防治多種細菌性病害的生防菌株4at8的製作方法
2023-10-30 23:40:32 4
專利名稱：防治多種細菌性病害的生防菌株4at8的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，屬於農作物防病治病領域，專用於蔬果類多種細菌性病害的無公害防治。背景技術：
細菌性病害是不同於真菌性病害的另一類植物病害，在溫室蔬菜作物上發生極為普遍。而且幾乎全為土傳性病害，在防治上應嚴格實行土傳病害的綜合防治措施。但是，又不同於土傳真菌性病害，植株一旦染病，多是整株感染，且病情發展迅速，會很快死亡。在茄科植物上通常發生的有番茄青枯病，番茄潰瘍病、番茄軟腐病、番茄瘡痂病、辣(甜椒)青枯病、辣(甜椒)軟腐病、辣(甜椒)瘡痂病、茄子青枯病等；黃瓜的細菌性果斑病等是瓜果類作物上較常發現的一類病害；水稻白葉枯、水稻細菌性條斑病等也是影響糧食產量質量的重要病害。屬於世界性病害之一的茄科作物青枯病，是由Wh/ ⑶ari 引起的細菌性枯萎病，該病多在結果期開始發病，發病初期白天萎蔫，夜晚恢復，2 — 3天後，不再恢復，枯萎死亡，但植株仍保持綠色；發病植株的莖基部維管束變褐，用手擠壓，有乳白色粘液滲出。該病菌可危害50多科300多種植物。一般以番茄、馬鈴薯、芝麻、花生、大豆、辣椒等茄科蔬菜以及菸草、香蕉等經濟作物受害較重。隨著新寄主的發現，以及氣溫轉暖等因素， 青枯病發生越來越普遍，並且日趨嚴重，每年在全球範圍內造成的經濟損失不少於120億兀。番茄潰瘍病也是比較常見的細菌病害之一，多為整株染病，發病初期植株下部葉片向上縱卷，凋萎下垂，部分植株出現萎蔫現象，發病後期，病葉葉緣枯黃，葉脈間變黃，全葉變褐枯萎，但不脫落；而且會導致莖部出現狹長條斑，後期病斑開裂；還會產生大量氣生根，莖幹髓部中空腐爛，散發出臭味，嚴重時植株枯死。番茄潰瘍病是一種毀滅性病害，自 1985年在北京市發現後，已相繼在內蒙古、山西、河北、黑龍江、吉林、遼寧等省、自治區發生為害。嚴重發病的地塊番茄減產達25% — 75%。我國已將其列為檢疫對象以防止和控制病害的發生蔓延。瓜果類的細菌性角斑病也是溫室棚栽條件下發病比較嚴重的病害之一，該病菌為假單胞菌，在大棚和露地黃瓜的整個生育期均可發生。主要危害葉片，也危害莖蔓和果實。 葉片受害時，葉正面病斑淡褐色，背面受葉脈限制呈多角形，表面可見乳白色菌膿；果實上的病斑可向內擴展，蔓延至種子。在大棚和露地，發病都比較嚴重，在3(Γ50%之間，嚴重時可達100%。嚴重危害水稻的水稻白葉枯是由黃單胞菌屬引起的細菌性病害。植物初期葉尖及邊緣有黃綠色斑點，之後沿葉脈形成蒼白色、黃褐色長條斑，最後變灰白色而枯死。發病株容易倒伏，會嚴重影響稻穗結實率。一般會使水稻減產20 30%，嚴重時可達50飛0%。。目前，對於細菌性病害，在化學防治上，長期以來，多用農用鏈黴素、可殺得、甲霜銅、DTM等。但是由於長期使用此類藥品，多數細菌性病害已經對其產生了很強的抗藥性， 再用這類藥品進行防治，效果差，已經難以控制病菌危害與發展。同時，細菌性病害，多為土傳病害，具有寄主範圍廣，抗逆性強，難以防治等特點，在生產中，缺乏有效的化學農藥進行防治，而且化學農藥會汙染水、土壤等，破壞土壤結構，影響生態環境；直接危害非靶標的微生物，對人畜極不安全，這些因素都使得化學農藥的使用得到嚴重的限制。因此，非化學性防治措施目前已成為防治細菌性病害的核心，而生物防治則是其中最有前途的方法。現有技術中按照本實驗室的菌體保藏液方法，菌體可室溫保存2 3年。
發明內容
技術問題本發明的目的是針對當前防治植物多種細菌性病害使用化學農藥汙染嚴重，使用成本過高，並且現有技術中沒有對多種細菌性病害同時具有較高防效的生防製劑等問題，提供一種防治多種細菌性病害的單一生防菌菌株及製劑，該菌劑的防效在60%以上。技術方案
一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，螢光假單胞菌(作洲而膨/？浙 /Azore1S⑶/^)，2010年5月13日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 3834。地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。生防菌株4AT8用於製備生防菌劑的方法，
1)將該菌株接種到LB培養液中30°C培養ISOrpm振蕩培養，12 16小時後在超淨工作檯中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；
