用作神經營養劑的羥基化長鏈白藜蘆醇衍生物的製作方法

2023-09-19 22:46:25 1

專利名稱：用作神經營養劑的羥基化長鏈白藜蘆醇衍生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種神經營養、神經保護和/或抗炎化合物，尤其涉及 一種具有如下通式(I)的長鏈CO-鏈烷醇的白藜蘆醇衍生物
其中，Ri、 112和R3各自獨立地代表氫原子、d-C6烷基或(d-C6 垸基)羰基；R4、 R5、 R6和R7代表氫原子、CpC6烷氧基、d-C6垸基 或(CVC6烷基)羰氧基；且n為8至20，優選為10至16的整數。
背景技術：
中樞神經系統(CNS)由兩種細胞種群組成，可將這兩種細胞群體描 述為神經細胞(即神經元)和所有其他細胞類型(即神經膠質細胞)。 星形膠質細胞和少突神經膠質細胞代表了成人主要類型的神經膠質細 胞。這些細胞的產生貫穿整個胎兒發育過程，並且這些細胞在出生後 繼續在腦的某些區域生成直至成年期。
神經元，星形膠質細胞和少突神經膠質細胞源自於共同的前體， 具有理論上無限的增殖能力多能細胞，其位於神經管中。可將這些前 體看做神經幹細胞，因為它們滿足了定義幹細胞的標準自我更新、
幾乎無限的增殖能力以及產生構成產生幹細胞的組織的細胞類型的能 力。
作為超專業化細胞的神經元在載體和維持組織，神經膠質內發育。 中樞神經膠質是那些中樞神經系統的神經膠質細胞，周圍神經膠質是 那些周圍神經系統的神經膠質細胞。更具體而言，中樞神經膠質由星 形膠質細胞(星形神經膠質)、少突神經膠質細胞(少突神經膠質)和小神經膠質細胞(小神經膠質)組成。周圍神經膠質由Schwann細 胞(其與中樞神經膠質的少突神經膠質細胞相當)組成。
星形膠質細胞是血-腦屏障(BBB)的組分。它們幹涉大腦新陳代謝 的調節，且通過繞在毛細管四周的突出(偽足)作為毛細管與祌經元(營 養作用)之間的界面。它們參加神經遞質的重攝取，還通過生成膠質絲 (細胞骨架的組分)來幹涉癒合。
小神經膠質細胞是起源於髓細胞系的神經膠質細胞，其在胚胎期 間侵襲中樞神經系統。小神經膠質專門用於除去大分子，編程性細胞 死亡或壞死中吞噬細胞，識別並除去致病元素，以及調節免疫應答。
少突神經膠質細胞確保了中樞神經系統中軸突的髓鞘形成。少突 神經膠質細胞的起源存在多種先祖。這些細胞在高度受限的心室區沿 著神經管生成。對於成人，少突神經膠質細胞分散在整個大腦薄壁組 織中，並在白質神經束中佔主導地位。
通過少突神經膠質細胞合成的髓鞘是繞在軸突周圍的膜蛋白質絡 合物。它具有兩個功能它作為電絕緣體，更重要的是，它提高了神 經衝動繁殖的速度。對該鞘的攻擊將使得動作電位變慢抑或停止，由 此擾亂了神經中信息的傳遞並引起神經障礙。髓鞘質的損失或退化導 致出現所謂的脫髓鞘或者髓鞘形成障礙。
由於神經變性和脫髓鞘障礙，例如阿爾茨海默(Alzheimer)病和 多發性硬化症所引起的公共健康問題是無可否認的，更不用提及它們 的經濟利害。這些仍不可治癒的疾病，引起神經細胞減慢，並快速遞 增死亡；對於其中的大部分，還沒有有效的治療方法。
阿爾茨海默病的全世界患病率為一千二百萬，在發達國家倘若預 期壽命增加的話，則在50年內整個數字將增至3倍。
目前的治療方法只是針對症狀的，強烈需要高效的且能通過外周 路徑給藥的新型藥物。用於阿爾茨海默病的症狀性藥物主要是膽鹼酯 酶抑制齊U (Aricept , Exdon , Reminyl )。市場上的最新藥物為 Namenda ,其為N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體抑制劑。
而且，最普遍和最具破壞性的脫髓鞘疾病之一是多發性硬化症 (MS)，其是神經系統的進行性炎症疾病，特徵在於髓鞘、少突神經膠 質細胞和神經元的退化。多發性硬化症大概影響了全世界二百五十萬人，包括大量年輕的
成年人(年齡在20歲至40歲)。
對於多發性硬化症的治療可分成四種免疫調節藥物(Rebi產， Avonex , Betaseroi^和Copaxone )。目前的治療認為炎症組分相對較 好。但是，已證明它們對於脫髓鞘組分是無活性的，且是永久缺陷和 累積缺陷的原因。與以前所認為的相反，結果是即使在疾病的開始， 少突神經膠質細胞保持著製造新髓鞘質的能力(髓鞘再生)。另一方面， 在慢性階段，該髓鞘再生能力變得完全喪失。因而公知的是在多數患 者中，MS最初為"復發/忽重忽輕"形式，然後為"進行性的"形式。似乎 清楚的是少突神經膠質細胞及其前體能夠使第一階段的炎症現象得以 存活，但是相反地，在慢性階段其數目和效力大大降低。迄今為止認 為存在兩種治療的可能性少突神經膠質細胞前體的移植或通過化學
物質來自存活少突神經膠質細胞和內生少突神經膠質細胞前體(內生髓 鞘再生)的髓鞘形成的剌激。 -
關於移植，現有技術中已預見到，使用與成人少突神經膠質細胞 相比，被認為具有用於髓鞘質合成和遷移的較大潛力的少突神經膠質細 胞前體(相對未分化的年輕細胞)，能夠修復最大數量的脫髓鞘區。理想 的少突神經膠質細胞源是非常年輕的(胚胎)人類神經組織，其引發了倫 理和實際的問題。另外，它們的遷移性能是未知的。問題還在於，對 於大多數患者存在多重損害，並產生各自互相"移植"的錯覺。此外， 還不知道是否這些少突神經膠質細胞能夠自身遷移或者通過特定的化 學因素的幹擾是否是必要的，更不用提這些細胞的壽命也是未知的。
而且，在現有技術中已描述了多種神經營養因子(L. Shen, A. Figurov & B. Luu, Journal of Molecular Medicine, 1997, vol. 75, 637-644)，這些因子能控制神經元存活、生長和分化，因而是腦中的特 定生長因子。它們保護神經細胞免受各種攻擊的影響，特別是免受由 活性小神經膠質細胞所釋放物質的影響，這些活性小神經膠質細胞在 腦中引起炎症，且引起多種由於神經系統的過失操作引發的病症。
但是，這些神經保護大分子難以越過血-腦屏障。因此，需要能夠 通過系統途徑給藥的神經營養親脂分子用於治療中樞神經系統疾病，結果還需要合成能夠誘導神經幹細胞和其他細胞前體分化的營養分 子。
在本發明中，發明人對新型化合物，即所謂幹細胞的可能作用進
行了觀察(M. Brehm, T. Zeus & B.E. Strauer, Herz, 2002, vol. 27, 611—620)。
神經幹細胞引起三種主要類型的CNS細胞的機理仍然是難於理解 的。但是已知的是，該發育以連續階段進行，在該階段神經幹細胞的 發育潛力逐漸受到限制。由此，生成潛力越來越受到限制的中間前體， 並得到高度分化的細胞。最初，幹細胞源自胚胎。它們由此最初存在 於胎兒和嬰兒中。它們實際上能夠不受限制地繁殖。在這些神經營養 因子的作用下，它們被轉變得成熟及轉變成多種類型的功能細胞(M.Y. Chang, H. Son, Y.S. Lee & S.H. Lee, Molecular and Cellular Neuroscience 2003， vol. 23N 3， 414426)。最近，據顯示幹細胞也在多個發育階段存 在於器官中，特別是存在於成年人的大腦(Ph. Taupin & F.H. Gage, Journal of Neuroscience Research, 2002, vol. 69, 745-749)禾口脊髓中。因 此，在多種生長因子的作用下，神經幹細胞，即存在於大腦中的幹細 胞能被轉化為神經元、星形膠質細胞或者少突神經膠質細胞，即神經 細胞的基本類型。
