油菜BnPAB5基因及其應用的製作方法

2023-09-19 22:43:15

專利名稱：油菜BnPAB5基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程和生物技術領域。具體涉及一種控制油菜和擬南芥花粉育性的PAB5基因，同時還涉及一種控制植物花粉育性的PAB5基因的製備方法，還涉及一種控制植物花粉育性的PAB5基因的用途。本發明還涉及含有該基因或其同源核苷酸序列的載體和涉及利用該基因在油菜基因工程中的應用。
背景技術：
大多數真核生物成熟mRNA分子都有一段poly (A)尾巴，它與mRNA的穩定性及翻譯的起始調節有關。Poly (A)結合蛋白(poly(A)binding protein, PAB)廣泛存在於真核生物不同類型的細胞中，與25bp或更長的poly (A)有很強的親和力(Sachs AB，Davis R W and Kornberg R. D. A single domain of yeast poly(A)-binding proteinis necessary and suffi·cient for RNA binding and cell viability. Mol CellBiol.，1987，7(9) :3268-3276. )。PAB蛋白可以和最短包括12個腺嘌呤的聚合體結合，形成一個複合體，該複合體最多可以覆蓋27個腺_呤片段(Baer W，Kornberg D. Repeatingstructure of cytoplasmic poly (A)-ribonucleoprotein.Proc Natl Acad Sci USA1980, 77:1890-1892. )，PAB 蛋白主要是通過三級結構中的 RRM (RNA recognition motif)來識別 Poly (A)序列(Burd G, Dreyfuss G. Conserved structures and diversity offunctions of RNA-binding proteins.Sciencel994,265:615-621.)。目前對細胞核PAB蛋白的研究比細胞質PAB蛋白研究要落後，主要是因為它們的晶體和NMR (nuclear magnetic resonance)結構還沒有確定。儘管如此，目前已有研究確定在其N末端有一個RRM結構域，在C末端有一個富含精氨酸的結構域(Wahle E，Ruegse gger U: 3-end processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMSMicrobiol Revl999，23:277-295.)。酵母的存活必須有細胞核PAB的存在，它由基因 NAP2 編碼(David A Mangus, Ma tthew C Evans,Allan Jacobson. Poly (A)-bindingproteins!multifunctional scaffolds for the posttranscriptional control of geneexpression Genome Biol.2003;4 (7):223.)。PAB蛋白在基因表達過程中起著重要的作用。作為順式作用因子結合在新合成或者成熟的mRNA上，在轉錄本的多腺嘌呤化、運輸、翻譯的起始等過程起著特殊的作用。它通過與poly (A)尾巴的結合至少在以下三個方面調節mRNA的轉錄後加工mRNA的生物合成，mRNA降解和蛋白質合成的起始(Dmitry A. Belostotsky. UnexpectedComplexity of Poly (A)-Binding Protein Gene Families in Flowering Plants:ThreeConserved Lineages Th at Are at Least200Million Years Old and Possible Auto—andCross-RegulationGenetics. 163 (I) :311 - 319) 0 對 Poly (A)結合蛋白的研究表明它們都存在四個串聯的RNA識別結構域(RNA recognition motif，RRM)。儘管這四個RRM存在差異，但其二維結構相似，都包含能夠識別並結合Poly (A)的01-a1-0 2_ 3_ a 2_ 3 4結構(Dreyfuss G，M J Mat unis, S Pinol-Roma，and C G Burd. hnRNP Proteins and theBiogenesis of mRNA. Annual Review of Biochemistry. 1993，62:289-321.)。對PAB基因的研究主要集中在酵母和動物中，它們的一級結構和基因結構都具有保守性，而對高等植物的研究較少。在酵母細胞中PAB基因的缺失突變體是致死型的，這表明該基因在生命過程中起著重要的作用，而擬南芥PAB5基因是花葯特異性表達的，並且它可以互補酵母的缺失突變體，恢復酵母細胞的活性(Belostotsky D A, Meagher R B. A pollen-, ovule-, and earlyembryo-specific poly (A)binding protein from Arabidopsis complements essentialfunctions in yeast. Plant Cell, 1996, 8 (8) : 1261-75. ) 由此推測該基因在小抱子發育過程中可能也起到重要的作用，它的缺失可能會引起植物的敗育。目前已經從酵母(SachsA. B，Bond M. ff. and Kongherg R. D. A single gene from yeast for both nuclear andcytoplasmic polyadenylate-binding proteins:domain structure and expression.Cell,1986, 20;45(6):827-35.)