水稻三磷酸肌醇激酶基因的克隆及應用的製作方法

2023-09-20 03:07:40

專利名稱：水稻三磷酸肌醇激酶基因的克隆及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及水稻三磷酸肌醇激酶基因(CW屍3尺)的克隆，更具體的是利用 RT-PCR從水稻中克隆Os/屍化的全長核酸序列。本發明還涉及到ttf/屍I基因 的胺基酸序列、原核表達、酶活測定以及該基因在鹽逆境中的應用。
背景技術：
三磷酸肌醇激酶基因(/屍3/0已被證實廣泛存在於動物中，並發揮著重要的作 用。哺乳動物//^,參與調節了許多種生物學過程，包括大腦發育、記憶形成以 及學習過程等(Xia,H.J. ， Yang, G. (2005) Inositol 1, 4， 5-trisphosphate 3-kinasesL:functions and regulations. Cell Res. 15:83-91 )。過量表達果 蠅的能夠提高果蠅對HA的氧化耐受性(Monnier，V., Girardot, F.， Audin, W. Tricoire， H(2002). Control of oxidative stress resistance by IP:, kinase in / /Dscp/ i7a膨7a/7。卵5^ei". Free Radic Biol Med. 33:1250-1259)， 由此表明該基因與動物抗逆反應有關。而植物(擬南芥)和酵母中的三磷酸肌醇激酶基因還表現出多磷酸肌醇激酶 基因的特性。擬南芥的三磷酸肌醇激酶基因是植物細胞內調節磷酸肌醇 代謝的重要激酶基因，它所編碼的蛋白能將三磷酸肌醇(IP,)磷酸化為四磷酸 肌醇(IP》以及五磷酸肌醇(IP,) (Jill Stevenson-Paulik, Audrey R. Odom, and John D. York. (2003). Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. J. Biol. Chem. 277:42711—42718. Xia H-J， Brearley C， Elge S, et al. (2003). AraWo/wis inositol polyphosphate 6-/3-kinase is a nuclear protein that complements a yeast mutant lacking a functional ArgR-Mcml transcription complex. Plant Cell. 15: 449-463. ) 。 IP:,與I^是調節細胞C,平衡的重要信使分子，所以三磷酸肌醇激酶基因理應間接地參與調節植物細胞Ca"信號(Xia H-J, Brearley C， Elge S， et al. (2003). AraA/ob/xsis inositol polyphosphate 6-/3-kinase is a nuclear protein that complements a yeast mutant lacking a functional ArgR-Mcml transcription complex. Plant Cell; 15:449-463)。 植物首例三磷酸肌醇激酶基因是從擬南芥中克隆的(Jill Stevenson-Paulik， Audrey R. Odom， and John D. York. (2002).Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. J". Biol. Chem. 277:42711 - 42718)，其功能研究剛於近年被該專利的主要申報人 所報導，發現擬南芥三磷酸肌醇激酶基因具有轉錄調節作用，將擬南芥多磷酸肌 醇激酶基因轉入酵母IP3K (A^^/7屍A2V突變體，可以補償該突變體在精氨酸缺 陷時不能生長的表型(XiaH-J, Brearley C, Elge S, et al. (2003) Arabidopsis inositol polyphosphate 6-/3-kinase is a nuclear protein that complements a yeast mutant lacking a functional Arg-Mcml transcription complex, plant eel 1. 15:449-463)。