但是，由於它們的分子尺寸和物理化學性質，這些天然的蛋白質 生長因子不能穿過多種生物屏障，特別是血-腦屏障。因此它們不能大 量滲入大腦以發揮其有益作用。而且，它們的生物利用率非常差，因 而限制了它們的效力和用途。
此外，當幹細胞用於治療退變性神經病時，採用外科手術將幹細 胞引入大腦中，這是危險的浸入步驟(C.N. Svendsen & M.A. Caldwell, Progress in Brain Research, 2000, vol. 127, 13-34)，少突神經膠質細胞前 體的情況也是如此。

發明內容
本發明提出了一種有利的與移植可供選擇的方法。實際上，本發 明人已經驚奇地並出乎意料地發現，如果將鏈垸醇連結枝到白藜蘆醇 核(core)上，可得到穿過血-腦屏障的分子且所述分子通過調節神經幹細胞的細胞特異性來促進內生髓鞘再生，即所述分子影響神經幹細 胞將自身定向於神經元或神經膠質路徑的選擇(調節神經元/神經膠質 細胞之比)。此外，這些化合物能夠模仿某些神經營養因子的行為。 這些模仿能夠將神經幹細胞轉化成分化的神經細胞，特別是優選在大 腦中原位誘發形成神經元。該優選的神經元形成特別有利於治療阿爾
茨海默病(Alzheimer'sdisease)。因此，根據本發明的化合物特別適用於 治療阿爾茨海默病。
更特別地，本發明的化合物促進了神經元的存活和軸突的生長。 本發明的化合物還能夠降低影響神經系統疾病的炎症組分。因此，它 們能夠特別地降低小神經膠質和/或星形膠質細胞的活性。
這些化合物還能夠降低活性神經膠質增生，即祌經膠質瘢痕形成， 更特別地，通過調節星形膠質細胞細胞骨架的某些化合物的表達來實 現。抑制小神經膠質細胞的活性，並將神經幹細胞轉化為成熟的少突 神經膠質細胞是治療神經退化或脫髓鞘/脫髓鞘型疾病(例如特別是多 發性硬化症，阿爾茨海默病，帕金森病(Parkinson's disease), Creutzfeldt-Jakob病)，以及血管性痴呆，肌萎縮性側索硬化，嬰兒型 脊髓性肌萎縮和與腦血管意外相關的神經病的基本特徵。
白藜蘆醇的抗氧化能力是由於存在羥基，更具體地，存在4'位的羥基。
羥基自由基是高度反應性的親電基團，因此它們易於與芳族化合 物發生取代反應。
優選通過在對位4'的OH基團的給電子效應將羥基自由基在3'活 性位加入到芳環上。
白藜蘆醇是存在於葡萄酒(wine)，茶和多種水果中的多酚。在過去 的十年間，己經觀察到人們對該化合物的興趣漸增。這部分地與在法 國南部進行的研究有關，該研究揭示，葡萄酒消費與心血管疾病逆相
白藜蘆醇的結構關，該現象被稱為French Paradox [l]。此外，已發現白藜蘆醇存在於 虎杖CPo/少gom/w cw/ /^^奶)植物的提取物中，該植物由於其抗炎症性 能長期用於傳統中藥中，並長期用於治療某些皮膚過敏症。
因此，本發明涉及被白藜盧醇核取代的長鏈烴基醇(稱作白藜盧醇 脂肪醇(RFA))，以及其類似物，特別是具有下式(I)的化合物，或者其 藥學上可接受的加成鹽、異構體、對映異構體或非對映異構體及其混 合物
其中，R4、 R2和R3各自獨立地代表氫原子、C廣C6烷基或(C廣C6烷基)
羰基；R4、 R5、 R6和R7代表氫原子、Q-Q垸氧基、(d-C6烷基)羰氧 基；n為8至20的整數，優選為10至16。
在本發明中，術語"藥學上可接受的酸"是指任何無毒酸，包括有 機和無機酸。這樣的酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、檸檬酸、乙磺酸 (ethanesulfonic)、富馬酸、葡糖酸、穀氨酸、氫溴酸、鹽酸、乳酸、馬 來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、半乳糖二酸、硝酸、雙羥萘酸、泛 酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和對甲苯磺酸。
在本發明中，術語"d-CV烷基"是指含1至6個碳原子的線性或 支化垸基，特別是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、 仲丁基、叔丁基、正戊基或者正己基。所述基團有利地為甲基。
在本發明中，術語"d-C6烷氧基"是指含1至6個碳原子的線性 或支化垸氧基，特別地為甲氧基。
在本發明中，術語"(CrCV烷基)羰基"是指^基團，其中R代 表如上所定義的C廣C6烷基。(d-C6烷基)羰基的例子包括但不限於乙 醯基、丙醯基、正丁醯基、仲丁醯基、叔丁醯基、異丙醯基等。特別 地，所述基團為乙醯基。
在本發明中，術語"(CVCV烷基)羰氧基"是指^ 基團，其中R 代表如上所定義的d《6烷基。特別地，所述基團為乙酸基團。根據本發明的一個具體實施方案，式(I)化合物對應於那些其中Ri,
R2和R3代表甲基(Me)或氫原子的化合物。
根據本發明的另一具體實施方案，具有通式CQ的化合物對應於那
些其中R,，R2和R3代表甲基，並且R4,R5,R6和R7為氫原子或者甲氧
基(OMe)的化合物。有利地，R5,R6和R7代表氫原子。
式(I)化合物的側鏈對應於co-鏈垸醇，其中n為10至18。
其中n為等於10, 12， 14, 16或者18的整數的式(I)化合物是在本發
明中特別有效的化合物。
包含10或12個碳原子側鏈的化合物是特別有利的。 還特別有利的化合物是
具有下式的RFA-12:
具有下式的MRFA-12:
OMe
MeO
具有下式的DMRFA-12:
OMe
MeO
OMe
具有下式的MRFA-10:
14formula see original document page 15
以及具有下式的DMRFA-10:
formula see original document page 15
根據本發明，該化合物有利地是RFA-12。
因此，本發明的一個目的涉及藥物組合物，其包含至少一種被白 藜蘆醇核取代的長鏈烴基醇活性物質，特別地，涉及與藥學上可接受 的賦形劑結合的本發明的通式(I)化合物，。
無論選擇哪一種給藥途徑，以有利於保護和最佳同化活性成分的 形式提供本發明有利的組合物。
本發明的化合物或組合物能以多種方式和多種形式給藥。因此， 所述化合物或組合物可以通過口服、吸入、或者注射，例如通過靜脈、 肌內、皮下、經皮膚或者動脈內的途徑等得以全身給藥，其中有利的 是靜脈、肌內、皮下、口服和吸入途徑。
對於注射，通常以液體懸浮形式包裝化合物，其可通過例如注射 器或灌注法注入。在此方面，通常將化合物溶解在與藥學用途相容的， 且對於本領域技術人員公知的含鹽的、生理的、等滲的或緩衝溶液等
中。因此，組合物可以包含一種或多種選自如下的試劑或載體分散
劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑等。特別地，在液體和/或可注射製劑中 適用的試劑或載體為甲基纖維素、羥基甲基纖維素、羧基甲基纖維素、
聚山梨酯80、甘露醇、明膠、乳糖、植物油、阿拉伯膠等。
