採用芥菜型油菜基因ban和dfr共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法
2023-09-19 22:44:05
專利名稱：採用芥菜型油菜基因ban和dfr共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因工程和微生物發酵技術領域的方法，特別是一種採用雙關鍵酶基因共轉化和在培養基中添加關鍵酶基因催化反應如體物的粗提物提聞大腸桿菌合成原花色素的方法。
背景技術：
原花色素(Proathocyanidins),也叫原花青素,是類黃酮的一種。原花色素是清除自由基最強的抗氧化劑之一，能保護大腦與神經組織，改善血液循環，靈活關節和年輕皮膚的作用。長期食用高含原花色素的食品，可以緩解心血管等疾病。科學家還發現原花色素及其衍生物還具有抗炎、抗逆境、抗腫瘤以及免疫調節的功能，可見原花色素素是一種極具 潛力的天然藥物，消費需求越來越大。目前原花色素的主要來源是從植物組織部分提取，但植物生長需要較長的時間，原花色素的含量不高且提取工藝比較複雜，產率低，使得原花色素的大規模商業化生產受到了限制。由於原花色素人工合成難度較大，產量低，成本高，可行性不強。我們在前期的研究中發現芥菜型油菜基因DFR (dihydrofIavonoI 4-reductase,
4-二氫黃酮醇還原酶)和BAN (anthocyanidin reductase,花色素還原酶)的表達量與油菜種皮原花色素的含量呈正相關。經對現有技術文獻檢索發現YanY J等(2008)在《生物工程與生物技術》(Biotechnol. Bioeng. 2008; 100: 126 - 140)上報導了利用在大腸桿菌中表達擬南芥、非洲菊(Gerbera),矮牽牛(Petunia)、金魚草(Antirrhinum)中的花色素(Anthocyanin)合成途徑中的基因可以提高大腸桿菌花色素的合成量，花色素和原花色素都屬於類黃酮類物質，但未見有採用油菜原花色素合成基因來提高大腸桿菌原花色素的合成量的報導。花色素還原酶BAN是原花色素合成途徑中的一個關鍵酶，花色素還原酶的活性越高，越有利於合成原花色素，採用基因工程手段，用基因BAN及其前體物質合成的關鍵酶DFR共轉化大腸桿菌，將打破原花色素生物合成限速的瓶頸，從而獲得原花色素高產的菌株，為規模化生產原花色素素提供一條新途徑。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種採用基因BAN和DFR共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法。本發明涉及的關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、原花色素提取及含量測定。本發明建立了提高大腸桿菌中產原花色素的方法，為利用轉基因大腸桿菌大規模生產原花色素奠定堅實的基礎。本發明是通過以下技術方案實現的一種採用芥菜型油菜基因BAN和DFR共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法，其特徵在於，包括以下步驟
(I)從芥菜型油菜種皮的cDNA中克隆花色素還原酶BAN基因和4-二氫黃酮醇還原酶DFR基因；(2)把BAN基因和DFR基因可操作性地連接於表達調控序列，形成含BAN基因和DFR基因的原核表達載體pET-BAN-DFR ；
(3)將BAN和DFR基因同時導入DH5α大腸桿菌，轉化菌在LB液體培養基中，25-37°C，150-250rpm(轉/分鐘)培養6_14小時後，再在含黑色大豆種皮提取物的LB液體培養基中，25-37°C，150-250rpm震蕩培36-54小時後，在室溫下，離心力為10000-12000g離心收集菌體；
