利用卡那黴素浸種法篩選轉基因油菜的方法

2023-09-19 22:32:20

專利名稱：：利用卡那黴素浸種法篩選轉基因油菜的方法
技術領域：
：本發明屬於轉基因植物篩選方法，具體地說涉及利用卡那黴素浸種法篩選轉基因油菜的方法。技術背景在植物基因工程中，選擇標記基因是幫助進行轉基因植物篩選和鑑定的一類外源基因。在適宜的選擇壓力下，不含標記基因的植株死亡，而含有選擇標記基因的轉化植株由於具有抗性，可以繼續存活，因而有利於從大量的非轉化植株中篩選出轉化植株。卡那黴素是目前植物基因工程中應用最廣泛的選擇標記基因之一(蓋樹鵬等.山東農業大學學報，2000，31(1):95100)。利用卡那黴素對轉基因植物進行篩選實質上是通過卡那黴素抗性基因起作用的。卡那黴素抗性(Kanr)基因即新黴素磷酸轉移酶基因，亦可稱為氨基糖苷磷酸轉移酶II基因(sp力-//)，它來自大腸桿菌(E.coli)的sp力A基因，編碼的產物氨基糖苷磷酸轉移酶(APH(3')II-酶)能對氨基糖苷類抗生素——卡那黴素具有抗性。此酶最早是從細菌轉座子7)^中分離得到的，它的作用原理是//基因產物通過酶促磷酸化使氨基糖苷類抗生素失效，從而解除毒性。因為卡那黴素能干擾一般植物細胞葉綠體及線粒體的蛋白質合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導致植物細胞的死亡。而轉基因植物由於含有卡那黴素//)抗性基因而抑制了卡那黴素的作用，所以通過卡那黴素，轉化體就很容易從非轉化體中篩選出來(王紫萱等.中國生物工程雜誌，2003，23(6).徐茂軍).生物學通報，2001，36(2):18-19.王關林等.植物基因工程.北京科學出版社，2002.527-528.)。目前對於帶有vWT-//標記基因的轉基因油菜的篩選方法，一般是將消毒後的種子接種於添加了一定濃度卡那黴素的MS培養基上培養篩選，長出的綠色苗視為抗性植株，子葉變黃或真葉白化的植株視為非抗性植株(林良斌等.湖南農業大學學報，2002，28(2).100-101)，將抗性植株移栽田間進行後續實驗。其優點是卡那黴素的濃度比較穩定，且因揮發損失少只需一次性加入即可，但這種方法存在以下問題(1)工作量大，操作複雜，需要將大量的種子在無菌條件下進行篩選，工作量非常大；卡那黴素屬抗生素一類，不能高溫滅菌，因此在配製培養基時必須將其過濾滅菌，操作複雜；(2)移栽存活率很低，卡那黴素抗性篩選後存活下來的苗子一般都比較弱，將其移栽田間存活率很低；(3)易出現假陽性，將種子置於培養基上發芽，苗子長到一定時候時其根部會上翹脫離培養基，因此會出現假陽性。如何高效、快速地鑑定出外源基因轉化的植株，是目前作物基因工程育種特別需要解決的問題。特別是在油菜中，目前應用真空滲透法(vacuuminfiltration)(BechtoldN等.Compt.Rend.Acad.Sci.Paris，1993，316:1194-1199.)、原位轉基因法(inplanta)(徐光碩等.作物學報，30(1):1-5)、花序浸泡法(floral-dip)(CloughandBent.ThePlantJournal,1998，16(6):735-743.付紹紅等.分子植物育種，2004，2(5):661-666.)禾口噴霧法(floral-spray)(Ming-HsanChung等.TransgenicResearch,2000，9:471-476.)等進行外源基因轉移，可直接獲得大量的轉基因種子，對大量種子的篩選，需要早期、快速、高效的篩選方法。
發明內容本發明的目的是提供利用卡那黴素溶液浸種法篩選轉基因油菜的方法。此方法簡單、快速、高效、可靠。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為利用卡那黴素溶液浸種法篩選轉基因油菜的方法，包括如下步驟(1)、按照O.180.30%的重量比將卡那黴素溶於水中，得卡那黴素溶液；(2)、將以卡那黴素抗性基因篩選標記經轉基因處理的油菜種子放入卡那黴素溶液中處理1224小時，並使溶液剛好浸沒種子；待種子露白時取出種子；(3)、將步驟(2)所得種子播於不含卡那黴素的土壤上，在23d進行觀察，淘汰子葉變黃或真葉是白色的植株，選擇正常生長的綠色苗，即為轉基因植株；其中所述的土壤在播種前需溼透。上述方法中所說的油菜是指甘藍型油菜和白菜型油菜。上述方法中所述的露白是指油菜種子吸水(這裡指卡那黴素溶液)後種子膨脹衝破種皮可看到芽。上述卡那黴素溶液的配製方法按照比例稱取卡那黴素固體，然後溶於水中即可。本發明中經卡那黴素浸泡後的種子，由於溶液直接接觸種子萌發孔，卡那黴素更容易進入植株體內抑制合成葉綠素各種酶的活性，光合作用不能正常進行，從而抑制蛋白質的合成，最終導致非轉化植株死亡。本發明具有如下優點(1)本發明方法準確性高，不易出現假陽性，準確性可達100%;(2)本發明方法篩選速度快，浸種後播種2-3d就可知結果；(3)本發明方法簡單，用卡那黴素溶液浸種，然後播於土壤上即可，適合大量轉基因種子的篩選；(4)本發明方法成本低。具體實施方式實施例1白菜型油菜轉基因種子的篩選，具體篩選過程如下(1)配製卡那黴素溶液將200mg卡那黴素固體溶於lL水中，得濃度為0.2%的卡那黴素溶液；(2)浸種將10000粒通過floral-dip法(譯為花序浸泡法)轉基因獲得的以卡那黴素為篩選標記的T,代種子(來自四川農業大學油菜研究中心)放入卡那黴素溶液中浸泡16小時，露白時取出；(3)篩選將種子播於不含卡那黴素的土壤上，播前先將土壤溼透，直接播於土壤表面，2-3d後觀察結果，選擇正常的綠色苗，得12株轉基因植株。實施例2甘藍型油菜轉基因植株的篩選，具體篩選過程如下(1)配製卡那黴素溶液，將280mg卡那黴素固體溶於1L水中，得濃度為0.28%的卡那黴素溶液；(2)浸種將20000粒通過floral-dip法(譯為花序浸泡法)獲得的以卡那黴素抗性基因為標記的轉基因的T,代種子(來自四川農業大學油菜研究中心)放入卡那黴素溶液中浸泡16小時，溶液剛好浸沒種子，露白時取出；(2)篩選播前先將土壤溼透，將種子播於不含卡那黴素的土壤上；2-3d後觀察結果，選擇正常的綠色苗，得20株轉基因植株。實施例3利用傳統的含卡那黴素培養基篩選甘藍型油菜轉基因植株按照如下方法進行(1)所篩選材料是甘藍型油菜轉基因種子(來自四川農業大學油菜研究中心)。(2)配製培養基按照通常方法配製含270mg/L卡那黴素的MS培養基，將1500粒通過floral-dip法(譯為花序浸泡法)獲得的以卡那黴素抗性基因為標記的轉基因的L代種子消毒後接種到培養基中進行篩選，一周後觀察結果。(3)篩選選擇正常的綠色苗，得18株轉基因植株。實施例4所篩選的轉基因植株的驗證試驗按照如下方法進行採用組織化學(GUS檢測)方法檢測(1)試驗材料實施例l、實施例2和實施例3所得的植株葉片。(2)GUS檢測將所篩選到的植株葉片置於X-gluc緩衝液(組成成分及其配比為含100mmol/LpH7的磷酸鈉緩衝液，EDTA10腿ol/L，亞鐵氰化鉀0.5mmol/L，高鐵氰化鉀0.5mmol/L，20%甲醇(V/V)和0.l%X_Gluc)中，抽真空10min，然後置於37X:保溫24h，再用70%乙醇脫色後鏡檢，植物細胞會被染成藍色，即出現了藍斑，即為轉基因植株。