化合物有可能通過植物製劑形式或者通過確保延長釋放和/或緩慢 釋放的裝置、以凝膠、油、片劑、栓劑、粉末、明膠膠囊、膠囊、氣溶膠等形式得以給藥。對於製劑的這種類型，諸如纖維素、碳酸鹽或 澱粉的試劑被有利地使用。
本發明的化合物在10—SM至1(T9M，優選在10^M至10—8M，更優 選在lO^M的濃度下，能夠特別地調節小神經膠質細胞和星形膠質細 胞的活性。這些化合物，在相同的有利濃度下，能夠誘發神經幹細胞 分化為神經元，以及在這些條件下神經元的存活。
本發明人已證明了本發明的化合物在上文所示濃度下的活性，應 該理解的是流速和/或注入劑量可以由本領域技術人員根據患者，相關 病症，給藥途徑等加以調節。而且，如果需要的話，可以重複注射。 此外，對於慢性治療，緩慢或延長體系是有利的。
本發明還涉及本發明的藥物化合物和組合物作為藥物的用途。
本發明的化合物和組合物可用作如下藥物，該藥物具有神經營養 和/或祌經保護和/或抗炎作用，和/或用於預防或治療改變少突神經膠質 細胞或神經系統其他細胞的神經系統疾病或障礙，和/或神經系統炎症 的疾病或障礙，和/或退化神經病，和/或脫髓鞘或髓鞘形成障礙和/或腦 血管意外或神經系統的任何其他損害發作(lesional attack)。
特別地，本發明的化合物或藥物組合物預防或治療多發性硬化症， 阿爾茨海默病，帕金森(Parkinson)病和Creutzfeldt-Jakob病。其他有 可能治療的疾病是血管性痴呆、肌萎縮性側索硬化和嬰兒型脊髓性肌 萎縮。類似地，有可能利用本發明的化合物和組合物治療由腦血管意 外引起的損傷以及所有其他對神經系統的損傷發作。
在本發明中，術語"治療"包括預防和根治療法，其可以單獨使用或 者與其他試劑或治療組合使用。而且，所述治療可用於慢性或急性障
礙o
本發明的另一目的涉及本發明的化合物用作以下藥物的用途該 藥物用以調節神經幹細胞的細胞規格，以有利於分化及分化的神經元 和神經膠質細胞的存活，以有利於少突神經膠質細胞前體細胞分化成 成熟的少突神經膠質細胞，和/或降低小神經膠質的活化和/或星形膠質 細胞和/或反應性神經膠質增生的活化。
本發明因此涉及體外使用至少一種本發明的化合物從而獲得由幹 細胞分化的神經元和/或神經膠質細胞。本發明的化合物可由商用產品通過組合本領域技術人員公知的化 學反應製得，並可由製備具有如下所定義的通式(I)化合物的方法指導。
具有通式(I)的化合物，其中Rp R2和R3表示氫原子，能夠特別地 通過包括如下步驟(a)的製備方法獲得-78°CT，將通式(I)化合物，其 中Rb R2和R3代表C,-C6垸基，與二氯甲垸中的三溴化硼中反應[3]。 也可使用其他溶劑和其他溫度。
通式(I)化合物，其中R,, R2和R3代表d-C6烷基，可以特別地通 過包含如下步驟(b)的製備方法獲得使具有如下通式(II)化合物
R7, T 、R4
OR， (II)
其中R,表示C廣C6烷基，R4， R5, Re和R7如上文所定義，與如下通式(III) 化合物[4]:
Q (III)
其中112和R3代表d-C6烷基，TBDMS代表叔丁基二甲基甲矽烷基，n
如上文所定義，有利地在二甲基甲醯胺中的甲醇鈉存在下於回流中發
生Wads worth—Emmons偶聯反應。
由於在2M HC1的存在下TBDMS能被原位分開，因此TBDMS被
特別地期望用作保護基團。
但是，也有可能使用另一保護基團保護OH基團。
特別地，通式(III)化合物能夠通過包含如下步驟(c), (d)和(e)的製備
方法獲得
-(e)如下通式(IV)化合物有利地與碳載5%鈀發生催化氫化[5]:
OTBDMS
(IV)其中R2和R3代表Q-C6烷基，n如上文所定義，從而獲得如下通式(V) 化合物
其中R2和R3代表d-C6烷基，n如上文所定義；
-(d)有利地利用氫化鋁鋰將具有通式(V)的酯還原為如下通式(VI)
的醇
其中R2和R3代表d-C6垸基，n如上文所定義；
-(c)有利地利用四正丙基銨過鐐酸鹽和N-甲基嗎啉將通式(VI)的
醇氧化為'通式(III)的醛。
特別地，具有通式(IV)的化合物可以通過包含如下步驟(f)的製備
方法獲得有利地利用PdCl2(PPh3)2，使如下通式(VII)化合物
其中R2和R3代表d-C6烷基，與如下通式(VIII)化合物[6]:
其中n如上文所定義，在含Cul的三乙基胺的存在下於回流中發生 Sonogashira偶聯反應。
有利地，在本發明的方法中，R,，R2和R3代表甲基，R4,R5,R6和
R7代表氫原子或者甲氧基。
因此，RFA合成反應主要存在於兩個關鍵步驟中。第一個步驟是 芳族碘化物與多種以真炔(true alkyne)形式的鏈長(n40, 12, 14， 16, 18) 之間的Sonogashim偶聯反應。第二個步驟是醛與膦酸酯之間的
18Wadsworth-Emmons反應，所述膦酸酯由對應的苄基醇的溴化而獲得 的苄基溴原位形成(

圖1)。
OTBDMS
OMe
OMe
MeO.
R4
OMe OMe 圖1:逆合成
側鏈的合成
為了合成Sonogashira偶聯所需的多種鏈長，本發明人按照如下的 反應路徑(圖2》
0 0
HO一 OH
is
uAiH4
THF, 0°C~-90 - 97%
—^h。^;oh
rt n-2
lb
HB「 48 % /C^7, 75 - 85%
Br""
TBDMSCI
咪唑.CH2CI2, rt 85 - 95%
B「"^OTBDMS
-U, H2NCH2CH2NH2 , DMSO
0°C.
rt .80-90%
丌BDMS
圖2:多種側鏈的合成 在利用氫化鋁鋰還原二酸k或者內酯1k後，獲得對應的二醇^ 對於其他鏈長，使用商用二醇。
在氫溴酸與環己垸的非均勻混合物中 進行單溴化反應，從而獲得具有較好產率的溴代醇2。
本發明人選擇叔丁基二甲基甲矽烷基作為醇官能的保護基團，這
是由於其易於採用TBAF進行脫保護。最後，通過將含乙炔鋰的DMSO 作用於對應的矽烷基化溴代醇i上而獲得乙炔衍生物5。芳族碘化物的合成
在兩個步驟中獲得的甲基4-碘-3,5-二甲氧基苯甲酸酯2，具有87%
的相當可接受的產率。首先，本發明人用7V-碘代丁二醯亞胺(NIS)的甲
醇溶液處理了 3,5-二羥基苯甲酸，從而形成碘衍生物^。然後，本發明
人甲基化羥基官能以形成Sonogashim偶聯所需的化合物2。
O、、力H 0、yOH 0、\ ，e
NIS, MeOH 丄 Me2S。4, K2C。3
0°C— rt ，3h
92% HO
丙酮，A， 5h 95%
MeO
OMe
5 Z 圖3:芳族碘化物的合成
Sonogashim偶聯
利用該反應將多種co-羥基鏈i接枝到芳環l上(圖4)。 已知碘化衍生物通常具有較高的反應性，因此本發明人決定在苄 酯2_上與碘進行Sonogashim反應(圖3)，儘管苄酯不能市購得到。 因此，根據如下的反應途徑進行偶聯反應
MeO、 /'0
MeO"O
^ PdCI2(PPh3)2, Cul
MeO'
7
■OMe
^^、'、OTBDMS
MeO'
Et3N, A, 24h, 69 - 75%
■OMe
隊
n-50TBDMS
8
圖4: Sonogashira反應 接枝co-鏈垸醇鏈後，進行Wadsworth-Emmons偶聯所需的醛合成 步驟以在兩個芳環間形成反式C-C雙鍵(圖5)。
MeO
H2, Pd/C 10%
EtOH. rt ,20h
90%.