最近也已證實擬南芥三磷酸肌醇激酶基因能通過與鈣離子相 關的途徑調節花粉管和根的生長(XuJ， BrearleyCA, Lin冊,etal (2005). A role of Arabidopsis inositol polyphosphate kinase Atlpk2a， in pollen germination and root growth. Plant Physiol. 137:94-103.)。水稻作為重要的糧食作物，在國民經濟中有著極其重要的戰略地位。同時， 水稻作為重要的模式植物，能夠為植物研究提供重要的生物學基本知 識。結合三磷酸肌醇激酶基因己知的功能，尤其是其在逆境中的作用，申請人 認為水稻三磷酸肌醇激酶基因(Os//^/0對於改良水稻及其它農作物具有十分 重要的價值。本申請專利的內容是首例對水稻中三磷酸肌醇激酶基因克隆及其功 能的研究。發明內容本發明的目的在於提供一種水稻三磷酸肌醇激酶基因的克隆、激酶的活性、 組織的表達、激素與逆境誘導的表達。該基因為改良水稻品質提供了一條技術途 徑。本發明還涉及一種水稻三磷酸肌醇激酶基因序列在磷酸肌醇代謝中的應用。本發明還涉及一種水稻三磷酸肌醇激酶基因序列在激素信號途徑中的應用。 本發明還涉及一種水稻三磷酸肌醇激酶基因序列在水稻營養生長和生殖生 長的應用。本發明還涉及一種水稻三磷酸肌醇激酶基因序列在改良水稻品種中的應用。 本發明還涉及一種水稻三磷酸肌醇激酶基因序列在提高酵母抗鹽中的應用。 為了實現上述目的，本發明採用了以下技術措施(i)水稻三磷酸激酶基因(os/p^o的克隆利用擬南芥//^/:基因序列(GenBank accession no:AJ245521)， 與GENBANK(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中水稻基因組序列比對，得到1個同源性最高的序列。根據所找到的序列設計引 物，通過RT-RCR方法克隆得到水稻/屍JK的cDNA片斷，分析表明該片段即是 我們需要的目的基因，其具有SEQ ID NO.l所示核苷酸序列。該基因由888bp 組成，編碼295個胺基酸，其具有SEQIDN0.2所示胺基酸序列。該蛋白為32 kDa，位於水稻的第二條染色體上，不含內含子。將該目的基因連接到載體 pGEM-T(Promega公司購買)上，所得的產物命名為pT-OsIP3K，其具有SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。水稻IP3K胺基酸序列與擬南芥、線蟲及酵母IP3K胺基酸 序列分別具有48%、 27%和25%的同源性。序列分析表明水稻0sIP3K含有在 動物和擬南芥IP3K中都存在的保守結構域PXXXDXKXG;但與擬南芥IP3K —樣， 0sIP3K缺少N-末端的鈣調蛋白結合結構域，而這個結構域在動物IP3K中普遍存 在。另外0sIP3K還具有擬南芥IP3K中所特有的4個保守區域。以上結果進一步 支持了所獲得的基因是水稻的三磷酸肌醇激酶基因。(2) 原核表達載體的構建用EcoRI和Pstl(限制性內切酶)酶切質粒pT-OsIP3K (本發明中構建)，連接到用同樣的酶切過的pMAL-c2(NEB公司)載體上，得到表達載體pMAL-c2-OsIP3K，其具有SEQ ID NO.l所示核苷酸序列。將 pMAL-c2-OsIP3K在大腸桿菌[XLl-Blue(NEB公司)]中表達可以獲得該蛋白(圖 3)，用於進一步分析。(3) 酶活分析誘導攜帶質粒pMAL-c2-OsIP3K的大腸桿菌XLl-Blue (其經 誘導，可表達SEQIDN0.2所示胺基酸序列)，並取其菌液進行酶催化活性實驗 和高效液相色譜實驗，檢測其反應底物和產物。發現OsIP3K可以催化l， 4， 5-三磷酸肌醇生成四磷酸肌醇，具有3和6位磷酸化活性。(圖4)說明OsIP3K具有雙重磷酸肌醇激酶活性。(4) 組織表達分析運用RT-PCR技術檢測了 CW戶3尺在水稻根、莖、葉、芽、 花序中的表達，發現水稻三磷酸肌醇激酶基因在以上組織中都有表達(圖5)。 說明該基因是一個組成型表達基因，暗示其可能在植物營養生長和生殖生長中具 有潛在作用。(5) 誘導表達分析在茉莉酸甲酉旨(MeJA)，葡萄糖(Glucose)，脫落酸(ABA)， 赤黴素(GA)，鹽(NaCl)處理下，發現水稻幼苗表達量在以上激素和逆境處理 下，Os/屍3A:的表達量均提高(圖6)，說明CW屍3尺可能參加了激素信號途徑和逆 境反應過程。(6) 轉基因載體的構建以pT-OsIP3K為模板，用含有(Kpnl， BamHI)(限 制性內切酶)的引物來擴增，得到一段約900bp的片斷。