用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法

2023-09-19 22:34:20 2

專利名稱：用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法
技術領域：
本發明屬於生物農藥技術領域。
背景技術：
目前雜草生物防治已成為研究熱門，各國已篩選出許多生防潛力菌，主要為真菌，有的已開發成雜草生防製劑。稗草是稻田中主要雜草，近10年來，國內外許多機構均開展了稗草生物防治研究，從感病稗草上分離得到許多病原菌，尤其是病原真菌尖角突臍孢(Exserohilum monoceras)和內臍孺孢(Drechslera monoceras)為最有潛力開發成稗草生防製劑的菌株。真菌生防製劑主要是利用其子實體——孢子來感染靶標物，使其感病致死，從而達到防治有害生物的目的。因此，潛力菌的產孢量是決定該菌開發和應用前景的主要因素之一。而國內外目前的研究成果還無法達到能實際推廣應用的滿意效果，主要是產孢量偏低。如國際水稻所對E.monoceras菌孢子在22種農業物質上的固體發酵產孢情況進行研究，結果最大產孢量是在玉米葉上，每克幹玉米葉產孢量為1.8×106個孢子；越南研究了該菌株在27種農業物質上的產孢量，最大產孢量出現在谷糠，二次培養產孢之和為每克谷糠2.05×105個孢子。