> 爪娃(Leflore V, Vincent A, Amalric F. Drosophilamelanogaster poly(A)-binding protein:cDNA cloning reveals an unusualIylong3 ' -untranslated region of the mRNA, also present in other eukaryoticspecies. Gene, 1990，15;96(2):219-25.)、人(Grange T, de Sa CM, Oddos J, Pictet Ral.Human mRNA polyadenylate binding protein:evolutionary conservation of anucleic acid binding motif. Nucleic Acids Res. 1987June, 15(12):4771-4787.)>擬南芥(Belostotsky D A, Meagher R B. Differential organ-specific expressionof three poly(A)-binding-protein genes from Arabidopsis thaliana. Proc NatlAcad Sci U S A. 1993，90 (14) : 6686-6690.)、胡蘿蔔(林慧馨，張雷，楊志攀，黃美娟，吳乃虎.胡蘿蔔DcPAB基因的分離及其結構與功能分析.生物化學與分子生物學報，2004，20(3) :319-324.)、小麥(Hanh. Le, Su-chih. Chang, Tanguay R. L, Gallie D. R. Thewheat poly (A)-binding protein functionally complements pabl in yeast. Eur.J. Biochem, 1997，243(1-2) :350-7)等物種中分離到了 PAB基因，但是尚無油菜PAB基因的相關研究報告。油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計民生具有重要影響。油菜雜種優勢明顯，利用細胞核雄性不育配製雜種優勢組合是雜種優勢利用的重要途徑。目前國內外已發現了多種類型的`細胞核雄性不育材料，並在理論和應用方面取得了重要進展，而新型不育源的發現和研究一直是雜種優勢研究的基礎，並以此創造出更多的天然和人工不育材料，為育種和生產所應用。因此，本發明開發了一個和油菜花粉發育和育性調控相關的基因BnPAB5。通過螢光定量PCR檢測該基因在可育植株的雄蕊中高量表達。通過轉基因實驗證實，抑制At PAB5的表達會造成擬南芥花葯發育異常，導致雄性不育；而通過在擬南芥中過表達BnPAB5基因，和雄性不育轉基因植株雜交可以使雜交後代中PAB5基因的表達水平得到恢復，同時花葯和花粉粒的育性也恢復到正常水平。申請人的結果預示著PAB5在控制油菜和擬南芥花粉育性，創造雄性不育轉基因新材料中具有相當的應用前景。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種油菜BnPAB5基因，該基因在油菜的花葯中高效表達，通過抑制該基因的表達可以降低植物花葯的育性，從而獲得雄性不育植株，應用於雜交育種。而且該基因在其它大部分植物組織中不表達，因此在植物基因工程中沉默該基因的表達不會引起植物營養生長階段的變化。本發明的另一個目的是在於提供了一種油菜BnPAB5基因的製備方法，通過BLAST比對油菜的EST資料庫，獲得油菜全長序列的電子克隆後，應用簡單的PCR方法即可以獲得該基因的序列。本發明還有一個目的是在於提供了一種油菜BnPAB5基因在控制油菜和擬南芥花粉育性中的應用。通過沉默該基因的表達，發明人可以人工創造雄性不育系材料；而利用基因工程技術過表達該基因得到的恢復系材料，可以使雄性不育材料花粉的育性得到恢復。這一對材料可以在油菜雜交育種生產中應用。為了完成上述目的，本發明採用如下技術方案為了獲得本發明，發明人對油菜花粉發育過程中的相關基因進行了深入和全面的研究，結果發現了一個新基因，該基因在一種新的啟動子的控制下，在可育植株的花葯中高效表達，而在不育植株中不表達。因此該基因和植物花粉的育性調控有關。轉基因實驗也證實了這一點抑制該基因的表達會造成植物花葯發育異常，導致雄性不育。根據本發明的一個方面，上述目的可以通過提供油菜花葯高效表達基因Bn PAB5來實現，所述基因含有SEQ ID No.1所述核苷酸序列或與它們實質上同源的核苷酸序列。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供植物油菜花葯高效表達多肽BnPAB5來實現，所述多肽含有SEQ ID No. 2所述胺基酸序列或與它們實質上同源的胺基酸序列。根據本發明的另一個方面，上述目的通過提供含有以BnPAB5和AtPAB5基因同源區段400bp序列的RNA幹擾重組載體(RNA1-AtPAB5)來實現對擬南芥中PAB5基因表達量的抑制。 根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體(RNA1-AtPAB5)轉化的微生物(根癌農桿菌EHA105，購自大連寶生物生物製品有限公司，以下相同)來實現對擬南芥的轉化，從而抑制擬南芥中RabGDI3基因的表達量。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物(包含有RNA1-AtPAB5重組載體的根癌農桿菌EHA105轉化的轉基因植物來實現對花葯育性的調控，獲得雄性不育轉基因植株。一種油菜BnPAB5基因的製備方法，其步驟是1、油採花粉聞效表達基因的克隆本發明所用油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L.)中雙九號(油料作物研究所王新發副研究員提供，以下相同)。中雙九號播種於大田，正常田間管理。在液氮中將油菜幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，以下相同)的要求進行RNA的提取。