2)當培養至OD值在0.5 0.8之間時，將種子菌液以1:100體積比加入LB培養液中，30°C 250rpm振蕩培養20 24小時。然後4000rpm離心IOmin,每IOOOml培養液獲得 13 16g溼菌，每克溼菌含4X 101° IO15個菌體。取溼菌與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1012cfu/mlo其中，種子培養LB培養液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白腖10g/L，酵母浸粉5g/L， 調節PH值為7. 0 ；菌體保藏液為0. 01mol/L磷酸鹽緩衝液，還含有濃度為0. 001mol/L的 Tween20o所述生防菌劑可以用於防治茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害。有益效果
本發明的優點和積極效果表現在本發明是專門針對茄科植物的青枯病、番茄潰瘍病、 黃瓜細菌性果斑病、水稻白葉枯等多種細菌性病害開發的生防製劑。由於是生物製劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利於蔬果類及水稻等農作物的無公害生產，農民可以不用或減少其他化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利於相關產品的出口貿易。生防菌4AT8菌體和上清在平板拮抗試驗中顯示對番茄青枯病、番茄潰瘍病、黃瓜細菌性條斑病、水稻白葉枯病原菌有較好的抑制作用；溫室試驗表明，該菌劑對番茄青枯病、番茄潰瘍病、黃瓜細菌性條斑病、水稻白葉枯病均有顯著的防治效果；溫室大棚試驗表明，該菌劑對番茄青枯病、番茄潰瘍病、黃瓜細菌性條斑病、水稻白葉枯病具有較好的防效， 防效在60 75%。該菌劑用溼菌與本實驗室的菌體保藏液按1 :40(g/ml)配成菌劑，可室溫保存2 3年。該菌劑除了可以再移栽時灌根使用外，還可以在移栽前與有機肥混合製成堆肥，然後隨肥料在整地過程中埋到土壤中使用。四
圖1生防螢光假單胞菌4AT8菌體和發酵上清對青枯病病原菌的拮抗結果； 圖2生防螢光假單胞菌4AT8菌體和發酵上清對番茄潰瘍病病原菌的拮抗結果； 圖3生防螢光假單胞菌4AT8菌體和發酵上清對水稻白葉枯病原菌的拮抗結果。五
具體實施例方式
一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，螢光假單胞菌(作洲而膨/？浙 fluorescens),從河北小麥根圍土中分離得到。生防菌株4AT8用於製備生防菌劑的方法，
1)將該菌株接種到LB培養液中30°C培養ISOrpm振蕩培養，12 16小時後在超淨工作檯中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；
2)當培養至OD值在0.5 0. 8之間時，將種子菌液以1 :100體積比加入LB培養液中， 300C 250rpm振蕩培養20 M小時，。然後4000rpm離心lOmin，每IOOOml培養液獲得 13 16g溼菌，每克溼菌含4X 101° IO15個菌體。取溼菌與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 IX 1012CfU/ml。其中，種子培養LB培養液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白腖10g/L，酵母浸粉5g/L，調節pH值為7. 0 ；菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩衝液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20。上述生防菌劑用於防治茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害。實施方法(1)螢光假單胞菌4AT8菌體和上清平板拮抗試驗
選擇供試病原菌番茄青枯菌 ZJ3721 (Malstonia solanacearum, JG Li et al.，2010， Popff of Ralstonia solanacearum, a new two-domain harpin targeting the plant cell wall)、番茄潰瘍ACCC 01233 iClavibacter組義力/識/？日/？從，購買於中國農業微生物菌種保藏中心)、白葉枯ACCC 03530 {Xanthomonas orj^ae，購買於中國農業微生物菌種保藏中心)。將病原菌番茄潰瘍菌、白葉枯在NA培養液(牛肉浸膏3g/L，蛋白腖5g/L，酵母粉 lg/L，蔗糖10g/L，pH=7. 0)，將病原菌番茄青枯菌在YGPA (葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L， 蛋白腖5g/L,，pH=7. 