將該片斷和pCAMBIA1301(澳大利亞的哥侖比亞(CAMBIA )公司)分別用KpnI和Bamffl雙酶切，回 收產物，連接得到P1301-OsIP3K，其具有SEQIDNO.l所示核苷酸序列。並將 構建成功的P1301-OsIP3K轉入農桿菌EHA105(澳大利亞的哥倫比亞(CAMBIA ) 公司)。(7) 水稻愈傷組織的誘導與遺傳轉化成熟種子去殼，置於70%乙醇30秒， 轉移到0.1% HgCL中消毒10分鐘，無菌水洗5次。將消毒後的成熟胚接種到誘 導培養基上，暗培養3周(22-28°C)。切下愈傷組織，轉入預培養培養基上， 暗培養3天。挑取含有P1301- OsIP3K(本專利獲得，其具有SEQ IDNO.l所示 核苷酸序列)的農桿菌EHA105,置LB液體培養基(含卡那黴素(kan) 50mg/L), 28°C， 200轉/分(rpm)搖12小時。取出10-15 mL置新配製的LB培養基中， 搖至0D , =0. 5-0. 8， 6000 rpm離心10分鐘，沉澱用等體積的懸浮培養基中懸浮， 放置20分鐘。從預培養培養基中取出愈傷組織，放入浸染液中30分鐘。取出 愈傷組織，用滅菌濾紙吸去表面浸染液，轉入共培養培養基，暗培養三天。將愈 傷組織放入無菌水(含利福平(cef) 300-500mg/L)洗滌30分鐘，再用不含 cef的無菌水洗滌5—6次。篩選將愈傷組織放入篩選培養基，2-3周後，切下 新長出的愈傷組織到篩選培養基2-3周後，再放置到篩選培養基上，2周後轉入 分化培養基。在光照下經45天左右的分化，愈傷組織分化成綠色植株，然後將 幼小植株轉到生根培養基上，經15-20天的誘導，形成完整的植株，獲得轉基因植株，這些轉基因植株經PCR檢測，證明其為陽性轉基因植株，轉到試驗田繼 續生長，最後獲得成熟的種子，此為T1代種子。(8)酵母補償實驗構建pYES2-0sIP3K (本發明中構建)酵母表達載體， 轉入酵母^ ft^/T/^ 突變體中。發現在鹽逆境下轉基因酵母的抗鹽性提高 20-30%，見圖11。本發明的優點對水稻三磷酸肌醇激酶基因(6^//>^0的克隆，有利於植 物磷酸肌醇信號傳導途徑及機理的研究，同時由於三磷酸肌醇激酶基因已在果 蠅、擬南芥中表現了在逆境和生長等方面的重要功能，因此可利用水稻三磷酸肌 醇激酶基因提高水稻對逆境脅迫的抵抗能力，有望改良作物品質。


圖1:菌落PCR檢測。M為marker (DL2000) , 1-8分別為挑取的8個抗性克隆。圖2:酶切檢測。M為marker (DL2000), 2、 4、 6對應圖1中相應編號的 三個克隆。圖3: 10%聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。M為標準蛋白分子量，1， 2為攜帶空載 體pMAL-c2的XL1-Blue菌株產物的電泳帶，3—6為攜帶載體pMAL-c2—OsIP3K 的XL1-Blue菌株產物的電泳帶，其中l、 3、 5為未經IPTG誘導的菌株產物的 電泳帶；2、 4、 6為IPTG誘導的菌株產物的電泳帶。圖4:高效液相色譜(HPLC)檢測OsIP3K的酶活性。A為反相液相色譜檢 測酶活反應產物；B為陰離子交換液相色譜進一步檢測該酶的磷酸化位點。圖5:RT-PCR檢測Q"屍3/C基因在水稻組織中的表達。M為marker(DL2000)，P:花序，B:芽，L:葉，S:莖，R:根。圖6: RT-PCR檢測CW/^夂基因在激素和逆境處理下的表達。其中C4和C24 為0小時和24小時未處理材料的表達量。4， 8， 12， 24分別為激素或逆境處理 4小時，8小時，12小時，24小時的苗的表達量。圖7:酶切檢測P1301-OsIP3K。
1為Kpnl和BamHI雙酶切，2為Sail單酶切檢測。圖8:水稻轉化流程圖。從左到右，分別為愈傷寄代，篩選，分化和生根。圖9:轉基因水稻PCR鑑定。 一為陰性對照，十為陽性對照，1一15分別為 15個轉基因株系。圖10:酶切檢測pYES2-OsIP3K。 M為marker (DL2000) , pYES2-0sIP3K 為構建質粒用Kpnl和BamHI酶切的圖。圖ll:酵母抗鹽點滴實驗。CK為未經鹽處理的對照，WT為酵母野生型菌 株，ip^2為酵母/l/ 6"《iV7屍A^突變體，！》^+ Vector為己轉化了 pYES2空載體的 酵母^ 6^2///￥2突變體，pYES2-0sIP3K為己轉化了 pYES2-0sIP3K載體 的酵母/!/ 6"6^/7屍A^突變體。
具體實施方式