Me〇
OMe
r^OTBDMS
LiAlH4.THF _
0。c — rt . 16h. 98% Me0
化.89%
10
11
圖5: Wadsworth-Emmons偶聯必需的醛11的合成米用碳載5%鈀，通過催化氫化獲得具有飽和鏈i的化合物。為了
形成用於Wadsworth-Emmons反應的醛11，本發明人採用氫化鋁鋰將
酯2_還原為醇m。然後，本發明人採用四正丙基銨過鐐酸鹽
(perruthenate) (TPAP) [(n-Pr4N)Ru04pQ N-甲基嗎啉將醇氧化為醇氧
化為醛ii。
Wadsworth-Emmons偶聯
最初目標是合成反式白藜蘆醇衍生物，本發明人選擇變型的Wittig 反應，該反應排他地形成具有反式構型的雙碳-碳鍵，即 Wadsworth—Emmons偶聯(圖6)。formula see original document page 21
圖6:合成白藜蘆醇/co-鏈烷醇雜化物Wadsworth-Emmons偶聯 通常地，該反應基於醛與膦酸酯之間的偶聯反應。採用三溴化磷 (PBr3)對苄基醇1^_進行溴化以形成對應的苄基溴11，節基溴11_在亞磷 酸三乙酯(POEt3)的存在下於回流中形成所需的膦酸酯14。由此，本發 明人在含甲醇鈉的二甲基甲醯胺存在下，於回流中將膦酸酯和在先形 成的醛反應。在該反應過程中通過去除亞磷酸三乙酯氧化物(triethyl phosphite oxide)，形成了中間體甜菜鹼，並由其形成所需的偶聯產物 11。本發明人由此形成多種的甲氧基化RFA(也將對其進行測試)。
最後通過在-78。C下在二氯甲垸中通過三溴化硼的作用而獲得RFA 巡圖7)。
具體實施例方式
以下實施例用於舉例說明本發明，而不應該認為是對本發明的限制。
實施例
實施例1: 12-溴十二烷-1-醇(3)的製備
將含48。/。HBr的水(77毫升；0.46摩爾；15當量)加入含1,12-十二垸 醇(6.15克；30.4毫摩爾；1當量)的環己垸(140毫升)溶液中。在回流條 件下加熱非均勻混合物。6小時後，用醚(3xl00毫升)萃取水相。合併 有機相，用Na2C03的飽和溶液洗滌，用MgS04乾燥，過濾和蒸發。 採用矽膠色譜法提純粗反應產物(洗脫液己烷-AcOEt: 6-4)以得到 7.06克白色固體。
產率85%
經驗式C12H25BrO
分子量265.23
薄層色譜(己烷-AcOEt:6"4)Rf二0.4
按照與如上所述相同的步驟合成其中n=8, 10, 14和16的化合物。 & NMR (300 MHz, CDC13) 5: 1.26 (s寬，16H, H—3至H—10); 1.56
(m， 2H, H-2); 1.85 (q， 2H, J=7.0 Hz, H—11); 3.40 (t， 2H, J=6.8 Hz， H—12);
3.63 (t, 2H, J=6.4Hz,H—1)。
13C NMR (75 MHz, CDC13) S: 25.5 (C-3); 28.2 (C-11); 28.7 (C-9);
29.4 (C~4至C—8); 32.8 (C—2); 33.8 (C—12); 63. (C-l)。
1
22其他鏈長的'HNMR禾B "CNMR譜與之相同，即每次在1.26ppm 處具有士4H和在29.4 ppm處具有士2C。
實施例2: (12-十二垸氧基溴)(叔丁基)二甲基矽垸(4)的製備
在室溫下將叔丁基二甲基氯矽烷(5.61克；37.3毫摩爾；1.5當量)和 咪唑(2.54克；37.3毫摩爾；1.5當量)加入含12-溴十二烷-1-醇(6.6克; 24.9毫摩爾；1當量)的二氯甲烷(60毫升)的溶液中。4小時後，將反應 混合物注入飽和NH4Cl溶液中(IOO毫升)，然後用醚(3x100毫升)進行 萃取。用飽和NaCl溶液洗滌有機相，用MgS04乾燥，過濾，然後蒸 發。採用矽膠色譜法提純粗反應產物(洗脫液己垸-AcOEt: 95-5)以得 到9.17克無色油。
產率99%
經驗式C18H39BrOSi
分子量379.49
薄層色譜(己烷—CH2C12:8-2)Rf=0.5
按照與如上所述相同的步驟合成其中n=8, 10, 14和16的化合物。 'H麗R (300 MHz, CDC13) 5: 0.04 (s， 6H, CH3Si); 0.89 (s， 9H， CH3C); 1.27 (s寬，16H, H-3至H-10); 1.39至1.53 (m， 2H, H—2); 1.85 (q, 2H， J=6.9 Hz, H—11); 3.40 (t， 2H, J=6.9 Hz, H—12); 3.59 (t， 2H, J=6.6 Hz, H-l)。
13C NMR (75 MHz, CDC13) 5: -5.2 (CH3Si); 18.4 (CSi); 26.0 (CH3C); 28.2—29.6 (C—2至C-10); 32.9 (C—11); 34.0 (C—12); 63.4 (C—1)。
其他鏈長的^NMR和"CNMR譜與之相同，即每次在1.27 ppm 處具有士4H和在28.2至29.6 ppm處具有士2C。
實施例3:叔丁基(十四-13-炔基氧基)二甲基矽垸(5)的製備 將含(12-溴十二烷氧基)(叔丁基)二甲基矽垸(9.2克；24.2毫摩爾;
1當量)的DMSO (5毫升)溶液滴加到冷卻至0。C的含乙炔鋰(335克;
36.4毫摩爾；1.5當量)的DMSO(15毫升)溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌16小時。將反應混合物注入飽和KC1溶液(IOO毫升)中，然後 用己烷(3xl00毫升)進行萃取。洗滌有機相，用MgS04乾燥，過濾並 蒸發。採用矽膠色譜法提純粗反應產物(洗脫液己烷-CH2Cl2: 8-2)以得 到6.38克無色油。
產率81%
經驗式C20H40OSi
分子量324.62
薄層色譜(庚烷-CH2C12: 8-2) Rf=0.4
按照與如上所述相同的步驟合成其中n=10， 12， 16和18的化合物。 'H函R (300 MHz, CDC13) 5: 0.04 (s, 6H， CH3Si); 0.90 (s， 9H，
CH3C); 1.27 (s寬，16H， H—3至H—10); 1.38至1.59 (m， 4H, H—2禾Q H—11);
1.93 (t, 1H, J=2.6 Hz, H—14); 2.18 (td， 2H， J二2.5 Hz和J=6.9Hz, H—12);
3.59 (t， 2H, J=6.6Hz，H—l)。
13C麗R (75 MHz, CDC13)5: _5.2 (CH3Si); 18.4 (CSi和C-12);
26.0 (CH3C); 25.8—29.9 (C—3至C-11); 32.9 (C-2); 63.4 (C一l); 68.0
(C—14); 84.8 (C-13)。
其他鏈長的'HNMR禾B "CNMR譜與之相同，即每次在1.27 ppm 處具有另外的士4H和在25.8至29.9 ppm處具有士2C。
實施例4: 3，5-二羥基~4-碘苯甲酸(6)的製備
將含N-碘代丁二醯亞胺(5克；22.2毫摩爾；1.05當量)的甲醇(15毫 升)溶液滴加到冷卻至0'C的含3,5-二羥基苯甲酸(3.26克；21.2毫摩爾; 1當量)的甲醇(13毫升)溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。 將混合物注入冷水(13毫升)中，然後將其注入含5。/。Na2S03的水溶液 中(20毫升)。用醚(3 x 100毫升)萃取水相。用NaCl洗滌有機相，用MgS04 乾燥，過濾，並蒸發，從而得到5.37克白色固體。
產率90% 經驗式C7H5I04
分子量280.02
24薄層色譜(AcOEt) Rf=0.1
& NMR (300 MHz, CDC13) S: 2.67 (s, 1H, H酸)；4.91 (s， 2H, OH); 6.98 (s, 2H, H-3和H-5)。
3C雨R (75 MHz, CDC13) 5: 80.3 (C-1); 106.2 (C-3和C-5); 131.8 (C~4); 158.0 (C—2和C-6); 168.1 (C-7)。
