重組的sars病毒n蛋白羧基端肽段與gst的融合蛋白及方法

2023-09-19 13:00:45

專利名稱：重組的sars病毒n蛋白羧基端肽段與gst的融合蛋白及方法
技術領域：
本發明涉及人類醫學衛生領域，尤其涉及一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白及方法。
背景技術：
2002年底在世界各地爆發了一種急性呼吸道傳染病，世界衛生組織(WTO)稱其為重症急性呼吸症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，中文俗稱「非典型性肺炎」，簡稱非典。該病起病急、傳播快，病死率高達5-10％。目前涉及到世界近30個國家和地區，全球患者已達8000多例，並造成多人死亡，發病人數仍有不斷增加的趨勢。
2003年4月16日，世界衛生組織宣布，經過全球10個國家和地區13個實驗室的通力合作，確認在全球多個國家快速傳染的非典型肺炎(英文名稱為SARS，下文簡稱「非典」)的病原體是一種冠狀病毒，以前從未在人體中發現過。非典型肺炎病原，即SARS病毒的分離和確證，對於該病的臨床診斷、治療及預防至關重要，這也是本發明所要解決的問題。
為篩選具有抗原性的冠狀病毒特異的蛋白或多肽片斷，我們用「非典」病人血清篩選了病毒蛋白的多肽庫，發現有些片段呈明顯的陽性反應，其中冠狀病毒N蛋白(nucleocapsid protein)的羧基端，簡稱C末端，集中了二個陽性較強的肽段。為進一步調查該片段的抗原性，我們克隆了覆蓋該片段的編碼序列，並用酵母表達系統進行了體外表達，獲得了融合蛋白。用來自病人的血清作Western檢測，發現該融合蛋白呈陽性反應，進一步用ELISA檢測，融合蛋白與正常人血清呈陰性反應，而與「非典」病人血清呈陽性反應。表明該蛋白可以作為檢測SARS病毒的抗原蛋白，用於SARS病人的檢測，也可以是作為抗SARS病毒的疫苗的候選蛋白。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白及方法。
重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白具有Seq.No.1的序列的多肽。
其方法具體步驟為
1)PCR擴增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)轉化酵母宿主細胞；3)誘導轉化後的酵母細胞進行蛋白質表達；4)回收純化與GST融合的重組蛋白。
本發明的優點是通過基因重組的方法，利用酵母細胞表達了SARS病毒N蛋白C端的融合蛋白，該融合蛋白能與非典病人的血清呈陽性反應，而與正常人血清呈陰性反應。這表明該融合蛋白可作為SARS病毒檢測的抗原體，並能作為疫苗的候選蛋白，同時，我們還建立了表達純化該融合蛋白的實驗體系。


圖1是PCR擴增冠狀病毒N蛋白的C末端編碼區示意圖，圖中，箭頭所示為500bp大小的擴增產物；圖2是用EcoRI酶切鑑別重組克隆示意圖，圖中，pEGH為沒有重組的質粒，pEGH-NC為含有SARS病毒N蛋白C端的重組質粒；圖3是用Anti-Histag抗體檢測重組蛋白的表達示意圖；圖4是用GST樹脂純化重組蛋白示意圖；圖5是用SARS病人血清檢測重組蛋白的抗原性示意圖，圖中，A，B分別為兩個病人的檢測結果，箭頭所示為重組的融合蛋白；圖6是用ELISA檢測不同的抗血清與重組蛋白的反應示意圖，圖中，1、2、3、4位確診SARS病人的檢測結果，5、6、7、8位正常人對照。
具體實施例方式
一、PCR擴增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆提取病毒RNA，以此為模板反轉錄合成為cDNA後，通過PCR擴增獲得含N蛋白C端編碼區的產物，克隆到pGEM-T載體(Promega公司)中。以含該片段的質粒DNA為模板，利用含酵母表達載體序列的一對引物將目標片段再次用PCR擴增，獲得的產物用1％的瓊脂糖電泳檢測，所獲得的片段符合預計的長度。A.擴增N蛋白C末端所用的引物序列5』-AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG -3』5』- AATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3』B.含酵母表達載體序列的引物5′-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAAATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3′5′-GCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3′C.擴增的片段序列如發明內容的Seq.No.1所述的多肽片斷。