實施例l. Oy/i^/:基因的克隆為了得至U 基因的全長序列，我們利用BLAST(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索軟體將擬南芥三磷酸肌醇激酶基因 (GenBank accession no:AJ245521)的序列與水稻基因組序列進行比對，找出一 個與其同源性最高的序列，推測該序列為水稻三磷酸肌醇激酶基因序列。根據該 基因設計特異引物， [正向 引物 (5' -GATCGAATTCATGGCCTCCGACCTGCGCCCG-3 ')，反向弓l物 (5'隱GTACTCTAGATCAAGAATGATCTGAAGACGCCT-3，)]，並以粳稻中 花ll (湖北省農科院保存)的葉片為材料，通過RT-PCR獲得cDNA片斷，將PCR 所得目的基因片段連接到載體pGEM-T(Promega公司購買)上,所得的產物命名為 pT-OsIP3K，其具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。該基因定位於水稻第2號染色體，由888bp組成，編碼295個胺基酸，其 具有SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列，不含內含子。水稻IP3K胺基酸序列與擬 南芥、線蟲及酵母IP3K胺基酸序列分別具有48%、 27%和25%的同源性。用 clustalw程序(http:〃bioinfo. biosino. org:6000/)進行胺基酸序列分析發現 0sIP3K含有在動物和擬南芥IP3K中都存在的保守結構域PXXXDXKXG;但與擬 南芥IP3K—樣，缺少N-末端鈣調蛋白結合結構域，而這個位點在動物IP3K中 普遍存在。另外0sIP3K蛋白還具有在擬南芥IP3K中所特有的4個保守區域。實施例2.原核表達載體的構建 首先用EcoRI和Pstl酶切質粒pT-OsIP3K (實施例1中獲得)，將得到的片段 連接到用同樣的酶切過的pMAL-c2(NEB公司)載體上，得到表達載體 pMAL-c2-OsIP3K，並轉化大腸桿菌XLl-Blue(NEB公司)，將菌液塗於含氨苄的 LB (蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L， NaC15g/L)平板上37'C生長過夜，挑選 8個單菌落。以OsPr: 5， -TCAAGAATGATCTGAAGACG-3 ， ， OsPm: 5' -GGCGCCCGGACCGGTCGG-3'為引物作菌落PCR檢測，發現1-7號菌 落均擴出約400bp的帶(圖1)。選取其中的2,4,6號菌落提取質粒，用Sail酶切獲 得約為700bp的帶(圖2)，結果與目的片段大小一致。酶切結果表明 pMAL-c2-OsIP3K (其具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列)重組質粒構建成功。實施例3. Maltose Binding Protein-OsIP3K (MBP-OsIP3K)融合蛋白在大腸 桿菌中的表達選取實施例2中2號和4號兩個驗證過的陽性克隆接種於LB培養基中活化 過夜，然後分別轉接到新鮮的LB液體培養基中，待培養至OD6oo約為0.5時， 將不含IPTG (對照)和加入IPTG誘導的菌液共同培養4小時後分別取lml對 照和誘導處理的菌液，離心收集細胞。細胞被裂解後，用10%的聚丙烯醯胺凝膠 電泳分離目的蛋白，用考馬斯亮藍染色(圖3),其中pMAL-c2空載體本身具有 標籤蛋白麥芽糖結合蛋白的核苷酸序列，經過誘導可以獲得約42KDa的麥芽糖 結合蛋白(MBP)，含pMAL-c2-OsIP3K的大腸桿菌XLl-Blue經誘導，可表達 融合蛋白MBP-OsIP3K，約為74KDa，與預測該基因的融合蛋白分子量大小一致。實施例4. OsIP3K激酶的酶活測定將含有pMAL-c2-OsIP3K的XL1-Blue菌株(實施例2中獲得)和0.4 ATP 分別與40 一的Ins(l，4,5)P3 (△)、 Ins(3，4,6)P3 ( )、(兩種三磷酸肌醇) Ins(3，4，5，6)P4 (o)(一種四磷酸肌醇)在3(TC下溫浴2小時。利用反向樹脂分離 技術分離各組分。通過放射性檢測可得到一個峰(圖4-A)，其對應的產物為IP4。 將以上催化Ins(l，4，5)P3反應所得IP4產物，與用卩H]標記的fH]Ins(l，3，4,5)P4和 Ins(l，4，5,6)P4的異構體fH]Ins(3，4，5，6)屍4作為洗脫對照， 一起通過陰離子交換柱。根據洗脫時間，確定其磷酸化位點。