2 OH
實施例5: 4-碘-3，5-二甲氧基苯甲酸甲酯(7)的製備
將碳酸鉀(12克；85.8毫摩爾；5.6當量)和硫酸二甲酯(12.6克; 99.6毫摩爾；6.5當量)加入到含3,5-二羥基~4-碘苯甲酸(4.3克；15.3毫 摩爾；l當量)的丙酮(48毫升)溶液中。將反應混合物加熱回流4小時。 加入甲醇(26毫升)，並維持回流另外的一小時。將反應混合物注入飽 和NH4C1溶液(100毫升)中，然後用醚(3xl00毫升)進行萃取。用MgS04 乾燥有機相，過濾，然後蒸發。採用矽膠色譜法提純粗反應產物(洗脫 液庚烷-AcOEt:64)以得到4.66克白色固體。
產率95%
經驗式C1QH I04
分子量322.10
薄層色譜(庚烷-AcOEt: 7-3) RfH).4
^ NMR (300 MHz, CDC13) 5: 3.93 (s， 3H, H-8); 3.94 (s, 6H, H_9和 H—10); 7.16 (s, 2H， H—2和H-6)。
13C NMR (75 MHz, CDC13) S: 52.4 (OMe); 56.8 (OMe); 84.3 (C-l); 104.7 (C—3和C-5); 131.8 (C4); 159.5 (C-2和C—6); 166.6 (C—7)。
formula see original document page 25
實施例6: 4-(14-(叔丁基二甲基矽氧基)十四-1-炔基卜3,5-二甲氧
基苯甲酸甲酯(8)的製備將鈀配合物PdCl2(PPh3)2 (200毫克；0.28毫摩爾；0.07當量)和碘化 銅(55毫克；0.28毫摩爾；0.07當量)各自加入到含4-碘-3,5-二甲氧基苯 甲酸甲酯(1.3克；4.04毫摩爾；1當量)的三乙胺(ll毫升)溶液中。將反 應混合物在室溫下攪拌10分鐘，然後加入叔丁基(十二烷-13-炔基氧基) 二甲基矽烷(1.97克；6.05毫摩爾；1.5當量)。在回流下加熱48小時後， 將混合物注入飽和NH4C1溶液(100毫升)中，然後用乙酸乙酯(3xl00 毫升)進行萃取。用飽和NaCl溶液洗滌有機相，用MgS04乾燥，過濾， 然後蒸發。用二氧化矽(200微米)吸附粗反應產物，然後採用矽膠色譜 法進行提純(洗脫液庚垸-AcOEt: 9-l)以得到1.31克黃色油。
產率63%
經驗式C3。H5Q05Si
分子量518.80
薄層色譜(洗脫液庚烷-AcOEt: 8-2) Rf=0.4
按照與如上所述相同的步驟合成其中n=10, 12， 16和18的化合物。 畫R (300 MHz, CDC13) S: 0.04 (s, 6H, CH3Si); 0.89 (s， 9H, CH3C); 1.27 (s寬，16H, H—5'至H—13'); 1.47至1.68 (m, 2H, H—4'); 2.55 (t, 2H, J=7.0Hz， H—3'); 3.59 (t， 2H, J=6.6 Hz， H-14'); 3.92 (s, 9H， OMe); 7.21 (s, 2H,H-2和H-6)。
13C NMR (75 MHz, CDC13) S: -5.3 (CH3Si); 18.4 (CSi); 20.3 (C-3'); 26.0 (CH3C); 28.8至29.5 (04'至C-12'); 32.9 (C—13'); 52.3 (OMe); 56.3 (OMe); 63.3 (C—14'); 72.2 (C一l'); 102.5 (C-2'); 104.6 (C-2和C—6); 107.0 (C~4); 129.9 (C—1); 161.0 (C—3和C—5); 166.7 (C—7)。
其他鏈長的^NMR和BCNMR譜與之相同，即每次在1.27 ppm 處具有另外的士4H和在28.8至29.5 ppm處具有士2C。實施例7: 4-(14-(叔丁基二甲基矽氧基)十四垸基)~3，5-二甲氧基苯 甲酸甲酯(9)的製備
將碳載10%鈀(256毫克；0.24毫摩爾；0.01當量)加入到含4(14(叔 丁基二甲基矽氧烷)十四-1-炔基)~3,5-二甲氧基苯甲酸甲酯(1.28克; 2.47毫摩爾；1當量)的乙醇(5毫升)溶液中。使反應混合物在室溫下於 氫氣氣氛下攪拌。24小時後，將混合物在硅藻土上過濾。採用矽膠色 譜法提純粗反應產物(洗脫液庚垸-AcOEt: 7-3)以得到1.23克黃色油。
產率95%
經驗式C3QH5405Si
分子量522.83
薄層色譜(洗脫液庚烷-AcOEt: 7-3) Rf=0.6
按照與如上所述相同的歩驟合成其中n=10, 12， 16和18的化合物。
!H麗R (300 MHz, CDC13) 5: 0.05 (s, 6H, CH3Si); 0.89 (s， 9H, CH3C); 1.25 (s寬，20H， H-3'至H—12'); 1.43至1.53 (m, 4H， H—2'和 H-13'); 2.65 (t， 2H, J=7.2 Hz, H—1'); 3.59 (t, 2H, J=6.6 Hz, H-14'); 3.85 (s, 6H, OMe); 3.91 (s, 3H, OMe); 7.22 (s， 2H, H-2和H-6)。
13C NMR (75 MHz, CDC13) 5: -5.2 (CH3Si); 18.4 (CSi); 23.2 (C-l'); 25.9 (CH3C); 28.9至29.8 (C—2'至C-12'); 32.9 (C—13'); 52.1 (OMe); 55.8 (OMe); 63.4 (C-14'); 104.9 (C-2禾口 C-6); 125.4 (C~4); 128.4 (C-l); 158.0 (C—3和C—5); 167.7 (C—7)。
其他鏈長的^NMR和"CNMR譜與之相同，即每次在125 ppm 處具有另外士4H和在28.9至29.8 ppm處具有士2C。
實施例8: (4-(14-(叔丁基二甲基矽氧基)十四烷基H3,5-二甲氧基 苯基)甲醇(10)的製備
將少量氫化鋁鋰(87毫克；2.3毫摩爾；1當量)加入到冷卻至0°C的 含4(14(叔丁基二甲基矽氧基)十四垸基)-3，5-二甲氧基苯甲酸甲酯(1.2克；2.3毫摩爾；1當量)的THF(9毫升)溶液中。將反應混合物在室 溫下攪拌。2.5小時後，將反應混合物注入含10%酒石酸鈉的水溶液(100 毫升)中，然後用醚(3xl00毫升)進行萃取。洗滌有機相，用MgS04幹 燥，過濾並蒸發。採用矽膠色譜法提純粗反應產物(洗脫液庚垸 -AcOEt: 7-3)以得到1.05克無色油。
產率92°/。
經驗式C29H5404Si
分子量494.82
薄層色譜(洗脫液庚烷-AcOEt: 7-3) Rf=0.3
按照與如上所述相同的步驟合成其中n=10， 12, 16和18的化合物。
&畫R (300固z, CDC13) 5: 0.05 (s, 6H, CH3Si); 0.89 (s, 9H, CH3C); 1.26 (s寬，20H, H—3'至H—12'); 1.29至1.52 (m, 4H, H—2'和 H—13'); 2.60 (t， 2H， J=7.2 Hz, H—3.59 (t, 2H, J=6.6 Hz， H—14'); 3.81 (s, 6H， OMe); 4.65 (s, 2H, H—7); 5.30 (s, OH); 6.55 (s， 2H, H—2禾卩H—6)。
l3C N證(75 MHz, CDC13) 5: -5.2 (CH3Si); 18.4 (CSi); 22.8 (C-l'); 26.0 (CH3C); 25.8至29.8 (C—2'至C一12'); 32.9 (C一13'); 55,7 (OMe); 63.4 (C—14'); 65.9 (C-7); 102.4 (C—2和C—6); 119.0 (C~4); 139.5 (C-l); 158.4 (C—3和C一5)。
其他鏈長的'HNMR禾n 。CNMR譜與之相同，即每次在U6ppm 處具有另外的士4H和在25.8至29.8 ppm處具有士2C。