二、轉化酵母宿主細胞1.表達載體DNA的線性化本實驗所用的酵母表達載體為pEGH(參見Zhu Heng等，Naturegenetics，2000)，將pEGH質粒DNA用HindIII和XbaI酶切後備用。
2.轉化酵母細胞混合線性化的pEGH質粒DNA和PCR產物，用PEG法轉化酵母細胞，轉化後的酵母細胞塗於SC-Ura-固體平板培養基，30度培養2天後，肉眼可見再生菌落。
酵母培養基SC-Ura-固體培養基、SC-Ura-/葡萄糖液體培養基、SC-Ura-/棉子糖液體培養基配製按《酵母遺傳實驗方法》(清華大學出版社2002年第一版)3.重組菌落的鑑別用苯酚法提取酵母的質粒DNA後，用電激法轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取再生菌落接種到LB液體培養基(含Ampicillin 60ug/ml)，37度培養過夜後，提取質粒DNA，用EcoRI限制性內切酶消化後，經瓊脂糖凝膠電泳鑑別重組克隆，含有目標片段的質粒DNA產生的一條片段大於對照質粒DNA，見圖2。對目標菌落測序，證明所獲得的重組克隆含有來源於SARS病毒的N蛋白C末端。
4.將目標克隆轉化酵母細胞將測序確認後的質粒DNA用PEG法轉化酵母細胞，轉化後的酵母細胞塗於SC-Ura-固體平板培養基，30度培養2-3天後獲得再生菌落。
三、融合蛋白的誘導表達與檢測接種再生菌落到5ml SC-Ura/葡萄糖液體培養基中，30度振蕩培養過夜，取0.2ml過夜菌接種到50ml SC-Ura-/棉子糖培養基中，至OD600＝0.6-0.8後加入D-半乳糖(終濃度為2％)繼續振蕩培養4-5小時。離心收集培養物，無菌水洗2次。
四、回收純化與GST融合的重組蛋白用裂解液重新懸浮酵母細胞，加入酸洗過的玻璃珠(Sigma，G-8772)，劇烈振蕩3-5分鐘，離心後回收上清，再加入裂解液懸浮，振蕩，回收上清，合併兩次上清，高速離心去掉不溶物，將上清轉移到另一離心管中，加入GST樹脂(Glutathione-uniflow resin，購自Clontech公司)，旋轉混合1小時，離心回收GST樹脂，用裂解液洗3次，再加入還原型穀胱苷肽(20mM)，旋轉混合1小時，離心回收上清，即為純化的重組蛋白，將獲得的融合蛋白用SDS-PAGE分離後，考馬斯亮蘭染色，脫色後可見純化的蛋白條帶，考染的結果表明，獲得的蛋白純度較高，沒有可見的雜蛋白汙染，見圖4。
五、Western檢測融合蛋白本實驗所用的酵母表達載體產生的是「GST-His-目標蛋白」的融合產物，為了檢測表達產物，將酵母的細胞裂解液加入點樣緩衝液，100度加熱5分鐘，用10％的SDS-PAGE分離，然後將蛋白樣品轉到PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉1小時，「一抗」用anti-His tag抗體保溫2小時，漂洗後加入「二抗」(anti-rabbitIgG，購自北京中山公司)，保溫1小時後，用一步法檢測試劑盒檢測。實驗結果如圖3所示。表達目標蛋白的泳道的條帶顯然大於對照泳道中表達GST的條帶，表明該系統產生了融合蛋白，從條帶的大小及測序結果可以認定，該融合蛋白中含有SARS病毒N蛋白的C末端產物。
六、用Western鑑定融合蛋白的抗原性為了檢測該融合蛋白的抗原性，我們將純化後的融合蛋白經SDS分離後，Western轉到PVDF膜上，分別用兩份「非典」病人的血清作為「一抗」進行檢測，Western檢測試劑盒為Promega公司生產的NBT和BCIP。從圖5可見，兩份病人血清都可以檢測到融合蛋白，由此證明了我們體外表達的N蛋白C末端具有SARS病毒的抗原性。
七、用ELISA檢測融合蛋白的抗原性為進一步確認該融合蛋白的抗原性，並開發其實用價值，我們將融合蛋白包被在Elisa用的96孔板上，ELISA實驗程序1、設空白對照、陽性對照1孔、陰性對照2孔。其餘檢測孔加入樣品稀釋液，每孔100μl，再加入待測樣品10μl。充分混勻，貼上封口膠，置37□溫育30分鐘；2、將50倍濃縮洗板液用雙蒸水50倍稀釋後用於洗滌板孔。
3、棄去各孔中樣品，每孔加滿洗液，靜置數秒後棄去，重複5次，拍幹；4、除空白孔外，每孔加入酶標抗人IgG工作液100μl，貼上封口膠，置37□溫育20分鐘；5、棄去各孔中液體，用洗板液反覆洗滌5次，拍幹；6、每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，輕拍混勻，置37□避光溫育10分鐘；7、顯色完畢後，每孔加入終止液50μl，輕拍混勻，以空白孔調零，置酶標儀450nm波長下測定OD值(參考波長630nm)。
