人活性蛋白c及其製備方法
2023-09-19 11:57:35 2
專利名稱：人活性蛋白c及其製備方法
技術領域：
本發明涉及用凝血酶或相當的蛋白酶活化人蛋白C，來製備的一種高比活度的人活性蛋白C製劑，上述蛋白C從血漿中取得或通過遺傳重組技術製得。本發明進一步涉及一種活化人蛋白C的方法和高純度下純化人活性蛋白C的方法。
背景技術：
蛋白C(此後也縮寫成「PC」)是一種在肝裡合成的、維生素K依賴性蛋白，而且是一種酶前體，分子量為62,000，由兩條鏈組成L鏈(分子量21,000)和H鏈(分子量41,000)。在人體內，用凝血酶-thrombomodulin複合體使蛋白C部分降解，與thrombomodulin接合的凝血酶存在於血管內皮細胞的膜表面上，因此，由H鏈的氨基末端釋放出包含12個胺基酸的肽，形成活性蛋白C(此後也縮寫成「APC」)。APC是一種絲氨酸蛋白酶，通過凝血因子V和VIII(主要活性形式是Va和VIIIa)的特殊降解作用和脫活化作用而顯示出很強的抗凝結劑活性，並且促進血管壁釋放胞漿素原活化質而加速纖維蛋白系統。因此，APC預期用作治療劑。
APC在本領域中是眾所周知的，並且包括那些在體外用凝血酶或凝血酶-thrombomodulin複合體活化蛋白C所得到的APC，所述蛋白C從血漿中取得或通過基因重組技術製得(Blood，63，p.115-121(1984)；J.Clin.Invest.，64，p.761-769(1979)；J.Clin.Invest.，79，p.918-925(1987))；或者是由基因重組技術直接表達為APC的那些(日本專利首次公開號(Kokai)No.61-205487，日本專利首次公開號(Kokai)No.1-2338和日本專利首次公開號(Kokai)No.1-85084)，以及諸如此類。
但是，為了製備APC，尤其在由血漿分餾製得蛋白C，然後使之活化以製得所需蛋白的情況下，為有效脫除物化性質與APC十分相似的雜質蛋白，得到所需高比活度的高純APC，需要克服各種困難。例如，從蛋白C有效活化到APC，然後脫除活化劑，以及純化APC時，還存在許多需要解決的問題。
活化蛋白C的已知方法包括例如，用胰蛋白酶，RVV-X，凝血酶，凝血酶-thrombomodulin活化；用凝膠活化，其中RVV-X固定為瓊脂糖；用凝膠活化，其中凝血酶-thrombomodulin複合體被固定，以及諸如此類(J.Biol.Chem.，251，3052-3056(1976)；Biochemistry，15，4893-4900(1976)；Biochemistry，16，5824-5831(1977)；J.Clin.Invest.，64，761-769(1977)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，94，340-347(1980)；J.Clin.Invest.，77，416-425(1986))。
但是，就工業規模製備APC而言，上述方法不盡如人意。因為活化大量的蛋白C，最好是用少量的活化劑活化高濃度的蛋白C。上述方法也不能滿足此需要。
關於蛋白C活化後，活性蛋白C的純化，已知一種方法，其中，用SP-葡聚糖凝膠色譜法，在洗脫液中得到APC，因此，在蛋白C活化過程中添加的凝血酶則被吸收除去(biochemistry，16，5824-5831(1977)；J.Clin.Invest.，64，761-769(1979)；J.Biol.Chem.，251，3052-3056(1976)；Biochemistry，20，2156-2161(1981))。但是，用陽離子交換劑難於脫除蛋白C活化時添加的凝血酶到臨床適用水平。實際上，陽離子交換處理後，APC的濃縮步驟是必不可少的，因此，在APC的濃縮過程中，APC的自溶作用是不可避免的。因而目前尚無法製備高純度、高生物活性、又不含各種雜質蛋白的APC。
發明內容