實施例9: 4-(14-(叔丁基二甲基矽氧基)十四烷基—3，5-二甲氧基
苯甲醛(ii:)的製備
在4A分子篩(500毫克/毫摩爾)存在下，將iV-甲基嗎啉(422毫克; 3.12毫摩爾；1.5當量)加入到含(4(14(叔丁基二甲基矽氧基)十四烷 基)-3,5-二甲氧基苯基)甲醇(1.03克；2.08毫摩爾；1當量)的二氯甲烷(5毫升)中。將少量四正丙基銨過鐐酸鹽(37毫克；0.10毫摩爾；0.05當 量)加入到冷卻至0"C的混合物中。使反應混合物在室溫下攪拌兩小時， 然後在硅藻土上過濾。採用矽膠色譜法提純粗反應產物(洗脫液庚烷 -AcOEt: 7-3)以得到855毫克無色油。
產率'85%
經驗式C29H5204Si
分子量492.81
薄層色譜(洗脫液庚烷-AcOEt: 6-4) Rf=0.6
按照與如上所述相同的步驟合成其中n=10, 12, 16和18的化合物。
&畫R (300 MHz, CDC13) 5: 0.05 (s， 6H, CH3Si); 0.89 (s， 9H, CH3C); 1.25 (s寬，20H, H-3'至H—12'); 1,29至1,52 (m， 4H， H-2'和 H—13'); 2.67 (t, 2H， J=7.2 Hz, H—3.59 (t, 2H， J=6.6 Hz, H-14'); 3.88 (s, 6H， OMe); 7.05 (s, 2H， H—2和H-6); 9.90 (s, 1H, H-7)。
13C NMR (75 MHz, CDC13) 5: -5.2 (CH3Si); 18.4 (CSi); 23.5 (C-26.0 (CH3C); 25.8至31.6 (C—2'至C-12'); 32.9 (C—13'); 55.8 (OMe); 63.3 (C—14'); 104.9 (C—2和C—6); 127.5 (C~4); 135.1 (C-l); 158.6 (C—3和 C—5); 191.9 (C—7)。
其他鏈長的'HNMR和"CNMR譜與之相同，即每次在1.25 ppm 處具有另外的士4H和在25.8至31.6 ppm處具有士2C。
實施例10: 4-甲氧基苄基溴(13)的製備
將三溴化磷(6.2克；25.0毫摩爾；1.15當量)加入到冷卻至(TC的含 4-甲氧基苄醇(3克；21.7毫摩爾；1當量)的二氯甲垸(35毫升)溶液中。 在室溫下5小時後，將反應混合物諸如冰水(100毫升)中，然後用醚 (3x100毫升)進行萃取。洗滌有機相，用MgS04乾燥，過濾，並蒸發， 從而得到4.1克無色油。
產率94%經驗式C8H9BrO 分子量201.06
薄層色譜(洗脫液庚垸-AcOEt: 7-3) Rf=0.6 &畫R (300MHz， CDC13) 5: 3.81 (s， 3H, OMe); 4.51 (s, 2H, CH2Ph); 6.87 (d, 2H, J=8.8 Hz， H—3禾B H—5); 7.32 (d， 2H, J=8.8 Hz, H-2
和H—6)。
13C固R (75 MHz, CDC13) S: 34.0 (CH2Ph); 55.3 (OMe); 114.2 (C-3 和C-5); 130.0 (C-l); 130.5 (C—2和C-6); 159.7 (C~4)。
實施例11: (E)-14-(4-(4-甲氧基苯乙烯基—2，6-二甲氧基苯基) 十四烷-l-醇(I')的製備
將亞磷酸三乙酯(565毫克；3.44毫摩爾；2當量)和4-甲氧基苄基溴 (478毫克；2.38毫摩爾；1.4當量)加熱至130。C。 6小時後，將反應混合 物返回室溫，接著分別加入5.4M的甲醇鈉(540微升；2.92毫摩爾；1.7 當量)溶液，二甲基甲醯胺(2毫升)和4-(14-(叔丁基二甲基矽氧基)十 四烷基卜3,5-二甲氧基苯甲醛(845毫克；1.72毫摩爾；1當量)的二甲基 甲醯胺(2毫升)溶液。使反應混合物在室溫下攪拌1小時，然後再在 100。C下另外加熱1小時。最後將反應混合物在室溫下過夜攪拌。向反 應混合物中加入2M的HC1溶液(6 ml)。 3小時後，將反應混合物注入 KC1飽和溶液(100毫升)中，然後用醚(3xl00毫升)進行萃取。洗滌有機 相，用MgS04乾燥，過濾並蒸發。採用矽膠色譜法提純粗反應產物(洗 脫液庚垸-AcOEt: 7-3)以得到568毫克白色固體。
產率69% 經驗式C31H4604
分子量482.69
薄層色譜(洗脫液庚烷-AcOEt: 7-3) Rf=0.2 按照與如上所述相同的步驟合成其中n=10, 12, 16和18的化合物。
30NMR (300 MHz, CDC13) S: 1.26 (s寬，20H, H-3"至H—12"); 1.30 至1.59 (m, 4H, H—2"禾卩H—13"); 2.61 (m, 2H, H—1"); 3.64 (t， 2H, J=6.6 Hz, H—14"); 3.83 (s, 3H， OMe); 3.86 (s, 6H， OMe); 6.67 (s, 2H， H—2 和H-6); 6.90 (d, 2H， J=8.8 Hz, H-3鄰H-5'); 6.98 (d, 1H, J=16.1 Hz, H-8); 7.02 (d, 1H, J=16.1Hz, H-7); 7.45 (d， 2H, J-8.8 Hz, H-2鄰H-6')。
13C NMR (75 MHz, CDC13) 5: 23.0 (C—1"); 25.7至29.8 (C-2"至 C—ir); 32.8 (C-13"); 55.3 (OMe); 55.7 (OMe); 63.1 (C—14"); 101.9 (C-2 禾口C-6); 114.1 (C—3'和C—5'); 119.4 (C~4); 127.2 (C—8); 127.4 (C-7); 127.6 (C—2'和C—6'); 130.0 (C-l'); 136 (C—1); 158.4 (C—3和C-5); 159.2 (d)。
formula see original document page 31
其他鏈長的'HNMR和UCNMR譜與之相同，即每次在l.26ppm 處具有另外的士4H和在29.3至29.8 ppm處具有士2C。
實施例l2: (E卜5-(4-羥基苯乙烯基)~2-(14-羥基十四烷基)苯 -1,3-二醇(I)的製備
在-78。C下，將三溴化硼(230微升；2.42毫摩爾；15當量)加入到含 向-14-(4-(4-甲氧基苯乙烯基卜2,6-二甲氧基苯基)十四烷-1-醇(78毫 克；0.16毫摩爾；1當量)的二氯甲烷(5毫升)溶液中。將反應混合物在 室溫下攪拌。2小時後，在-78匸下加入水(15毫升)，然後向混合物中 再次加入水(50毫升)。用AcOEt(3x50毫升)萃取水相。合併有機相， 用飽和NaCl溶液洗滌，用MgS04乾燥，過濾和蒸發。採用矽膠色譜 法提純粗反應產物(洗脫液庚烷-AcOEt: 45-55)以得到53毫克白色固 體。
產率75% 經驗式C28H40O4
分子量440.61
薄層色譜(洗脫液庚烷-AcOEt: 4-6) RfN).3按照與如上所述相同的步驟合成其中n=10, 12, 16和18的化合物。 &畫R (300 MHz， CDC13) 5: 1.28 (s寬，20H, H—3"至H—12"); 1.40
至1.52 (m, 4H， H-2"和H-13"); 2.57 (m, 2H, H-l"); 3.53 (t, 2H, J=6.6 Hz,
H—14"); 6.45 (s, 2H， H—2禾Q H—6); 6.74 (d, 1H， J=15.9 Hz， H—8); 6.75 (d,
2H, J=8.6Hz, H-3'和H-5'); 6.89 (d, 1H， J=15.9Hz, H-7); 7.32 (d, 2H,
J=8.6Hz,H-2,禾口 H-6')。
13C NMR (75 MHz, CDC13) 5: 22.9 (C—25.7至29.8 (C—2"至
C-12"); 29.7 (C-13"); 64.3 (C—14"); 104.6 (C—2和C—6); 115.4 (C~4);