提取的總RNA溶於無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN, USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結合1% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑑定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板進行逆轉錄，得到的cDNA分裝後於_20°C保存備用。根據GenBank中擬南芥PAB5基因序列在NCBI網站上用BLASTN(http://WWW. ncb1. nlm. nih. gov/BLAST)進行比對，分別獲得與擬南芥PAB5基因序列5 '端同源的油菜EST序列以及和3'端同源的油菜EST序列，基於油菜EST文庫的電子延伸得到了全長2196bp的PAB5基因的cDNA序列。然後根據獲得的油菜EST序列與擬南芥PAB5基因起始密碼子和終止密碼子同源區域設計引物從而確保擴增產物為全長序列。油菜 PAB5 擴增引物序列分別為 PAB5A 5 ' -GCGATGGTTGATCAAGTCAT-3 '和 PAB5S -TCACTCCGTTGAGGAGGG-3;(以下相同)。以油菜葉片cDNA為模版，用上述引物進行PCR擴增，PCR程序為94°C,5min ;94°C，45s，57°C，45s，72°C，2min，33個循環；72°C, IOmin0PCR產物經1. 0% (瓊脂糖凝膠/TE溶液質量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條約2.01*左右帶(1998&

圖1)。利用凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收後，連接到PMD18-T載體(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，熱激法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)轉化gold菌株的感受態細胞(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，塗布於含有氨節青黴素50 V- g/mL (質量體積比，以下相同)的LB固體培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白腖，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解於蒸餾水中，定容於1000毫升。分裝於500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒20分鐘。分裝到培養皿中，4°C冷藏備用，以下相同)平板上，370C培養過夜，挑選白斑6個。採用M13引物5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 '和 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落 PCR 檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙籤挑取少量菌斑做模版，反應體系為10 y L內含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I,1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I u 1，5，引物(lOumol/L)0. 5u 1，3，引物(10umol/L)0. 5u 1，Taq (5U/ u 1)0. 5 u 1，ddH206. 5 u I。反應條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C 2分鐘30秒，33個循環，72 °C 10分鐘，擴增大小為1998bp，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確後。將PCR檢測大小正確的菌斑接種到含氨苄青黴素50 u g/mL的液體LB培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白腖，5克酵母提取物和10克氯化鈉，溶解於蒸餾水中，定容於1000毫升，121°C，6. 859 X 104Pa下高壓消毒20分鐘，以下相同)，37°C下200r/min振蕩培養過夜，小量鹼法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)提取質粒，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒DNA大小正確後(為2064bp)，採用Kpn I /Xba I酶(2種酶購自TaKaRa公司，以下相同)切對質粒進行雙酶切(以下相同)，酶切體系(以下相同)為 IOu 1，包含質 粒DNA5ii I,Kpn I 0. 5 u I,Xba 10. 5 u l,ddH204u 1，37°C過夜，1.0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測正確的陽性重組克隆命名為pMD18-BnPAB5(將目的基因序列BnPAB5連入pMDlS-T載體構建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動子的序列信息，將pMD18-BnPAB5送上海英駿公司進行測序。將測序獲得的BnPAB5基因的⑶S序列與擬南芥CDS序列通過NCBI比對分析，發現該段區域中含有完整的ORF閱讀框及起始密碼子ATG。分析結果顯示，獲得了一種分離的油菜BnPAB5基因cDNA全長(⑶S序列，以下相同)，其序列為SEQ ID N0:1所示核苷酸序列。利用NCBI的開放閱讀框尋找程序(0RF founder)確定BnPAB5基因的開放閱讀框，推導出蛋白質序列編碼的胺基酸。獲得了一種分離的油菜BnPAB5蛋白全長，其序列為SEQID NO:2所示胺基酸序列。該基因的開放讀碼框所推導的蛋白質序列編碼682個胺基酸。對蛋白質的分子量和理論等電點進行在線計算(http://us. expasyorR/tools/pi tool, htm)。蛋白質的分子量大約為71598. 