並於1000OOrpm離心20min。在除去上層水相後，將後者轉移入兩個新的反應容器中，每個600 μ I，並且分別再次與600 μ I苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合，攪動並於13000rpm離心15min。隨後將特定上層相每個400 μ I轉移入新的反應容器中並在每種情況下加入1ml乙醇(100% )後倒轉兩到三次。隨後，將沉澱的DNA纏繞在玻璃棒上，用70%乙醇洗滌，乾燥並溶於50 μ I蒸餾水中。將以此方式提取的DNA與2 μ I RNase A混合併保存於4°C待用。
[0069]1.2利用靶標特異性寡核苷酸進行PCR反應
[0070]將PCR引物MOFl和MORl用作靶標特異性寡核苷酸。
[0071]M0F1:5，-CTC GGC ATT GAC TCC ATC-3』 (Seq ID N0.81)MORl:5，-GAG AAT CTCGAC ACG CTT - 3，(Seq ID N0.82)。將在上面 1.1 段中所述的來自 Ulkenia sp.SAM2179 的基因組DNA稀釋1:100。隨後將2 μ I的這種稀釋液轉移入50 μ I體積的PCR反應混合物中(Ix 緩衝液(Sigma) ；dNTPs (每種 200 μ Μ) ；M0F1 (20pmol)，MORl (20pmol)和 2.5U Taq-DNA聚合酶(Sigma))。在下列條件下實施PCR:起始變性94°C 3min，隨後為30個循環，每個循環於94°C lmin, 55°C lmin, 72°C lmin，和最後8min72°C。隨後通過凝膠電泳分析PCR產物並通過T/A克隆(Invitrogen)將具有合適大小的片段插入載體pCR2.1T0P0中。在轉化大腸桿菌T0P10F』之後,分離質粒DNA (Qiaprep Spin, QUAGEN)並進行測序。
[0072]將獲得的序列數據與官方EMBL核苷酸序列資料庫(http://www.eb1.ac.uk/embl/)相比較並進行評估。用FASTAX獲得的序列比較對於來自Ulkenia sp.SAM2179的PCR主要產物與來自 Schizochytrium sp.ATCC20888 的 PUFA-PKS (ORF A ；0RF:開放閱讀框)的醯基載體蛋白產生部分同一性，其在胺基酸水平上為大約90% (圖7)。令人吃驚的是，為了確定在Ulkenia sp.SAM2179中的這種PUFA-PKS，僅須實施單次PCR實驗。這說明所用寡核苷酸的特別高的效力。
[0073]實施例2:
[0074]由來自Ulkenia sp.SAM2179的基因組DNA生產基因組文庫
[0075]在500 μ I 體積中以 2.5U Sau3AI 於 37 °C 2min 將來自 Ulkenia sp.SAM2179 的50 μ g基因組DNA部分裂解並且接下著立即用相同體積的苯酚/氯仿進行沉澱，隨後用乙醇沉澱並溶解於蒸餾 水中。隨後根據生產商的說明書用SAP (蝦鹼性磷酸酶；R0Che)將Sau3AI裂解的基因組DNA去磷酸化。隨後通過將該反應加熱20分鐘至65°C來進行酶的滅活。將粘粒 Supercos I (Stratagene,圖 8)用作載體。將 10 μ g Supercos I 用 XbaI 於 37°C完全裂解幾小時。隨後將酶於65°C加熱滅活20min並且根據生產商的說明書用SAP(Roche)將剪切的粘粒去磷酸化。在這裡也通過將該反應於65°C加熱20分鐘進行酶的滅活。隨後用BamHI於37°C將XbaI裂解的和去磷酸化的Supercos I粘粒完全裂解幾小時。隨後將剪切的粘粒DNA用苯酚/氯仿進行沉澱，用乙醇沉澱並接下來溶解於蒸餾水中。為了進行連接，將I μ g用XbaI和BamHI裂解的粘粒DNA，和3.5 μ I Sau3AI裂解的基因組DNA組合於20 μ I的體積中並用Τ4連接酶(Biolabs)根據生產商的說明書連接幾小時。