(3)結果實施例1所選的12株和實施例2所選的20株全部出現藍斑，即用本發明方法所選植株都是轉基因植株，而實施例3中僅有12株出現藍斑，6株未出現藍斑，本試驗說明了利用本發明浸種法篩選轉基因植株準確可靠。實施例5所篩選的轉基因植株的分子驗證試驗按照如下方法進行(1)試驗材料實施例1、實施例2和實施例3所選植株葉片。(2)PCR檢測a、DNA提取取植株的一個葉片，以不影響植株的正常生長，按照王關林(植物基因工程，2002)方法提取DNA;b、引物設計合成目的基因PCR擴增引物根據6TW基因C末端利用primer5.0軟體設計，由上海英駿生物技術有限公司合成，其引物為上遊引物5'-GAGTTCCCAAGGGACATT-3'，下遊引物3'-ACCATAACCTCCTCCTTC-5'。c、PCR擴增PCR反應體系(25^1)為2.5^1(10X)Buffer,(25mM)MgCl"2.0Pl(25mM)dNTP，1.014(0.02幽)的引物，2.0Ml(200ng)DNA模板，1UDNA聚合酶(TaKaRa公司產品)；反應條件為94。C變性lmin，53.5。C2min，72。C2min，共35次循環，完成最後一次循環後，72。C延伸8min，電泳檢測擴增出的目的DNA條帶約為413bp。d、克隆測序將PCR擴增獲得的DNA用試劑盒(TaKaRa公司產品)回收，進行克隆測序(克隆就是將回收得到的DNA轉化到大腸桿菌中，然後將大腸桿菌送到上海英駿生物技術有限公司測序)，在NCBI上進行序列比對，如果比對結果同源性達100%即說明我們獲得的綠色植株為轉基因植株。結果(見表l)實施例1和實施例2中用本發明浸種法所篩選的32株抗性植株的PCR檢測全部呈陽性，序列比對結果說明同源性達100%，但實施例3中所選的的18株中只有12株結果是陽性的，其餘6株是假陽性，主要的原因可能是將種子置於培養基上發芽，苗子長到一定時候時其根部會上翹脫離含卡那黴素的培養基，因此會出現假陽性。本試驗說明本發明種子浸泡法在篩選轉基因植株上的準確可靠。表l所篩選的轉基因植株的分子驗證試驗tableseeoriginaldocumentpage7權利要求1、利用卡那黴素溶液浸種法篩選轉基因油菜的方法，包括如下步驟(1)、按照0.18～0.30％的重量比將卡那黴素溶於水中，得卡那黴素溶液；(2)、將以卡那黴素抗性基因為篩選標記的經轉基因處理的油菜種子放入卡那黴素溶液中處理12～24小時，並使溶液剛好浸沒種子；待種子露白時取出種子；(3)、將步驟(2)所得種子播於不含卡那黴素的土壤上，在2～3d進行觀察，淘汰子葉變黃或真葉是白色的植株，選擇正常生長的綠色苗，即為轉基因植株；其中所述的土壤在播種前需溼透。2、按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的油菜是甘藍型油菜和白菜型油菜。全文摘要本發明公開了一種利用卡那黴素溶液浸種法篩選轉基因油菜的方法，主要是將經轉基因處理的油菜種子浸入0.18～0.30％卡那黴素溶液中處理12～24小時，然後播於不含卡那黴素的土壤上，2-3天後篩選正常生長的綠色苗，即為轉基因植株。本發明方法簡單、快速、高效、可靠，適於大量轉基因油菜種子的篩選。文檔編號G01N33/48GK101236197SQ200810101509公開日2008年8月6日申請日期2008年3月7日優先權日2008年3月7日發明者付紹紅,餘青青,牛應澤,郭世星,韋獻雅申請人:四川農業大學