(4)採用DMACA-HC1法測定大腸桿菌所含的原花色素的量，篩選獲得原花色素含量提高基因大腸桿菌菌株。步驟(3)中，所述的LB液體培養基中含有O. 5-1. Og/L黑色大豆種皮提取物。所述的黑色大豆種皮提取物的提取方法將黑色大豆種皮用粉碎機粉碎，過1.0 mm的篩，將用30%-70%的乙醇(v/v)作為萃取溶劑，大豆種皮量與溶劑用量之比為I : 4-8(w/w)，萃取溫度為60°C-70°C，萃取時間為4-8小時；回收乙醇後的濃縮液 在8000-10000g的離心機中離心10-15min，過濾去雜，然後在濃縮液中加入丙酮，濃縮液與丙酮之比為I : l-3(v/v)，攪拌混勻2-5min，過濾除去雜質，濃縮液經回收丙酮後，在400C -60°C下真空乾燥即得大豆種皮提取物。本發明的BAN和DFR共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法，是採用基因工程方法，將關鍵酶基因BAN和DFR導入大腸桿菌中，獲得了原花色素含量顯著提高的轉基因大腸桿菌株，共轉BAN和DFR基因大腸桿菌中原花色素的含量最高可達到12. 8mg/gFW(鮮重)，是同種培養基下非轉化普通大腸桿菌的(0.4-0. 9mg/g FW)的8. 8-19. 8倍，該發明對於為原花色素規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於本實施例。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等的《分子克隆實驗室手冊》(New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),鄭偉娟等的《現代分子生物學實驗》(北京高等教育出版社，2010)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。(一)油菜BAN和DFR基因的克隆
I.芥菜型油菜(Brassica juncea )種皮總RNA的提取
取少量芥菜型油菜紫葉芥授粉後15-25天的種皮，具體操作按嚴明理等(嚴明理，劉忠松，官春雲，陳社員，劉顯軍.一種提取高質量油菜種子和種皮RNA的方法.生物技術通報· 2007，6:97-100)的方法進行總RNA的提取。2.芥菜型油菜BAN和DFR基因的克隆
將所獲的油菜種皮總RNA通過反轉錄酶(AMV)反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據所述芥菜型油菜DFR基因的編碼序列(序列表中的序列I)和BAN基因的編碼序列(序列表中的序列2)，分別設計擴增出完整編碼序列的上下遊引物，並在上遊和下遊引物上分別引入限制性內切酶位點(根據選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增後，產物連接到PMD18-T克隆載體後進行測序。DNA序列測定由生物公司採用3730測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與預測的DFR (序列表中的序列I)和BAN基因(序列表中的序列2)的編碼序列一致。採用基因克隆方法從芥菜型油菜中獲得序列正確的原花色素生物合成關鍵酶基因BAN和DFR，為通過雙關鍵酶基因共轉化策略提高大腸桿菌中原花色素含量提供了兩個重要關鍵酶基因。(二)含BAN和DFR基因的植物雙元表達載體的構建
選用pMD18-BAN、pMD18_DFR和pET為基本元件，構建載體pET-BAN-DFR，具體的操作參考文獻(Yan YJ, Li Z, Koffas MA. High-Yield Anthocyanin Biosynthesis inEngineered Escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2008, 100: 126 - 140)中報導的方 法進行.
將原花色素生物合成途徑關鍵酶基因BAN和DFR可操作性地連接於表達調控序列，形成含BAN和DFR基因的原核表達載體，該表達載體可用於通過代謝工程策略來提高大腸桿菌中原花色素的含量。(三)黑色大豆種皮提取物的提取
把已選擇的黑色大豆種皮稱重，用粉碎機粉碎，過1.0 mm的篩，將用50%的乙醇(v/V)作為萃取溶劑，大豆種皮量與溶劑用量之比為I : 5(w/w)，萃取溫度為65°C時，萃取時間為8小時。回收乙醇後的濃縮液在離心力為IOOOOg離心沉降15min，過濾去雜，然後在濃縮液中加入丙酮，濃縮液與丙酮之比為I : 2(v/v)，攪拌混勻5min，過濾除去雜質，濃縮液經回收丙酮後，在60°C下，真空乾燥即得大豆種皮提取物。(四)載體pET-BAN-DFR遺傳轉化獲得高產原花色素的轉基因大腸桿菌株 I.轉基因大腸桿菌株的獲得
把含BAN和DFR基因原核表達載體通過熱激轉化法轉化到DH5 α大腸桿菌，通過抗性選擇並進行PCR驗證。結果表明，含BAN和DFR基因表達載體己成功轉化到DH5 α大腸桿菌。2.大腸桿菌的培養