4Da，理論等電點約為8. 38。通過在線軟體ProtScale (http://www. expasy. ch/tools/protscale. html)和 TMHMM (http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)對PAB5的CDS序列進行的分析表明它是一個非分泌性蛋白，沒有信號肽區段，也沒有跨膜結構域。BLASTp在線分析軟體將推導的編碼蛋白與Genebank中的序列進行同源性比較，發現該序列與擬南芥AtPAB5、菸草NtPAB、水稻OsPAB、胡蘿蔔DcPAB、玉米ZmPAB、黃瓜CsPAB、小麥TaPAB的PAB蛋白質胺基酸序列同源性分別達到76%、52%、52%、53%、51%、52%、53%。用 NCBI 的 Conserved Domains 工具(http://wwwncb.1nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)在線進行保守區域分析結果表明該基因屬於Poly (A)結合蛋白超家族，含有4個RNA識別位點(RNA recognition motif, RRM),每個RRM包括兩個更為保守的RNP I和RNP II序列元件。BLAST發現BnPA B5與AtPAB5⑶S核苷酸同源性大於90%，利用DNAMAN以及在線軟體TC0FFEE(http://www. tcoffee. org/)它們的胺基酸同源性達到76%。結果表明所克隆的油菜PAB5是AtPAB5的同源基因，將其命名為BnPAB5。因此BnPAB5和其他PAB基因一樣在調控轉錄本的多腺嘌呤化、運輸、翻譯的起始等過程起著重要的作用，具有控制基因表達的功能。本發明通過構建PAB5的RNA幹擾載體轉化擬南芥後發現，轉基因植株由於PAB5的表達受到抑制而均出現了雄性不育的表型。說明PAB5具有控制擬南芥花葯發育和花粉育性的新功能。2、油菜BnPAB5基因的表達模式本發明所用另一種油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L.)顯性核不育雜合不育系J03AB(Msmsrfrf*msmsrfrf )。系經多年回交和姐妹交而育成。不育株命名為A,可育株命名為B，二者可視為一對近等基因系，僅存在不育位點差異(胡勝武，于澄宇，趙惠賢，路明，油菜顯性核不育材料Shaan — GMS純合兩型系803AB的選育。西北農業學報，2002，ii (4)25 — 2)。供試材料播種於大田，正常田間管理。從同一大田生長條件相同的可育植株上取根、莖、葉、花蕾、角果，從花蕾中解剖分離雌蕊和雄蕊(花葯)，每種材料至少取三個重複，每個重複至少一株，取樣後用錫箔紙包裹，迅速放置於液氮中，-80°C保存。在大田分別從油菜可育植株和不育植株上取花蕾，帶回實驗室後，在冰盒上分別挑取可育植株和不育植株花蕾中的雄蕊和雌蕊，每種材料至少取三個重複，每個重複至少一株，取樣後用錫箔紙包裹，迅速放置於液氮中，_80°C保存。提取RNA時,在液氮中將植物樣品研磨至粉狀,利用Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，以下相同)的要求進行RNA的提取。所提總RNA溶於無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BEC KMAN，USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結合1% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑑定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板，根據Promega公司逆轉錄酶的說明進行逆轉錄，得到的cDNA分裝後於_80°C保存備用。螢光定量PCR儀為IQ5 (美國伯樂公司)，採用油菜Actin作為內標基因(登錄號 AF111812)，Actin 基因引物為 5 ' -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 '和5 ' -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 '。根據擬南芥和油菜PAB5基因CDS序列的保守區段設計的BnPAB5基因引物為5 ' -TGGACCAAACTGTCAACGAAG-3 '和5' -CCAAGTGAACGACGAGTCAAG-3'。螢光定量PCR反應每組實驗 均完成三個生物學重複，每個生物學重複至少做三次技術重複。分別檢測BnPAB5在油菜組織(根、莖、葉、花、角果、花葯、雌蕊)中的表達。用比較Ct法(A ACt)計算基因的相對表達量。通過2_AAet估算目的基因的相對表達量和系統誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001, Analysis of RelativeGene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the2_AAcT Method.METH0DS25, 402-408.)。在計算相對表達量時，以根的樣本為參照，即將其值轉換成I (標準值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達值。3、PAB5基因的功能驗證3. 1PAB5基因RNA幹擾植物表達載體RNAi_AtPAB5的構建為了研究本發明中的花粉高效表達基因BnPAB5的功能，採用了 RNA幹擾(RNAinterference, RNAi，以 下相同)技術。由於油菜BnPAB5和擬南芥的AtPAB5具有相似的表達模式(Belostotsky A, Meagher B. A pollen-, ovule-, and early embryo-specificpoly (A)binding protein from Arabidopsis complements essential functions inyeast. Plant Cell, 1996，8 (8) : 1261-75.)