115.9 (C_3，和C—5'); 126.3 (C—8); 127.1 (C-7); 128.1(C—2'和C-6'); 128.6
(C一r); 135.7 (C—1); 156.7 (C—3和C一5); 156.8 (C~4')。
OH
其他鏈長的^NMR和^CNMR譜與之相同，每次在1.28 ppm處 具有另外的士4H和在25.7至29.8 ppm處具有土2C。
實施例13:物理化學研究
採用DPPH [(2,2'-二(4-叔辛基苯基)l-苦肼基(picrylhydrazyl)]測 試以確定本發明化合物的抗氧化能力[9]。 DPPH是在517nm處吸收的 穩定自由基(紫色)。當有抗氧化分子存在時，抗氧化分子將與自由 基反應。由此可觀察到吸收的降低。因此，抗氧化能力使得在517nm 處的吸收降低。
a)DPPH測試的完成 ；
在96孔ELISA板上加入
100微升如下濃度的多種溶液:IO mM， 5 mM, 2.5 mM， 1 mM, 0.5 mM, 0.1 mM, 0.01 mM禾卩0.001 mM;
100微升的400pM含DPPH的乙醇溶液。 培養45分鐘、2小時和3小時後，使用分光光度計在550nm處測
定光密度，由此獲得結果。
32將結果表示為ICso濃度，在該濃度下50%的自由基被抗氧化分子還原。
本發明人測試了白藜戸醇(作為陽性對照)以及RFA-10, RFA-12和 RFA—16。
白藜蘆醇的IC5。為10pM。本發明的雜化(hybrid)分子在培養3 小時後，其IC5Q大約為2.5 pM。應注意的是抗氧化能力不依賴於 -羥基化物鏈的長度。但是，本發明的雜化分子，其K^大約為2.5pM， 保持良好的抗氧化能力。
還對甲氧基化衍生物進行了測試。這些化合物具有抗氧化能力， 但是未達到所測的IC5Q濃度。
b)ABTS測試的原理
根據DPPH測試所獲得的結果，考慮使用ABTS ([2,2'-連氮基-雙 -(3-乙基苯並噻唑啉-64黃酸)])測試[10-12]。 ABTS測試在使用較少受 阻羥基自由基的情況下是更敏感的。此外，其更好地表明了化合物的 抗氧化活性，假定大腦中普遍的自由基是羥基自由基。
ABTS分子通過Fenton反應與介質中生成的羥基(OH)自由基反應， 從而形成在405nm處吸收的陽離子自由基，即ABTS+(綠色)。因此， 當有抗氧化分子存在時， 一旦還原了羥基自由基，則能在405nm處觀 察到吸收的降低。
在96孔ELISA板上加入
180微升的50/50水/乙醇混合物；
30微升1 mM的ABTS水溶液；
30微升1 mM的FeS04水溶液；
30微升待測的產物，其濃度如下:IO mM， 5 mM， 2.5 mM, 1 mM， 0.5 mM， 0.1 mM, 0.01 mM禾口 0.001 mM;
30微升100 mM的H202水溶液。
在培養45分鐘、1小時和2小時後，使用分光光度計測定405nm 處的光密度，由此獲得結果。
由於鏈長不能確定抗氧化能力，因此決定只用一個鏈長進行該測 試。為了最大地減少溶解性問題，對RFA-10進行測試。再一次使用 白藜戸醇作為陽性對照。IQo值是培養2小時後獲得的那些值。白藜蘆醇的ICs。為30nM， RFA—10的IC5o為45 jiM。
儘管白藜蘆醇具有略微高些的抗氧化能力，但本發明化合物表現 出顯著的抗氧化潛力。
實施例14:生物學研究
通過RFA和MRFA抑制小神經膠質的活性(白藜蘆醇脂肪醇和甲 氧基化白藜蘆醇脂肪醇)。通過神經幹細胞製備神經元。
在大腦中，免疫系統由單核細胞-巨噬細胞、小神經膠質細胞的群 體表示。因此，所用的各種測試將評價本發明化合物調節小神經膠質 活化及其抗炎活性的能力。
當用如下刺激物(脂多糖類、幹擾素Y等)活化小神經膠質時，合 成了一定數量的細胞因子(例如TNF-a或者誘導酶)，NOS-II和
cox—n。
因此，氧化氮(NO)的水平和腫瘤壞死因子-a (TNF-a)指示了小神經 膠質活化。
因此，所進行的實驗與RFA分子(MRFA和DMRFA)在活化小神
經膠質中抑制亞硝酸鹽和TNF-a釋放的能力有關。
MeO'
MeO'
OMe
DMRFA
RFA MRFA
a)亞硝酸鹽釋放的測定
NO-合酶II型(NOS II)的活性代表在文獻中經常分析的小神經膠 質活性參數。該酶負責在炎症活性條件下氧化氮自由基的合成。安靜 的小神經膠質只表示在免疫印跡檢測限制下的水平。活化24至48小 時導致該表達的強烈增加。該酶的產物，NO，在培養中快速分解以形 成亞硝酸鹽。比色測定(Griess法)顯示N02—水平的趨勢與之相同。
在進行實驗時，在產物RFA-12, MRFA-IO， MRFA-12， MRFA-14, MRFA—16,MRFA—18,DMRFA—10,DMRFA—12,DMRFA—14，DMRFA-16， DMRFA-18, M-白藜盧醇，DM-白藜盧醇和白藜戸醇的存 在下(濃度為5xl0^M, 10^M和10— M)，測定用0.01微克/毫升的LPS 處理過的小神經膠質細胞培養物在活化24小時和48小時後其中N02— 的濃度。
由三個獨立實驗所獲得的甲氧基化和二甲氧基化衍生物的結果表 明，與對照值相比，MRFA-10, DMRFA-10和白藜蘆醇使得細胞中亞 硝酸鹽產物降低了20%。
在RFA系列中，濃度為5xl(T^M的RFA-12使得細胞的亞硝酸鹽 水平降低了 50%。
這些結果表明鏈長以及羥基存在的重要性。實際上，對於RFA-12 觀察到了最好的活性，該活性高於白藜蘆醇本身的活性。
b)TNF-a釋放的測定
TNF-a的表達代表了在文獻中經常分析的小神經膠質的活化參 數。安靜的小神經膠質不表達該細胞因子。由LPS活化24小時導致可 由ELISA檢測出的表達強烈增加。
在進行實驗時，在MRFA-10, MRFA-12, MRFA-14, MRFA-16, MRFA—18, DMRFA—10, DMRFA—12， DMRFA—14, DMRFA—16, DMRFA-18, M-白藜蘆醇，DM-白藜盧醇和白藜盧醇的存在下(濃度為 5x10—6 M, 1C^M和10—7M)，測定用0.01微克/毫升LPS處理過的小神 經膠質細胞培養物在活化24小時後其中TNF-a的濃度。
對於MRFA系列獲得的結果表明，與對照值相比，MRFA-10, MRFA-12禾n MRFA-14(濃度為5xl0一6 M)導致細胞中TNF-a產物降低 了20至40%。由於這些產物的活性隨濃度而降低，因此這些產物的活 性是濃度依賴性的。白藜蘆醇、M-白藜盧醇的甲氧基化同系物導致 TNF-a水平只降低了 20%。
對於二甲氧基化衍生物系列(DMRFA)，在5xlO^M， DMRFA-IO 和DMRFA-12導致與對照值相比降低了 40%的TNF-a。對於DM-白 藜蘆醇，在相同濃度下觀察到降低了50%。
最後，與對照值相比，濃度在5xlO^M， RFA-12使得TNF-a降 低了 40%。白藜蘆醇使得在相同條件下只降低了 30%。
35這些對於TNF^a產物的初步結果表明，通常地，根據本發明的雜 化(hybrid)化合物(RFA， MRFA和DMRFA)表現比其白藜蘆醇同系物 更好的活性。由此顯示了 co-羥基化鏈，及其長度存在的重要性。實際 上，含10或12個碳原子側鏈的化合物被證明具有最好的活性。
RFA-12及其類似物對神經幹細胞增殖和分化的影響
大多數中樞神經系統(CNS)障礙是由於多種細胞種類(例如神經元 或者神經膠質細胞)的退化或者對其攻擊所引起的。對於動物模型的研 究表明有可能通過移植神經幹細胞或者通過活化在中樞神經系統中存 在的幹細胞來修復該損傷。這些神經幹細胞能夠生成神經元，少突神 經膠質細胞和星形膠質細胞。
有趣的治療方法是培養小分子，例如RFA以控制或誘導神經幹細 胞內生分化為多種神經細胞。
實驗方法
在含20ng/ml EGF的已知成分培養液中培養的小鼠胚胎端腦細胞 中獲得神經幹細胞球(neurosphere)。在分離後，在所謂增殖階段中在 EGF (20 ng/ml)的存在下，使該神經幹細胞球增殖3天。