0)中培養16-24 h至CFU為108/ml)，加入熔化冷卻至40°C左右的相應固體培養基中，體積比1:200，再1:200加入10%TTC (氯化三苯四氮唑)染料。將培養基每20mL倒入9 cm直徑的平板中。待冷卻凝固後，牙籤接種生防菌4AT8或打孔加入4AT8 生防菌發酵上清lOOul。24 h後記錄抑菌圈環徑。(2)溫室試驗中，培養基質中播種番茄，黃瓜，待番茄、黃瓜長至4葉期，選長勢一致的植株移栽到塑料杯中進行試驗。將4AT8菌劑稀釋濃度至lxl08CFU/ml後灌根使用，7 天后，將病原菌稀釋濃度為lxl07CFU/ml灌根使用，其中黃瓜細菌性角斑病使用發病田塊的土壤。(3)溫室大棚試驗
田間試驗共設三個處理A、生防菌劑4AT8 ；B、化學藥劑(70%農用鏈黴素SP1000倍液和25%葉枯寧400倍液);C、空白對照。每個小區16m2，小區間設三行隔離區，各處理按完全隨機區組排列，重複4次，全試驗共12個小區。試驗前按試驗方案分好小區，開好隔離溝，每畝使用量為1000毫升109CFU/ml的生防菌劑4AT8。分別統計各種病害的病害嚴重度，並且計算防效。試驗結果
(1)生防菌4AT8拮抗病原菌試驗結果生防螢光假單胞菌4AT8菌體和發酵上清對青枯病(圖1)、潰瘍病(圖2)以及水稻白葉枯(圖3)顯示較好的平板抑制效果。(2)溫室試驗表明，生防菌4AT8在溫室內對青枯病(表1 )、潰瘍病(表2)以及黃瓜細菌性角斑病(表3)的防效在80%以上，對病原菌起到了很好的控制作用。(3)田間試驗表明，生防菌4AT8對生防菌4AT8在溫室內對青枯病(表4)、潰瘍病 (表5)、黃瓜細菌性角斑病(表6)以及水稻白葉枯(表7)都有較好的抗病效果。表1 生防菌劑4AT8對番茄青枯病的溫室防治效果
權利要求
1.一種防治多種生防細菌性病害的生防菌株4AT8，是螢光假單胞菌(作洲而膨/？浙 /Azore1S⑶/^)，2010年5月13日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 3834。
2.用權利要求1所述生防菌株4AT8製備的生防菌劑。
3.權利要求2所述生防菌劑在防治茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害中的應用。
4.權利要求2所述生防菌劑的製備方法，包括1)將權利要求1所述生防菌株4AT8接種到LB培養液中30°C培養ISOrpm振蕩培養， 12 16小時後在超淨工作檯中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；2)當培養至OD值在0.5 0. 8之間時，將種子菌液以1 :100體積比加入LB培養液中， 300C 250rpm振蕩培養20 M小時，然後4000rpm離心lOmin，每IOOOml培養液獲得13 16g溼菌，每克溼菌含4X 101° IO15個菌體，取溼菌與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌劑， 成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1012cfu/mlo
5.根據權利要求4所述的的方法，其中，種子培養LB培養液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白腖10g/L，酵母浸粉5g/L，調節pH值為 7.0 ；菌體保藏液為0. 01mol/L磷酸鹽緩衝液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20。
6.根據權利要求4所述的方法，其主要特徵在於，所用LB培養液配置方法為氯化鈉 10g/L,胰蛋白腖10g/L，酵母浸粉5g/L，調節pH值為7.0。
全文摘要
本發明涉及一種防治多種細菌性病害的生防菌株4AT8，屬於植物保護技術領域。該菌是螢光假單胞菌，將該菌接種於本實驗室研發的培養液中，30℃250rpm發酵20～24小時，然後6000rpm離心10min，取溼菌與菌體保藏液按140(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012cfu/ml。對茄科作物青枯病、潰瘍病、瓜果類細菌性角斑病、水稻白葉枯等細菌性病害的田間防效在60-75%，同時該菌劑還有改善土壤微環境等作用。
文檔編號A01N63/02GK102154157SQ20101060866
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者嚴芳, 楊明明, 郭堅華, 陳雲 申請人:南京農業大學