催化反應的一個產物與^H]Ins(l,3，4,5)P4在 同一時間達到峰值(53分鐘)，而另一產物與卩H]Ins(3，4，5,6)P4在55.5分鐘達到 峰值，可見催化反應可以得到兩個產物，分別是Ins(l，3,4,5)P4和Ins(l,4，5，6)P4(圖 4-B)。由此可表明我們分離所得到的(9W屍M基因具有將Ins(l,4，5)P3催化到 Ins(l,3，4，5)P4和Ins(l，4，5，6)P4的活性，也就是說該酶具有3、 6位磷酸化活性。 此實驗證明Qs/Z^/:基因確實編碼水稻三磷酸肌醇激酶，並且該酶具有雙重酶活 性。實施例5. C^/屍3尺基因的組織表達分別選取水稻根、莖、葉、芽、花序五個組織的材料，提取RNA,通過RT-PCR 的方法檢測Os/屍3《基因的表達情況，發現OW/^尺基因在根、莖、葉、芽、花序中均有表達，暗示cw戶j/:可能在植物營養生長和生殖生長中具有潛在作用(圖5)。實施例6. Os/Z^K基因與逆境和激素的關係將萌發兩周的水稻分別用100 nM茉莉酸甲酯(MeJA)， 40 mM葡萄糖 (Glucose), 50 脫落酸(ABA), 100 一赤黴素(GA),和250 mM鹽(NaCl) 處理，選取處理了4， 8， 12， 24小時的幼苗提取RNA，通過RT-PCR的方法檢 測Os/屍3A:基因的表達量。發現在以上激素和逆境處理下,Os/P3/:的表達量均有 提高(圖6)，說明C^/P3K基因可能參與了激素信號途徑和逆境反應。實施例7.水稻三磷酸肌醇激酶基因正義表達載體的構建 以PT-OsIP3K(實施例1獲得)為模板，用正向引物(5'-GGGTACCATGGCCTCCGACCTGCGCCCG陽3')， 反向引物(5'-CGCGGATCCGCGAGAATGATCTGMGACGCCT -3')來擴增(該引物含有 Kpnl和BamHI的酶切位點)，得到一段約900bp的片斷。將該片斷和pCAMBIA1301 分別用Kpnl和BamHI雙酶切，回收產物，連接得到P1301 -OsIP3K，其具有 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。連接產物用Kpnl和BamHI雙酶切以及Sail單 酶切鑑定(圖7)，分別得到約卯0bp和700bp的帶，證明構建成功。並利用凍融法轉化農桿菌EHA105 (Holsters M, Depicker A, Depicker A，(1978 ) . Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens. Molecular and General Genetics , 183 : 181-187.)實施例8.水稻轉化及轉基因植株的獲得1) 種子的消毒成熟種子去殼，置於7(W乙醇30秒，轉入O. 1% HgCl消毒 10分鐘，無菌水洗5次2) 接種將消毒後的成熟胚接種到誘導培養基上，暗培養3周(22-28°C)。3) 預培養切下愈傷組織，轉入預培養培養基上，暗培養3天。4) 浸染液製備挑取單克隆農桿菌EHA105 (P1301-OsIP3K,其具有SEQID N0. l所示的核苷酸序列)。接種於LB液體培養基(含kan 50mg/L)， 28°C， 200 rpm搖12小時。取出10-15 mL置新配製的LB培養基中，搖至0D柳,二0. 5-0. 8， 6000 rpm離心10分鐘，將沉澱懸浮，放置20分鐘。5) 浸染從預培養培養基中取出愈傷組織，放入浸染液中30分鐘。取出 愈傷組織，用滅菌濾紙上吸去表面浸染液，轉入共培養培養基，暗培養三天。6) 洗滌愈傷組織放入無菌水(含cef 300-500mg/L)洗滌30分鐘，再 用不含cef的無菌水洗滌5—6次。7) 篩選愈傷組織放置到篩選培養基，2-3周後，切下新長出的愈傷組織 到新的篩選培養基2-3周後，再放置到新的篩選培養基上，2周後，接著放入篩 選培養基篩選2-3周。8) 分化在光照下經45天左右的分化，愈傷組織分化成綠色植株9) 生根然後將幼小植株轉到生根培養基上，經15-20天的誘導，形成完 整的植株，獲得轉基因植株。圖8誘導培養基N6 培養基+2, 4-D(2mg/L)+sucrose(30g/L)+casamino acid (300mg/L) ， pH5. 8+agar (8g/L)，分裝滅菌。預培養培養基N6培養基+2，4-D(2mg/L)十sucrose (30g/L)十glucose (10 g/L)， pH 5. 2，十agar (8 g/L)。