本發明是為了解決上述問題。本發明者經過刻苦鑽研，終於發現能用少量的凝血酶和高濃蛋白C，能有效地活化蛋白C；通過把活化後的含活性蛋白C的溶液與陽離子交換劑接觸，因而凝血酶或相當的蛋白酶和活性蛋白C被該交換劑吸收，接著，在適當的鹽濃度條件下，單獨洗脫活性蛋白C；因此可以製得基本不含凝血酶或相當的蛋白酶和/或未經活化的蛋白C的人活性蛋白C製劑；令人驚奇的是，用此法製得的人活性蛋白C製劑與用傳統方法得到的人活性蛋白C相比，具有極高的比活度，從而完成了本發明。換言之，本發明的目的是提供一種高比活度，基本不含凝血酶或相當的蛋白酶，和/或未經活化的蛋白C的人活性蛋白C製劑及其製備方法。
附圖簡述
圖1顯示了本發明和傳統製備方法製備的APC製劑的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的結果。
實施本發明的最佳方案本發明的人活性蛋白C製劑比活度為3500U/mg或更大，比活度的單位定義為使正常人血漿中活性促凝血酶原激酶壽命(APTT)延長兩倍的量，並且基本不含凝血酶或相當的蛋白，和/或未經活化的蛋白C.按照本發明製劑的製備方法，用凝血酶或相當的蛋白酶活化人蛋白C後，在pH5.0-6.0，NaCl濃度為80mM或更低條件下，把含有人活性蛋白C的溶液與陽離子交換劑接觸，以使凝血酶和活性蛋白C被交換劑吸收，然後在鹽濃度為0.1-0.35M條件下，單獨洗脫出人活性蛋白C，因而只回收高純度的人活性蛋白C。
在上述含蛋白C的溶液中，用凝血酶或相當的蛋白酶活化蛋白C，往含蛋白C濃度為0.5-8.0mg/ml的溶液中，加入凝血酶，至凝血酶/蛋白C的比值為1-20U/mg，在pH為6.0-8.0條件下進行活化，以有效激活大量的蛋白C。然後，進行脫除活化劑和APC的純化步驟，其中，在pH為5.0-6.0，NaCl濃度為80mM或更小的條件下，把活化後含APC的溶液與陽離子交換劑接觸，使交換劑吸收凝血酶和APC，然後在鹽濃度為0.1-0.35M條件下，單獨洗脫出活性蛋白C。
按照本發明活化人蛋白C的方法，有可能用少量的凝血酶有效地活化高濃度的蛋白C。此法很有利，因為它減少了活化過程中蛋白C的降解作用，而且以後脫除凝血酶也變得更容易了。APC的後續純化步驟使凝血酶在洗脫液中濃度為0.001U/ml或更小，因此，APC能被定量地回收。另外，因為APC是經吸收後被洗脫出來，所以可得到濃縮的APC。並且，用本發明方法得到的APC製劑與那些用傳統方法得到的製劑相比，具有極高的比活度。
此處所用的人活性蛋白C製劑的「比活度」是指APC活度與蛋白總量(mg)的比值。1個單位APC活度定義為使正常人血漿中的活性促凝血酶原激酶壽命(APTT)延長兩倍的量。因此，實際測量APC活度按下列步驟進行把稀釋了的樣品加入正常人血漿中，測定其APTT(秒)，當測得的APTT值是對照物(緩衝液)的兩倍時，該稀釋度即被確定為APC樣品的活度。
本發明製劑的主要成分APC，以及本發明製備方法的起始原料蛋白C，可以從任何來源中取得，但最好取自於人血漿。
本發明上述步驟中的活化步驟按下列方法進行往含濃度為0.5-0.8mg/ml的蛋白C溶液中加入凝血酶，至凝血酶/蛋白C的比值為1-20U/mg，在pH為6.0-8.0，鹽濃度為0.1-0.15M的條件下進行反應，例如，在37℃下反應5-6小時。
上述步驟得到的反應溶液，按要求校準pH值或鹽濃度後，經過陽離子交換劑處理，純化APC。用陽離子交換劑處理後，脫除了凝血酶和另外的雜質蛋白，如未被活化的蛋白C。此處所用的陽離子交換劑，只要是含有陽離子交換基(如磺酸基，羧基)的不溶性載體均可，並且包括在傳統技術中應用的陽離子交換劑，例如，陽離子交換樹脂如S-瓊脂糖(商品名)，SP-葡聚糖凝膠(商品名)，均由Parmacia製造，SP-Toyopearl(商品名)，TSK Gel SP-5PW(商品名)，均由Toyo Soda K.K.製造。其中，SP-葡聚糖凝膠和SP-Toyopearl最好。此步驟可用柱方法或分批方法進行。就脫除雜質蛋白效率而言，最好選用柱方法。
根據本發明，APC的純化過程特點是把活化作用的反應液與陽離子交換樹脂接觸，凝血酶和APC都被交換劑吸收，然後，在鹽濃度為0.1-0.35M條件下，單獨洗脫出活性蛋白C。經過此純化過程製備的APC製劑基本不含凝血酶或相當的蛋白酶和/或未經活化的蛋白C，並且比活度極高，為3500U/mg或更高。