然後收集神經幹細胞球，並在2ng/mlEGF存在下，在已知成分培 養液中的多-鳥氨酸載體上沉積神經幹細胞球。在這些條件下，神經幹 細胞球附著在載體上並分化。在神經幹細胞球沉積後，立即加入預先 溶解在乙醇中的待測化合物，RFA-12及其類似物，其濃度範圍為10-SM 至10_9M。用陰性對照(乙醇)和陽性對照(視黃酸)處理對照培養 物。
M-白藜戸醇
DM-白藜戶醇
36在生長3天後(分化階段)，細胞得以固定，並利用免疫細胞化學揭 示各種細胞的類型。為篩選我們的化合物，我們進行了雙標記，即標 記了神經元和星形膠質細胞。
所用主要抗體為
抗-MAPhb(微管相關蛋白質)抗體，用於標記年輕神經元(有
絲分裂的)；
TUJi(抗p(m)微管蛋白)抗體，用於標記神經元(有絲分裂期
後的)；
抗-GFAP(神經膠質原纖維酸性蛋白質)抗體，用於標記星形膠 質細胞。
由偶聯於菁螢光染料，Cy-3 (紅)的第二抗體揭示了抗-MAP2ab和 TUJ1抗體。為了檢測星形膠質細胞，使用偶聯於衍生自羅丹明 (rhodamine) ， Alexa488 (綠)的第二抗體。
為了能夠定量結果，採用插入試劑TO~PRO (藍色)標記細胞核。 然後在共焦顯微鏡下觀察培養物。
結果
1、 RFA-12誘發神經幹細胞分化為祌經元。在10—SM至10—"M濃 度下，測試RFA-12對於將神經幹細胞分化為神經元的影響。在10—5濃 度下，應注意的是由於在該濃度下的毒性，RFA-12不能誘發分化。與 之並列的是，在10—SM下的RFA-12隻表現出較弱的活性。但是，如 果用10、 M至10—8 M濃度的RFA-12處理神經幹細胞球，則與對照樣 (未處理的細胞)相比，觀察到神經元數目增加。在10^M, 10—7 M和 10^M的濃度下，我們觀察到，與固定在100%的對照樣相比，神經元 種群分別增加了 120%, 90%和80%。這些結果表明，RFA-12對於將 神經幹細胞分化為神經元的影響是依賴劑量的，在濃度為10^M時影 響最大。
2、 為了觀察RFA及其類似物是否也對神經幹細胞的增殖起作用， 解離這些細胞，然後在RFA(10^M和10—SM)存在下培養5天，其後 記錄活細胞的數目以及細胞尺寸和形態。結果表明，濃度為10^ M的 RFA-12抑制了神經幹細胞的增殖。
結論濃度為10—6M的RFA-12能夠誘導神經幹細胞分化成神經元，並抑 制這些細胞的增殖。
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權利要求
1、一種具有如下通式(I)的化合物，或者藥學上可接受的加成鹽、異構體、對映異構體或其非對映異構體及其混合物其中R1、R2和R3各自獨立地代表氫原子、C1-C6烷基或(C1-C6烷基)羰基，R4、R5、R6和R7代表氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或(C1-C6烷基)羰氧基，n為8至20的整數。
2、 根據權利要求1所述的化合物，其特徵在於Ri、 112和R3代表甲基或者氫原子。
3、 根據權利要求1或2所述的化合物，其特徵在於R4、 R5、 &或R7代表氫原子或甲氧基。
4、 根據權利要求1至3中任一項所述的化合物，其特徵在於Rs、R6和R7代表氫原子。
5、 根據權利要求1至4中任一項所述的化合物，其特徵在於n 為等於IO、 12、 14、 16或18的整數。
6、 根據權利要求1至4中任一項所述的化合物，其特徵在於n 為等於10或12的整數。
7、 根據權利要求1至6中任一項所述的化合物，其特徵在於所述化合物選自-具有下式的RFA-12:具有下式的MRFA-12:OMeMeO具有下式的DMRFA-12:OMeMeOOMe具有下式的MRFA-10:OMeMeO以及具有下式的DMRFA-10:formula see original document page 4
8、 根據權利要求7所述的化合物，其特徵在於所述化合物是 RFA-12。
9、 一種藥物組合物，其特徵在於包含至少一種與藥學上可接受 的賦形劑結合的權利要求1至8中任一項所述的化合物。
10、 根據權利要求1至8中任一項所述的化合物或根據權利要求 9所述的藥物組合物用作藥物的用途。
11、 根據權利要求1至8中任一項所述的化合物或者根據權利要 求9所述的藥物組合物用作如下藥物的用途，該藥物具有神經營養和/ 或神經保護和/或抗炎作用，和/或用於預防或治療改變神經元或神經系 統其他細胞的神經系統疾病或障礙，和/或神經系統炎症的疾病或障礙， 和/或退化神經病，和/或脫髓鞘或髓鞘形成障礙和/或腦血管意外或神經 系統的任何其他損害發作。
12、 根據權利要求11所述的化合物或組合物，其特徵在於所述 退化神經病是多發性硬化症、阿爾茨海默病、帕金森病或者 Creutzfeldt國Jakob病。
13、 根據權利要求1至8中任一項所述的化合物或者根據權利要 求9所述的藥物組合物用作如下藥物的用途，該藥物用以調節神經幹 細胞的細胞規格，以有利於分化及分化的神經元和神經膠質細胞的存 活，以有利於少突神經膠質細胞前體細胞分化成成熟的少突神經膠質細胞，和/或降低小神經膠質的活化和/或星形膠質細胞和/或反應性神經 膠質增生的活化。
14、 體外使用至少一種根據權利要求1至8中任一項所述的化合物以獲得從幹細胞中分化的神經元和/或神經膠質細胞的用途。
15、 根據權利要求1至8中任一項所述的通式(I)化合物的製備方 法，其中R" R2和R3代表氫原子，其特徵在於所述方法包括如下的步 驟(a):將通式(I)的化合物，其中R" R2和R3代表d-Q垸基，與二氯 甲烷中的三溴化硼在-78。C下發生反應。
16、 根據權利要求1至8中任一項所述的通式(I)化合物的製備方法，其中R4、 R2和R3代表d-C6垸基，其特徵在於所述方法包括步驟(b):將如下通式(II)化合物R, 丫 、R4OR (n)其中E4代表d-C6垸基，R4如權利要求1至8中所定義，與如下通式(in)化合物其中R2和R3代表C,-C6烷基，n如權利要求1至8中所定義，有利地 在二甲基甲醯胺中的甲醇鈉存在下於回流中發生Wadsworth-Emmons偶聯反應。
17、根據權利要求16所述的方法，其特徵在於通式(III)化合物通 過如下步驟(c)、 (d)和(e)獲得-(e)如下通式(IV)化合物有利地與碳載5%鈀發生催化氫化其中R2和R3代表d-C6烷基，n如權利要求16中所定義，從而獲得如下通式(V)化合物其中R2和113代表d-C6烷基，n如權利要求16中所定義，-(d)有利地利用氫化鋁鋰將具有通式(V)的酯還原為如下通式(VI)的醇v v OR3 (VI)其中112和113代表d-C6垸基，n如權利要求16中所定義，- (c)有利地利用四正丙基銨過鐐酸鹽和N-甲基嗎啉將具有通式(vi)的醇氧化為具有通式(ni)的醛。
18、根據權利要求17所述的方法，其特徵在於通式(IV)化合物通過如下步驟①的製備方法獲得有利地利用PdCl2(PPh3)2，使如下通式(vn)化合物其中112和R3代表d-C6烷基，與如下通式(VIII)化合物:其中n如權利要求17中所定義，在含Cul的三乙基胺的存在下於回流 中發生Sonogashira偶聯反應。
19、根據權利要求16至18中任一項所述的方法，其特徵在於&、R2和R3代表甲基，且R4代表氫原子。
全文摘要
本發明涉及一種如通式(I)化合物，或者其藥學上可接受的加成鹽、異構體、對映異構體和非對映異構體及其混合物，其中R1、R2和R3各自獨立地代表氫原子或C1-C6烷基或(C1-C6烷基)羰基，R4、R5、R6和R7代表氫原子或C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或(C1-C6烷基)羰氧基，且n為8至20的整數。本發明還涉及包含該化合物的藥物組合物以及其作為神經營養劑的用途。
文檔編號A61K31/09GK101426753SQ200780012691
公開日2009年5月6日 申請日期2007年3月2日 優先權日2006年3月3日
發明者A·米凱盧奇, B·盧, D·庫沃, E·莫加爾, F·奧斯, J·劉, L·格朗巴布, P·霍伊施林 申請人:國家科學研究中心;盧森堡大學