隨後根據生產商的說明書利用 Gigapack III XL Packaging Extract (Stratagene)將大約 1/7 的連接物包裝在噬菌體中。隨後將後者用於轉染大腸桿菌XLl-Blue MR。隨後以PCR篩選的形式由QIAGEN公司(Hilden，Germany)由基因文庫中進行PUFA-PKS特異性粘粒的分離，所述PCR篩選利用 Ulkenia-PKS-特異性寡核苷酸 PSF2:5』 -ATT ACT CCT CTC TGC ATC CGT - 3』 (Seq IDN0.83)和 PSR2:5』 -GCC GAA GAC AGC ATC AAA CTC-3，(Seq ID N0.84)。隨後對由此確定的粘粒克隆C19F09的粘粒DNA進行分離和測序(Seq ID N0.1)。
[0076]實施例3:
[0077]來自Ulkenia sp.的 0RF3 的鑑定
[0078]為了鑑定來自Ulkenia sp.SAM2179的0RF，寡核苷酸源自不同PUFA-PKS的高度保守的序列片段。令人感興趣的是，對於PCR擴增似乎合適的非常高的部分同一性出現在個別物種之間編碼脫水酶/異構酶的序列片段區域。
[0079]3.1包含編碼PUFA-PKS的基因的基因組DNA的分離
[0080]參見實施例1.1
[0081 ] 3.2利用PUFA-PKS-特異性寡核苷酸進行的PCR反應[0082] 將下列PCR弓丨物用作PUFA-PKS-特異性寡核苷酸:
[0083]CFORl: 5，-GTC GAG AGT GGC CAG TGC GAT - 3』 (Seq N0.85)
[0084]CREV3:5』 -AAA GTG GCA GGG AAA GTA CCA _3』 (Seq ID N0.86).[0085]將在上述3.1段所述的來自Ulkenia sp.2179的基因組DNA稀釋到1:10的比例。隨後將2μ I這種稀釋液轉移入50μ I體積的PCR反應混合物中(Ix緩衝液(Sigma) ；dNTPs(每種 200 μ Μ) ；CF0R1 (20pmol), CREV3 (20pmol)和 2.5U Taq-DNA 聚合酶(Sigma)。在下列條件下進行PCR:94°C初始變性3min,隨後30個循環，每個循環於940C Imin, 60°C Imin, 72°C Imin,和最後8min72°C。隨後通過凝膠電泳分析PCR產物並通過T/A克隆(Invitrogen)將合適大小的片段插入載體pCR2.1T0P0中。在轉化大腸桿菌E.coli T0P10F』之後,分離質粒DNA(Qiaprep Spin, QUAGEN)並進行部分測序。
[0086]將獲得的序列數據與官方EMBL核苷酸序列資料庫(http://www.eb1.ac.uk/embl/)相比較並進行評估。用FASTAX獲得的序列比較對於來自Ulkenia sp.SAM2179的PCR主要產物與來自Schizochytrium sp.ATCC20888的PUFA-PKS合成酶的ORF C產生部分同一性，其在胺基酸水平上為大約80% (圖9)。令人吃驚的是，為了確定在Ulkenia sp.SAM2179中的這種PUFA-PKS，僅須實施單次PCR實驗。這說明所用寡核苷酸的特別高的效力。隨後以PCR篩選的形式通過QIAGEN公司(HiIden，Germany)由實施例2中所述基因文庫中分離PUFA-PKS特異性粘粒，所述PCR篩選利用已經用於PCR的寡核苷酸CFORl: 5』 -GTCGAG AGT GGC CAG TGC GAT - 3』 (Seq ID N0.85)和 CREV3:5』 -AAA GTG GCA GGG AAA GTACCA - 3』 (Seq ID N0.86)。隨後對由此確定的粘粒克隆058G09的粘粒DNA進行分離和測序(Seq ID N0.2)。