、基因結構(石磊 油菜PAB基因家族成員的克隆、表達模式分析和PAB5功能研究.([博士學位論文].北京中國農業科學院，2009)、76%以上的蛋白同源性，推測兩者具有相同的功能。因此油菜PAB5的功能是通過研究擬南芥AtPAB5基因的功能獲得的。在上述序列分析的基礎上，選擇AtPAB5基因CDS序列中和BnPAB5基因CDS序列同源性最高的一段400bp的序列為RNA幹擾靶標片段。由此設計引物PAB5-R1-1-1 :5' -GACATCTAGAGAGTCGTGCGATGGAAAG-3'和 PAB5-Ri_l_2 :5 ' -CGCGGATCCCTTGCAGGAAGTCACATTC-3,。引物序列的5'末端分別引入了 XbalI和BamHI限制性內切酶位點。擬南芥哥倫比亞型種植於生長間，花期收集擬南芥花蕾，投入液氮速凍。按照Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，前面已述)的要求提取擬南芥花蕾的RNA,以獲得的RNA為模板，根據Promega公司逆轉錄酶的說明進行逆轉錄(前面已述)，得到的cDNA分裝後於_80°C保存備用。以獲得的花蕾cDNA為模板進行AtPAB5基因幹擾靶標片段的PCR擴增。P CR引物為PAB5-R1-1-1和PAB5-R1-l-2 (前面已述)。PCR反應體系為25 y L內含:1 XPCR buff er, MgCIl. Smmol /T,, dNTPO. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為 0. 5mol/L，Pfu 酶1. 5 單位，模板約 lOOng。PCR 反應程序如下94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 45sec,72°C lmin, 35個循環；72° C延伸8min。PCR產物經1. 0% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)。完成後用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段(前面已述)，獲得AtPAB5基因幹擾靶標cDNA片段。用獲得的AtPAB5基因幹擾靶標cDNA片段替換pCAMBIA1301 (購自武漢競成生物科技有限公司)植物表達載體中的GUS基因序列，獲得AtPAB5基因的RNA幹擾表達載體。為完成此目的，首先用Xba I/BamHI雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)AtPAB5基因幹擾靶標⑶NA片段，同時用Xba I/BamHI酶切pCAMBIA1301 (前面已述)質粒的⑶S片段。酶切體系為IOul (前面已述)，酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之後，用1%(質量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。將AtPAB5基因幹擾靶標⑶NA片段的酶切產物和載體pCAMBIA1301上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按AtPAB5基因幹擾靶標CDNA片段的酶切產物比pCAMBIA1301載體片段(150ng AtPAB5基因CDNA片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10 X反應緩衝液，無菌水補充體積至20 u L，16°C連接過夜。轉化後，在含有卡那黴素(50 u g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑後以BarF:5' -CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGG-3'和 BarR:5' -CCCGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3'(以下相同)引物進行菌落PCR檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙籤挑取少量菌斑做模版，反應體系為10 ii L內含:1OXTaq buffer (含MgCl2) I U 1，1. 5mmol/L dNTP (IOmmoI/L) I u 1，5，引物(10 u mol/L) 0. 5 U 1，3，引物(10 u mol/L) 0. 5 u l，Taq(5U/U 1)0. 5u l,ddH206. 5 u I0 反應條件為 94 °C 5 分鐘，94 °C I 分鐘，55°C 30 秒，72°C 2 分鐘 30秒，33個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為1028bp，1. 0%(前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確後，選擇陽性菌株提質粒，酶切(前面已述)驗證正確的重組質粒命名為RNA1-AtPAB5。通過凍融法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)將含有上述獲得的RNA1-AtPAB5載體的質粒轉化農桿菌EHA105(購自大連寶生物生物製品有限公司，以下相同)步驟如下1:取0. 2ml感受態農桿菌，於冰中緩慢融化。2 :加入約2 ii g重組質粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min後，投入液氮速凍lmin，然後37°C水浴5min，融化細胞。3 :加入800iU不含抗生素LB液體培養基(前面已述)，28°C輕搖培養4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，細胞重懸於0. 2ml LB液體培養基(前面已述)培養基。5 :將培養物均勻塗布在含Rif (50mg/L)和Str (50mg/L)的LB固體培養基(前面已述)瓊脂板上，28°C培養2天，待平板上出現轉化子後挑菌，以BarF和BarR (前面已述)為弓I物進行菌落PCR檢測(前面已述)。