滅菌後+AS (20 mg/L， 100% EtOH溶解)共培養培養基N6培養基+2， 4-D(2mg/L)十sucrose(30 g/L) +glucose (10 g/L)' pH 5. 2,+agar(8 g/L)。滅菌後+AS (20 mg/L, 100% EtOH溶解)篩選培養基N6培養基+2, 4-D(2 mg/L)+sucrose(30 g/L)+casamino acid(300 mg/L)，pH 5. 8+agar(8 g/L),Hym(20 mg/ml)生根培養基MS+casamino acid(500 mg/L)+6-BA(l.2 mg/L)+NAA (0.2 mg/L)， pH 5.8. +sorbitol(5 g/L)。實施例9.轉基因植株的鑑定將獲得的轉基因苗移栽至土中，生長一個月，單株收取葉片，提取葉片DNA, 用正向引物(5， -GCCGTGCACTTGTTTGTCGGG-3')和反向引物 (5'陽GTACTCTAGATCAAGAATGATCTGAAGACGCCT-3，)來進行PCR檢 測，可以擴增出帶的產物所對應的植株為陽性轉基因植株，並能表達SEQ ID NO. 2 所示的胺基酸序列(圖9)。實施例IO.酵母表達載體的構建首先用質粒pT-OsIP3K (實施例1中獲得)為模板，用JE向引物 (3' -GGTCGGTACCATGGCCTCCGACCTGCGCC -3')禾卩反向弓l物 (5' -CGGGATCCCGTCMGAATGATCTGMGACGCCT-3')進行PCR擴增， 將PCR所得的片斷用限制性內切酶Kpnl和BamHI雙酶切，並將其連接到同樣的 酶酶切的載體pYES2 (Invitrogen公司購買)上，所得的產物命名為 pYES2-OsIP3K,它具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，表達SEQ ID NO. 1所 示的胺基酸序列。並將其轉入大腸桿菌XLl-Blue(NEB公司)中。提取質粒，用 Kpnl和BamHI酶切鑑定(圖10)。可以獲得一條約為900bp的帶，證明構建成功。 然後將pYES2及pYES2-OsIP3K轉化到酵母突變體中[購買於 EUROSCARF (http:〃www. rz. uni-frankfurt. de/FB/fbl6/mikro/euroscarf)]。實施例11.水稻三磷酸肌醇激酶基因提高酵母的抗鹽性挑取實施例10提到的四種酵母菌[野生型菌株(購買於EUROSCARF)、酵母 ^^6"i/J月^突變體、以及實施例10中得到的轉化了 pYES2空載體和 pYES2-OsIP3K的突變體]，接種於含2%半乳糖的complete minimal培養基 (Jill Stevenson—Paulik, Audrey R. Odom， and John D. York. (2002) Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. J. Biol. Chem. 277: 42711 - 42718)中活 化2天。調整菌株濃度至OD6004.0。將它們分別10倍連續稀釋(濃度分別為 100， 10"， l(T2， l(T3， 1(T4)。並各取lul分別點樣於有0M (CK)， 0.6M禾卩0.8M NaCl的的complete minimal培養基(以2%半乳糖作為炭源)上。結果表明， 轉化pYES2-OsIP3K載體的酵母抗鹽能力明顯的高於突變體和含有空載體的突變 體菌株20-30% (見圖11)。SEQUENCE LISTING<110〉武漢大學〈120〉水稻三磷酸肌醇激,基因的克隆及應用 〈130〉水稻三磷酸肌醇激酶基因的克隆及應用 2<170〉 Patentln version 3. 1 1 888<212〉 腿<213〉 0ryza sativa 1alggcctccgacctgcgcccgccggagcaccaggtggcggggcaccgcgcgtccgccgac60肌gctgggcccgctcgtcgacggcgaggggctcttctacaagcccctccaggccgggga^g120cgcggggagcacgaggccgccttctacgccgcgttcaccgcgcacccggccgtcccgccc180cgggtccggggcgccttcttcccgcgcttccacggcacccgcttcctcccggccccagcc240agccccggcggcgcgccctacccgcacatcgtcctcgacgacctcctcgcgggcctcccg300tccccctgcgtcgccgacgtcaagatcggcgcctgca_cgtggccgccgcgatccccggac360ccctacgtcgccaagtgcctcgccMggaccgcgagaccaccagcgcgctcctcggcttc420cgcgtctccggcgtccgggtggtcgatgcccggggcggcgccgtgtggcgccc卿ccgg480tCggagCtg6Lcgccgccggggtccgccgcgtgctccgccgctacgtgtcc540scgggcggcggcgacggcctggsctgcgcgctcgccgccgCggtgt3Cggaggggagggc600ggcgtcctggcgcagctgcgggagctcaaggcgtggttcgaggagcaaaccctgtaccac660ttctactcggcgtcgattctgttcggctacgacgcc;aatgcggcggcggcggctgctccc720ggaggtgg犯gcggcggtgtctggtggacttcgcgcatgtcgacgatggg780g3Cggggtg3ttgaccacaacttcttgggcgggctctgctcgctcatcaagttcatcggc840gacattgtcgccgaggttaccg卿鄉cgtcttcagatcattcttga888 2 295〈212> PRT Oryza sativaeu 275 SerGlyPro 100 ProGluValLysSer 180 TyrTrpPheSerGly 260 lieSerAla85SerArgThrAspGly 165 ThrGlyPheGlyGly 245 AspLysAspPhe70ProProSerThrAla 150 lieGlyGlyGluTyr 230 GlyGlyPheHisHisTyrCysProSer 135 ArgAspGlyGluGlu 215 AspValVallieSer 295Gly Thr Arg Pro ValPhe Leu Pro 75Val Leu AspAsp 120 AlaGlyAlaGlyGly 200 GinAlaArglieGly 280His lie 90Ala Asp Val Lys lie 105Pro TyrVsl Ala Lys 125Gly Phe Arg 140Val Trp Arg 155Val Arg Arg Leu Asp CysLeu LeuGly AlaAla Gly 170 Asp Gly 185Gly Val Leu Ala Gin 205Thr Leu Tyr His Phe 220Asn Ala Ala Ala Ala 235Val Lys Leu Val Asp 250Asp His Asn Phe Leu 265Asp lie Val Ala Glu 285AlaAspGly 110CysValProValAla 190 LeuTyrAlaPheGly 270 ValPro Ala80 Leu Leu 95Ala CysLeu AlaSer GlyAsp Arg 160 Leu Arg 175Leu AlaArg GluSer AlaAla Pro 240 Ala His255Gly Leu Thr Glu
權利要求
1. 一種水稻三磷酸肌醇激酶基因的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2、 一種水稻三磷酸肌醇激酶的胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO. 2所示 的胺基酸序列。
3、 一種水稻三磷酸肌醇激酶基因在酵母抗鹽中的應用。
4、 一種水稻三磷酸肌醇激酵基因在改良水稻品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種水稻三磷酸肌醇激酶基因的克隆及其應用。通過RT-PCR技術從水稻中克隆得到三磷酸肌醇激酶基因(OsIP3K)的全長核酸序列。該基因在大腸桿菌中經IPTG誘導，獲得高表達的蛋白。經HPLC分析發現該蛋白能在3位和6位磷酸化三磷酸肌醇到四磷酸肌醇，具有雙重酶活性。此外，還報導了該基因在營養生長、生殖生長、激素反應和酵母抗鹽中的應用。
文檔編號C12N15/82GK101230354SQ200710051350
公開日2008年7月30日 申請日期2007年1月24日 優先權日2007年1月24日
發明者婷 周, 夏惠君 申請人:武漢大學