【權利要求】
1.具有PUFA-PKS酶活性的多肽，其包括: a.具有β酮醯基合成酶的生物學活性的SEQID N0.6 (ORFl)所示的胺基酸序列，或具有β酮醯基合成酶的生物學活性的與SEQ ID N0.6 (ORFl)有至少90%序列同一性的胺基酸序列，或 b.具有β酮醯基合成酶的生物學活性的SEQID N0.32所示的胺基酸序列，或具有β酮醯基合成酶的生物學活性的與SEQ ID N0.32有至少99%序列同一性的胺基酸序列，或 c.具有丙二醯CoA-ACP轉移酶的生物學活性的SEQID N0.33所示的胺基酸序列或具有丙二醯CoA-ACP轉移酶的生物學活性的與SEQ ID N0.33有至少90%序列同一性的胺基酸序列，具有富含丙氨酸序列的部分的生物學活性的SEQ ID N0.34所示的胺基酸序列或具有富含丙氨酸序列的部分的生物學活性的與SEQ ID N0.34有至少90%序列同一性的胺基酸序列，或具有3-酮醯基-ACP化合物的NADPH依賴型還原酶的生物學活性的SEQ ID N0.45所示的胺基酸序列，或具有3-酮醯基-ACP化合物的NADPH依賴型還原酶的生物學活性的與SEQ ID N0.45有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
2.具有10個或更多ACP結構域的根據權利要求1的具有PUFA-PKS酶活性的多肽。
3.根據任一項在前權利要求的具有PUFA-PKS酶活性的多肽，其特徵是它包含與序列SEQ ID N0.6 (ORFl)的至少500個直接連續胺基酸具有至少90%，優選至少99%序列同源性的胺基酸序列，並且具有PUFA-PKS的至少一個結構域的生物學活性。
4.一 種胺基酸序列，它與SEQ ID N0.6 (ORFl)的至少500個直接連續胺基酸具有至少90%，優選至少99%的同一性，並且具有PUFA-PKS的至少一個結構域的生物學活性。
5.一種分離的DNA分子，其編碼根據任一項在前權利要求的胺基酸序列和與它完全互補的DNA。
6.根據權利要求5的分離的DNA分子，其特徵是它與來自SEQID N0.3的至少500個直接連續核苷酸具有至少70%，優選至少80%，特別優選至少90%和更加特別優選至少95%的同一性。
7.包含根據權利要求5或6其中之一的DNA分子的重組DNA分子，其與至少一種控制轉錄的DNA序列功能性連接，所述DNA序列優選選自SEQ ID N0.XX-YY (終止子/啟動子)，或其來自至少500個核苷酸的部分以及它們的功能性變體。
8.包含根據權利要求7的重組DNA分子的重組宿主細胞。
9.根據權利要求8的重組宿主細胞，其內源性表達具有至少另一種PUFA-PKS結構域活性的根據權利要求1的具有PUFA-PKS酶活性的多肽。
10.一種生產含有PUFA，優選DHA的油的方法，包括培養根據權利要求8或9的宿主細胞。
11.根據權利要求10的方法生產的油。
12.—種生產含有PUFA，優選DHA的生物質量的方法，包括培養根據權利要求8或9的宿主細胞。
13.根據權利要求12的方法生產的生物質量。
14.根據權利要求13的重組生物質量，其包含根據權利要求7的核酸和/或根據權利要求I的具有PUFA-PKS酶活性的多肽或與它同源的至少500個連續胺基酸的部分。
15.包含具有PUFA-PKS酶活性的多肽的來自SEQID N0.6的個別酶結構域用於生產人工多 酮化合物的用途。
【文檔編號】C12N9/02GK103981156SQ201410175661
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2005年4月8日 優先權日:2004年4月8日
【發明者】託馬斯·克伊, 馬庫斯·盧伊, 馬西亞斯·魯辛 申請人:努特諾瓦營養產品及食品成分有限公司