3. 2RNA幹擾載體RNAi_A`tPAB5在擬南芥中的遺傳轉化及轉基因植株篩選採用花序侵染法(Zhang X. R. et al.Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)進行擬南芥轉化。製備含有重組載體RNA1-AtPAB5的根癌農桿菌EHA105 (前面已述)菌液，在轉化前一天轉入含有利福平50ii g/ml的LB液體培養基((前面已述)中，28°C過夜培養。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L1300)於276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當菌液的吸光值達到在1.6-2. 0之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，沉澱懸浮於等體積的5%蔗糖溶液(蔗糖與蒸餾水的質量體積比，以下相同)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwet 1-77 (購自北京五洲元業科貿中心，以下相同)。混勻後把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15秒，取出植株。轉化後的植株用一個黑色塑膠袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑膠袋揭開，放在光強的地方培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收穫種子，種子在培養箱或者日光下乾燥3-5天。將轉化收穫的TO代種子播在混有PNS營養液的蛭石中，(PNS營養液成份為每升含 5mllM KN03，2mllM Ca(N03)2 . 4H20，2mllM MgS04 . 7H20，2. 5ml20mM Fe. EDTA,2. 5mllM磷酸緩衝液(pH5. 5)，Iml MS微量元素)。轉移到溫度20-25°C，光照強度5000-10000流明，光周期為16小時光照/8小時黑暗，空氣溼度大於80%以上的培養間中，正常管理。根據表達載體上特有的草胺磷(Bar)抗性篩選陽性植株。擬南芥長出一片真葉後，噴灑30ppm的除草劑Basta(購自拜爾公司)。一星期後，噴灑50ppm的Basta，獲得擬南芥轉基因陽性苗。篩選得到的轉化植株，稱Tl代轉化植株(以下相同)。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA (前面已述)，進行轉化材料的PCR陽性檢測(以下相同)。引物序列為BarF和BarR(前面已述)。反應體系為10 yl內含模板DNA模板I y L (約IOOng)，10 X Taqbuffer (含 MgC12)lii I,1. 5mmol/L dNTP (IOmmoI/L) I U 1，5，引物(10 u mol/L) 0. 5 U 1，3』引物(10umol/L)0. 5u 1，Taq(5U/ u I) 0. 5 u 1，ddH205. 5 u I。反應條件為 94。。5 分鐘，94°C 30秒，550C 80秒，72°C I分鐘，32個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為1028bp。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)，結果表明，AtPAB5基因RNA幹擾植物表達載體RNAi_AtPAB5已經成功轉入擬南芥。共獲得了 10株轉基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同，圖4)，分別命名為M1-1，M1-2等(以下相同)。3. 3RNA幹擾載體RNAi_AtPAB5轉基因擬南芥表型觀察經過除草劑篩選和PCR檢測後獲得的轉基因陽性植株在生長間中正常管理並觀察其表型。在開花期，選取各個轉基因植株的分支頂端已經漏白但未開放的花朵，撥開花蕾。在放大鏡(3倍)以及體視顯微鏡(OLYMPUS SZ61TRC)下觀察花葯以及花粉。用解剖針分離出花葯，參照亞歷山大染色法(Alexander, M. P. Differential staining of abortedand non-ab orted pollen. Stain Technol,，44:117122.，1969,以下相同)，40°C水浴加熱亞歷山大染色液(以配製大約100毫升染色液為例乙醇10ml，1%的孔雀石綠酒精溶液lml，蒸餾水50ml，甘油25ml，1%的酸性品紅水溶液5ml，1%的橙黃G水溶液0. 5ml，冰醋酸
l-4ml，苯酚5克，水合氯醛5克，以下相同)並浸泡花葯過夜(10-15小時)，用壓片法在顯微鏡(OLYMPUS 1X71)下觀察小孢子。通過觀察並統計正常小孢子(染成桔紅色)和敗育小孢子(染成綠色)的比例判斷小孢子的敗育程度。結實期用肉眼觀察轉基因擬南芥的結實情況。染色觀察結果顯示野生型擬南芥的花葯飽滿並且充滿了小孢子，小孢子均染成橘紅色，說明小孢子發育正常。而轉基因擬南芥的花葯中小孢子數目都遠遠少於野生型，有少量正常的小孢子數目，其它均為空癟或被染成綠色的敗育的小孢子(圖5)。經過對所有轉基因後代植株進行觀察統計，結果顯示大部分轉基因後代擬南芥均出現了雄性不育表型，說明AtPAB5幹擾轉基因植株出 現了典型的雄性不育表型。4、BnPAB5基因的互補功能驗證4.1花葯高效特異表達啟動子PBnPABP3驅動的BnPAB5基因過表達植物表達載體0X-BnPAB5的構建和根癌農桿菌菌株EHA105的轉化。為了進一步證實油菜BnPAB5基因和擬南芥AtPAB5基因具有相同的功能，我們構建由花葯高效特異表達啟動子Pbhpabp3 (專利號ZL2011110122101.2，發明名稱甘藍型油菜BnPABP3啟動子的製備方法及其應用，以下相同)驅動的BnPAB5基因過表達植物表達載體0X-BnPAB5，轉化擬南芥。用獲得的0X_BnPAB5轉基因後代為父本，以RNA幹擾的RNA1-AtPAB5雄性不育轉基因後代為母本進行雜交，檢測雜交後代植株的花葯育性是否能夠得到恢復。