發明內容本發明目的是在現有技術基礎上，對稗草生防菌孢子的生產進一步開發研究，以克服產孢量低而無法普遍使用的缺陷，採用稗草為培養基質，提供一種利用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法。
用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，該菌株培養後製得接種體，接種到培養基中，其特徵在於包括以下工藝步驟1)採用稗草為培養基質，將稗草植株切割成小段、乾燥，備用。
2)按幹稗草基質∶蔗糖∶KNO3∶K2HPO4∶MgSO4.7H2O∶CaCO3＝100∶3-9∶0.3-0.9∶0.2-0.6∶0.2-0.6∶0.2-0.6的比例配製，加水浸泡24-36小時，然在121℃、0.11MPa/cm2高溫、高壓消毒15-30分鐘，冷卻後製得稗草基質培養基，用於接種、產孢。
3)在無菌條件下將稗草生防菌接種體接種到培養基中，充分攪拌至混合均勻，然後均勻攤放，在25-29℃恆溫、黑暗、通空氣條件下培養7-10天，隨後在25-30℃常溫，經嚴格消毒環境條件下培養10-15天即可收穫孢子。
該生產方法所採用的稗草，其生命力和生長力極強，人工種植方便，因此原料廉價、易得，生產工藝簡單易行，可大規模開發生產，其產孢量高，達到國外同類產品的3.75-33.07倍.
具體實施方案從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，所述的稗草生防菌菌株為病原真菌尖角突臍孢(Exserohilum monoceras)或內臍孺孢(Drechsleramonoceras)或互格交鏈孢(Alternaria alternata)彎孢(Curvularia lunata)。具體分離方法為常規公知技術，在此不再贅述。
稗草基質培養基的製備乳熟期的稗草植株齊泥割下，包括莖、葉和籽粒，並切割成0.1-0.5cm長小段，曬或烘乾至水分14％以下備用。按前述配比和方法製得稗草基質培養基，配製中最好加入少量維生素C。
稗草生防菌接種體的製備稗草生防菌原始菌株接種在PDA培養基上，在25-29℃恆溫、黑暗條件下培養6-8天，形成一級接種體，一級接種體可直接用於少量產孢接種。如用於大規模生產，則需培養二級接種體，具體有兩種方法1)將一級接種體接種在改良Fries液體培養基或馬鈴薯、蔗糖液體培養基中，進行發酵培養15-20天得到菌絲，將菌絲搗碎後製得二級接種體。2)將一級接種體接種在經高溫、高壓消毒的稗草籽粒上，最好為黃熟-成熟期稗籽，在25-29℃恆溫、黑暗條件下培養10-14天，待產生大量孢子和菌絲體後即得二級接種體。所述的改良Fries液體培養基配比為蔗糖30克、酒石酸胺5.0克、NH4NO31.0克、K2HPO41.0克、MgSO40.5克、NaCL0.1克、CaCL20.1克、水解酪朊0.5克、酵母提取物(yeast extraact)1.0克、無菌水1000毫升。所述的馬鈴薯、蔗糖液體培養基為去皮馬鈴薯200-300克、蔗糖10-20克、無菌水1000毫升，再經高溫、高壓消毒。其中的蔗糖可用葡萄糖代替。
將二級接種體接種到上述消毒冷卻後的稗草基質、有機鹽和微量元素的固體培養基中，充分攪拌使接種體與培養基成分均勻混合，然後均勻攤於消毒過的鋁盤或磁碟或簸箕中，以上操作需在無菌條件下進行。在25-29℃恆溫、黑暗、有空氣條件下培養7-10天，每2-3天充分攪動一次，使菌快速、均勻生長。隨後可在25-30℃常溫、經嚴格消毒的環境下培養。10-15天即可收穫孢子。如採用洗滌法收穫，收穫後的培養基質濾幹水分後，可直接用作二次培養，同樣可生產大量孢子。在培養量少的情況下，用菌塊接種和孢子懸液接種效果相差不大，但在大規模接種培養時，以孢子懸液接種為佳。
權利要求
1.用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，該菌株培養後製得接種體，接種到培養基中，其特徵在於包括以下工藝步驟1)採用稗草為培養基質，將稗草植株切割成小段、乾燥，備用，2)按幹稗草基質∶蔗糖∶KNO3∶K2HPO4∶MgSO4.7H2O∶CaCO3＝100∶3-9∶0.3-0.9∶0.2-0.6∶0.2-0.6∶0.2-0.6的比例配製，加水浸泡24-36小時，然後在121℃、0.11MPa/cm2高溫、高壓消毒15-30分鐘，冷卻後製得稗草基質培養基，用於接種、產孢，3)在無菌條件下將稗草生防菌接種體接種到培養基中，充分攪拌至混合均勻，然後均勻攤放，在25-29℃恆溫、黑暗、通空氣條件下培養7-10天，隨後在25-30℃常溫，經嚴格消毒環境條件下培養10-15天即可收穫孢子。
2.如權利要求1所述的用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，其特徵在於稗草培養基中加有少量的維生素C。
3.如權利要求1所述的用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，其特徵在於稗草生防菌菌株為病原真菌尖角突臍孢(Exserohilum monoceras)或內臍孺孢(Drechslera monoceras)或互格交鏈孢(Alternaria alternata)或彎孢(Curvularia lunata)。
4.如權利要求1所述的用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，其特徵在於稗草生防菌接種體的製備稗草生防菌原始菌株接種在PDA培養基上，在25-29℃恆溫、黑暗條件下培養6-8天，形成一級接種體，再將一級接種體接種在改良Fries液體培養基或馬鈴薯、蔗糖液體培養基中，進行發酵培養15-20天得到菌絲，將菌絲搗碎後製得二級接種體。
5.如權利要求1所述的用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，其特徵在於稗草生防菌接種體的製備稗草生防菌原始菌株接種在PDA培養基上，在25-29℃恆溫、黑暗條件下培養6-8天，形成一級接種體，再將一級接種體接種在經高溫、高壓消毒的稗草籽粒上，在25-29℃恆溫、黑暗條件下培養10-14天，待產生大量孢子和菌絲體後，即得二級接種體。
6.如權利要求4所述的用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，其特徵在於所述的改良Fries液體培養基配比為蔗糖30克、酒石酸胺5.0克、NH4NO31.0克、K2HPO41.0克、MgSO40.5克、NaCL0.1克、CaCL20.1克、水解酪朊0.5克、酵母提取物(yeast extraact)1.0克、無菌水1000毫升。
7.如權利要求4所述的用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，其特徵在於所述的馬鈴薯、蔗糖液體培養基為去皮馬鈴薯200-300克、蔗糖10-20克、無菌水1000毫升，再經高溫、高壓消毒。
8.如權利要求4或7所述的用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，其特徵在於所述的馬鈴薯、蔗糖液體培養中的蔗糖可用葡萄糖代替。
全文摘要
用稗草基質生產稗草生防菌孢子的方法，屬於生物農藥技術領域。從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，該菌株培養後製得接種體，將稗草植株切割成小段、乾燥，按比例配以碳、氮源及有機鹽，高溫，高壓消毒，冷卻後製得稗草基質培養基。在無菌條件下將接種體接種到培養基中，經嚴格消毒環境條件下培養。採用的稗草廉價、易得，生產工藝簡單易行，可大規模開發生產，其產孢量高，達到國外同類產品的3.75－33.07倍。
文檔編號A01N63/04GK1438312SQ0210297
公開日2003年8月27日 申請日期2002年2月10日 優先權日2002年2月10日
發明者黃世文, 餘柳青, 段桂芳 申請人:中國水稻研究所