實驗結果如圖6，表明，非典病人的血清呈陽性反應，而正常血清呈陰性反應。胺基酸序列表110杭州華大基因研發中心120用酵母表達SARS病毒N蛋白的C末端肽段16052170PatentIn Version 3.1210121113212PRT213SARS-associated coronavirus(SARS-CoV)4001Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg1 5 10 15Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met Asp20 25 30Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser Ala Asp35 40 45Ser Thr Gln Ala50
權利要求
1.一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端(C端)肽段與GST的融合蛋白，其特徵在於具有Seq.No.1的序列的多肽。
2.一種SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的重組方法，其步驟為1)PCR擴增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)轉化酵母宿主細胞；3)誘導轉化後的酵母細胞進行蛋白質表達；4)回收純化與GST融合的重組蛋白。
3.根據權利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特徵在於所說的PCR擴增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆，其步驟為1)分離純化體外培養的病毒顆粒，提取病毒RNA，以此為模板反轉錄合成為cDNA後，通過PCR擴增獲得含N蛋白C端編碼區的產物。擴增N蛋白C末端所用的引物序列5』-AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3』5』-AATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3』2)PCR產物克隆到pGEM-T載體中，轉化大腸桿菌。3)以含該片段的質粒DNA為模板，利用含酵母表達載體序列的一對引物將目標片段再次用PCR擴增。含酵母表達載體序列的引物5』-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAAATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3』5』-GCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3』。
4.根據權利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特徵在於所說的轉化酵母宿主細胞，其步驟為1)分離，純化酵母表達載體pEGH，用限制性核酸內切酶HindIII和XbaI酶切後備用。2)轉化酵母細胞。混合pEGH質粒DNA和PCR產物，用PEG法轉化酵母細胞，轉化後的酵母細胞塗於SC-Ura-固體平板培養基，30度培養2天後，肉眼可見再生菌落。
5.根據權利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特徵在於所說的誘導轉化後的酵母細胞進行蛋白質表達是接種再生菌落到5ml SC-Ura/葡萄糖液體培養基中，30度振蕩培養過夜，取0.2ml過夜菌接種到50ml SC-Ura-/棉子糖培養基中，至OD600＝0.6-0.8後加入D-半乳糖(終濃度為2％)繼續振蕩培養4-5小時。離心收集培養物，無菌水洗2次。
6.根據權利要求2所述的一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白的方法，其特徵在於所說的回收純化與GST融合的重組蛋白是用裂解液重新懸浮酵母細胞，加入酸洗過的玻璃珠，劇烈振蕩3-5分鐘，離心後回收上清，再加入裂解液懸浮，振蕩，回收上清，合併兩次上清，高速離心去掉不溶物，將上清轉移到另一離心管中，加入GST樹脂，旋轉混合1小時，離心回收樹脂，用裂解液洗3次，再加入還原型穀胱苷肽(20mM)，旋轉混合1小時，離心回收上清，即為純化的重組蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種重組的SARS病毒N蛋白羧基端肽段與GST的融合蛋白及方法。融合蛋白具有Seq.No.1的序列的多肽。其方法步驟為1)PCR擴增獲得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)轉化酵母宿主細胞；3)誘導轉化後的酵母細胞進行蛋白質表達；4)回收純化與GST融合的重組蛋白。該融合蛋白與非典病人的血清呈陽性反應，而與正常人血清呈陰性反應。
文檔編號C12N15/81GK1468865SQ0312915
公開日2004年1月21日 申請日期2003年6月4日 優先權日2003年6月4日
發明者劉國振, 胡少暉, 胡詠武, 陳鵬, 殷劍寧, 方健秋, 文潔, 朱衡, 劉斯奇, 於軍, 汪建, 楊煥明 申請人:杭州華大基因研發中心