過表達載體的構建方法如下中雙九號油菜花期，在田間收集油菜花蕾，投入液氮速凍。按照Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，前面已述)的要求提取中雙九號(前面已述)花蕾的RNA,以獲得的RNA為模板，根據Promega公司逆轉錄酶的說明進行逆轉錄(前面已述)，得到的cDNA分裝後於_80°C保存備用。以獲得的花蕾cDNA為模板進行BnRab⑶13基因⑶NA片段的PCR擴增。根據甘藍型油菜BnPAB5基因序列(SEQ ID NO:1)設計引物，BnPAB5A :5' -GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG-3'和 BnPABSSj' -GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC-3'。引物序列的5'末端分別引入了 XbalI和SacI限制性內切酶位點。PCR反應體系為25 y L內含:1 XPCR buffer, MgCIl. Smmol /T,, dNTPO. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為 0. 5mol/L，Pfu 酶1. 5 單位，模板約 lOOng。PCR 反應程序如下94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 45sec,72°C lmin, 35個循環；72° C延伸8min。PCR產物經1. 0% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)。完成後用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段(前面已述)，獲得BnPAB5基因⑶NA全長序列。田間收集油菜中雙九號的葉片，利用SDS裂解法(前面已述)提取油菜DNA，以DNA為模板，參照專利ZL2011110122101. 2 (甘藍型油菜BnPABP3啟動子的製備方法及其應用)所述步驟進行PBnPABP3 啟動子的擴增，引物為PBnPABP3A 5' -GACATCTAGACGCTGTCGTTGGGGCAATTC-3'和 PBnFABP3S :5' -CAGAAGCTTAAAAGACTTACCGAGTTGAACC-3'。引物序列的 5'末端分別引入了 HindIII和NotI限制性內切酶位點。用獲得的PBnPABP3啟動子序列和BnPAB5基因序列分別替換pBI121植物表達載體中的CaMV35S序列和⑶S序列，構建PBnPA·BP3驅動的PAB5基因的植物過表達載體。為完成此目的，首先用Xba I/SacI雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)BnPAB5基因CDNA 片段，同時用 Xba I/Sac I 酶切 pBI121(Chen, P. Y.，Wang, C. K.，Soong, S. C. To, K. Y. Complete sequence of the binary vector pBI121and its application in cloning T-DNAinsertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11，287-293)質粒的 GUS 片段。酶切體系為IOyl (前面已述)，酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之後，用1% (質量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。將BnPAB5基因CDNA片段的酶切產物和克隆載體pBI121上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按BnPAB5基因CDNA片段的酶切產物比PBI121載體片段(150ng 81^八85基因0)嫩片段501^載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度t匕)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10 X反應緩衝液，無菌水補充體積至20 u L，16°C連接過夜。轉化後，在含有卡那黴素(50 ii g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑後以NP T II F 5 ' -GATGGATTGCACGCAGGT-3 '和 NPT II R :5 ' -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '引物進行菌落PCR檢測(前面已述)。1.0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確後。獲得中間載體pBI121-BnPAB5 (以下相同)。隨後用Hindlll/Notl雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)PBnPABP3啟動子片段，同時用Hindlll/Notl雙酶切中間載體pBI121-BnPAB5 (前面已述)質粒的CaMV35S片段。酶切體系為IOiU (前面已述)，酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之後，用1% (質量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。將Pbhpabp3啟動子片段的酶切產物和中間載體pBI121-BnPAB5上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按Pbiipabp3啟動子片段的酶切產物比pBI121-BnPAB5載體片段(150ngPBnFABP3啟動子片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10X反應緩衝液，無菌水補充體積至20 u L，16°C連接過夜。