選取含載體pET-BAN-DFR的DH5 α單菌落，以未轉化的DH5 α為對照，在I. OML的液體培養基中，37°C，200rpm (轉/分鐘)培養6小時候後，再轉入到含黑色大豆種皮提取物(I. 0g/L)的LB液體培養基中，37°C，200rpm培養48小時。3.採用DMACA-HC1法測定大腸桿菌中原花色素含量
將培養好的菌液在室溫、IOOOOg下離心10分鐘，收集大腸桿菌菌體。菌體中原花色素的提取和含量測定按文獻(Li YG, Tanner GJ, Larkin PJ, The DMACA-HC1 Protocoland the Threshold Proanthocyanidin Content for Bloat Safety in Forage Legumes,Journal of Science of Food and Agriculture，1996，70:89-101)的方法進行，試驗設置3次重複。共轉BAN和DFR基因大腸桿菌中原花色素的含量達到7. 9mg/g FW，是非轉化普通大腸桿菌的(0.4mg/g Fff)的19. 8倍。本發明的共轉BAN和DFR基因顯著提高了大腸桿菌中原花色素含量。本實施例是採用BAN和DFR基因的代謝工程策略獲得了原花色素高產的大腸桿菌，為規模化生產原花色素提供了一種較理想的方法。
權利要求
1.一種採用芥菜型油菜基因BAN和DFR共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)從芥菜型油菜種皮的cDNA中克隆花色素還原酶BAN基因和4-二氫黃酮醇還原酶DFR基因； (2)把BAN基因和DFR基因可操作性地連接於表達調控序列，形成含BAN基因和DFR基因的原核表達載體pET-BAN-DFR ； (3)將BAN和DFR基因同時導入DH5α大腸桿菌，轉化菌在LB液體培養基中，25-37°C，150-250rpm(轉/分鐘)培養6_14小時後，再在含黑色大豆種皮提取物的LB液體培養基中，25-370C，150-250rpm震蕩培36-54小時後，在室溫下，離心力為10000-12000g離心收集菌體； (4)採用DMACA-HC1法測定大腸桿菌所含的原花色素的量，篩選獲得原花色素含量提高基因大腸桿菌菌株。
2.根據權利要求I所述的採用芥菜型油菜基因BAN和DFR共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法，其特徵是，步驟(3)中，所述的LB液體培養基中含有O. 5-1. Og/L黑色大豆種皮提取物。
3.根據權利要求I或2所述的採用芥菜型油菜基因BAN和DFR共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法，其特徵是，所述的黑色大豆種皮提取物的提取方法將黑色大豆種皮用粉碎機粉碎，過I. O mm的篩，將用30%-70%的乙醇(v/v)作為萃取溶劑，大豆種皮量與溶劑用量之比為I : 4-8(w/w)，萃取溫度為60°C _70°C，萃取時間為4_8小時；回收乙醇後的濃縮液在8000-10000g的離心機中離心10-15min，過濾去雜，然後在濃縮液中加入丙酮，濃縮液與丙酮之比為I : l-3(v/v)，攪拌混勻2-5min，過濾除去雜質，濃縮液經回收丙酮後，在40°C -60°C下真空乾燥即得大豆種皮提取物。
全文摘要
本發明公開了一種採用芥菜型油菜基因BAN和DFR共轉化提高大腸桿菌中原花色素含量的方法。本發明從芥菜型油菜紫葉芥種皮的cDNA中克隆花色素還原酶BAN基因和4-二氫黃酮醇還原酶DFR基因，構建含BAN和DFR基因的原核表達載體pET-BAN-DFR，將BAN和DFR基因同時導入DH5α大腸桿菌。轉化菌株在LB液體培養基中，25-37℃，150-250rpm(轉/分鐘)培養6-14小時候後，再在含黑色大豆種皮提取物(0.5-1.0g/L)的LB液體培養基中，25-37℃，150-250rpm震蕩培養36-54小時後，離心收集菌體，採用DMACA-HCl法測定大腸桿菌所含的原花色素的量。本發明獲得的轉基因大腸桿菌中原花色素的含量顯著提高，最高達到非轉化對照菌株的19.8倍。
文檔編號C12N1/21GK102827849SQ20121029530
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者嚴明理, 劉麗莉, 向建華, 屠波, 王帥斌 申請人:湖南科技大學