轉化後，在含有卡那黴素(50 ii g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑後以PBnFABP3啟動子特異引物PBnMBp#和PBnMBP3S (前面已述)進行菌落PCR檢測(前面已述)。1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小。選擇陽性菌株提質粒，酶切驗證正確的重組質粒為Pbhpabp3啟動子驅動的BnPAB5基因過表達植物表達載體，命名為0X-BnPAB5 (以下相同)。然後利用凍融法(前面已述)將0X-BnPAB5轉入根癌農桿菌EHA105 (前面已述)，卡那黴素(50 u g/mL)和利福平(50 u g/mL)雙抗性平板篩選，挑斑，進行菌落PCR檢測驗證(前面已述)。4. 20X-BnPAB5在擬南芥中的遺傳轉化及轉基因植株篩選採用花序侵染法進行擬南芥轉化(前面已述)。在轉化擬南芥前一天，將製備含有載體0X-BnPAB5的根癌農桿菌EHA105(前面已述)菌液轉入含有卡那黴素50 u g/ml、利福平50 u g/ml的LB液體培養基中，28°C過夜培養。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L1300)於276納米波長下檢測吸光值，當菌液的吸光值在1. 6-2. 0之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心IOmin,棄上清,沉澱懸浮於等體積的5% (質量體積比)鹿糖中。將渾池的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwetl-77 (購自北京五洲元業科貿中心，以下相同)。混勻後把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15秒，取出植株。轉化後的植株用一個黑色塑膠袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑膠袋揭開，放在光強的地方培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收穫種子，種子在培養箱或者日光下乾燥3-5天。將轉化收穫的TO代種子用70%(體積比)酒精和0. 01%(體積比)的升汞表面消毒10分鐘後用蒸餾水洗滌數次(5 7次)，然後均勻地吹打到MS固體篩選培養基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液IOml ；MS有機母液IOml ；MS鐵鹽IOml ;肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH調PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌後備用。加入Sg瓊脂粉可配置成固體培養基。各種母液配方見表I)表面。4°C春化4-6天，放入恆溫培養箱培養。根據表達載體上所特有的卡那黴素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片進行PCR陽性檢測，引物為NPT II F :和NPT II R (前面已述)，反應體系為 lOiil。內含模板 DNAlii L(約 lOOng)，10XTaq buffer (含 MgCl2)lul,l. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I y 1，5』 引物(10 y mol/L) 0. 5 y 1，3，引物(10 y mol/L)0. 5u l,Taq(5U/u 1)0. 5 u l,ddH20 5. 5 u I0 反應條件為 94°C 5 分鐘，94°C 30 秒，55。。30秒，72°C I分鐘，32個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為800bp。結果表明(圖7)獲得了轉基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同)。將陽性植株自交3代以上，獲得10個純合T3代株系。分別命名為0X-1，0X-2等(以下相同)。表IMS培養基母 液配方
權利要求
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列。
3.權利要求1所述的一種分離的基因在控制擬南芥花粉育性中的應用。
4.權利要求2所述的一種分離的多肽在控制擬南芥花粉育性中的應用。
5.權利要求1所述的一種分離的基因在控制油菜花粉育性中的應用。
6.權利要求2所述的一種分離的多肽在控制油菜花粉育性中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種油菜BnPAB5基因及其應用，一種分離的基因，其序列為SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示。PAB5通過與poly(A)尾巴的結合在轉錄本的多腺嘌呤化、運輸、翻譯的起始等過程起著特殊的作用，從而調控其他基因的表達過程。BnPAB5在油菜花葯和小孢子中呈顯著的優勢表達。幹擾擬南芥AtPAB5的表達能夠使其小孢子敗育。利用過表達BnPAB5的轉基因擬南芥作為父本，和幹擾AtPAB5的轉基因擬南芥授粉，雜交後代植株花葯和花粉育性得到恢復。這一互補實驗證實油菜BnPAB5和擬南芥AtPAB5具有相同的功能控制油菜、擬南芥花葯發育以及花粉育性。通過基因工程技術調控PAB5的表達水平可以控制花粉的育性，創造雄性不育系材料和恢復系材料，可用於雄配子發育研究及農作物品質改良。
文檔編號C07K14/415GK103045610SQ20121050848
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月1日 優先權日2012年12月1日
發明者劉勝毅, 董彩華, 黃軍豔, 石磊, 童超波, 劉越英, 程曉輝 申請人:中國農業科學院油料作物研究所