另外，本發明者為了消除用傳統方法由蛋白C製備高比活度APC的一系列步驟中的缺點，進行了研究，結果發現了許多有用的改進，進一步提高了本發明效率。
已知一種純化蛋白C的方法，其中，蛋白C用檸檬酸鋇吸收和沉澱，用硫酸銨和DEAE-瓊脂糖柱色譜法分餾純化後，再經過製備聚醯胺凝膠電泳，葡聚糖硫酸瓊脂糖色譜法等純化過程，或用使蛋白C的抗體固定的凝膠純化蛋白C的方法等，(J.Biol.Chem.，251，355-363(1976)；J.Chin.Invest.，64，761-769(1979)；Blood，54，1272-(1979)；FEBS LETTERS，191，75-81(1985)；J.Biol.Chem.，261，11097-11105(1986))。然而，考慮到產量，生產效率等。上述方法雖然適用於實驗室，卻不適用於工業上大規模的純化。另外值得注意的是，雖然，在用使蛋白C的抗體固定的凝膠進行純化中，用強的離液序列高的陰離子或酸性pH，或如EDTA等強螯合劑洗脫，但是從凝膠中仍釋放有害的痕量蛋白C抗體，進入洗脫液中。
本發明者已經發現，用檸檬酸緩衝液代替強螯合劑EDTA洗脫蛋白C時，可去除由凝膠中釋放出的蛋白C抗體。在pH為7.0-9.0條件下，把得到的含蛋白C的溶液與陰離子交換劑接觸，可使交換劑吸收蛋白C，由此脫除痕量的蛋白C抗體，接著，在鹽濃度為0.3-1.0M的條件下，洗脫蛋白C。此過程幾乎能脫除全部的蛋白C抗體。
基於上述發現，本發明提供了一種工業規模製活性蛋白C的改進方法，包括下列步驟(1)把含人蛋白C的溶液與陰離子交換劑接觸，使交換劑吸收蛋白C，此後洗脫蛋白C，製得具有Gla結構的人蛋白C；(2)把含人蛋白C的溶液與吸收劑接觸，該吸收劑即是一種與鈣離子相連的特殊識別蛋白C抗體附著的不溶性載體，條件是有使吸收劑能吸收蛋白C的鈣存在，然後用檸檬酸緩衝液洗脫出蛋白C；(3)把含蛋白C的溶液與陰離子交換劑接觸，使蛋白C被交換劑吸收，此後，從上述含蛋白C的溶液中洗脫出蛋白C，除去蛋白C抗體；(4)用凝血酶或相當的蛋白酶活化人蛋白C，其中，在pH為6.0-8.0條件下，往含蛋白C的溶液中加入凝血酶，至凝血酶/蛋白C的比值為1-20U/mg；(5)然後，在pH為5.0-6.0，鹽濃度為80mm或更低條件下，把活化後含人活性蛋白C的溶液與陽離子交換劑接觸，使凝血酶和活性蛋白C都被交換劑吸收，然後，在鹽濃度為0.1-0.35M條件下，單獨洗脫，回收人活性蛋白C。
如果把純化了的活性蛋白用於治療，尤其當純化的活性蛋白C是從人血漿中得到時，有感染存在於原材料中的病毒的危險(例如肝炎病毒，HIV等)，因此，有必要脫除和使病毒失活。在血製劑中，應進行下述步驟防止病毒性感染通過原材料過篩，膜過濾，吸收，柱色譜，沉澱分餾脫除病毒，或用溶劑洗滌劑法，β-丙醇酸內酯，加熱，電磁輻射等方法使病毒失活，或此兩種方法結合使用。但是，很難實現既脫除和使病毒失活，而又不導致蛋白變性，生物活性降低，產量降低等。本發明者發現，對於活性蛋白C製劑，把脫除病毒膜和連合使用在0.5-10％(W/V)的清蛋白作穩定劑存在下升華乾燥加熱，可以有效進行病毒脫除和使之失活。用這個過程，可以有效脫除和失活病毒，而不導致活性蛋白C變性，生理活性和產量下降。
本發明者為了發展一種對蛋白C純化和活化的有效方法，以及進一步用於醫療時防止病毒感染，而進行了研究，結果發現用蛋白C抗體的親合色譜法純化蛋白C時，利用檸檬酸鹽緩衝溶液洗脫；在高濃度下活化蛋白C；通過陽離子交換劑的吸收作用純化活性蛋白C是有效的。基於這些純化步驟，以及通過脫除病毒膜除去病毒和通過升華乾燥加熱使病毒失活相結合，本發明者建立了生產大量高純活性蛋白C，並且以高產率運用於醫療技術。
本發明的APC製劑，除雜質蛋白水平下降外，其特點是與用傳統方法製備的APC相比，本發明的APC製劑顯示了更高的比活度(APC活度/蛋白總量(mg))，傳統方法如，在Biochemistiry16，5824-5831(1977)公開的方法。實際上，本發明的APC製劑的比活度比傳統製備的APC高1.5-2倍。觀察到比活度增加的主要原因還不清楚，但是估計雜質蛋白(APC降解產品，未經活化的蛋白C，凝結蛋白等)的脫除可能是一個主要因素，而這是傳統方法無法達到的。
通過下列實例詳細描述本發明，但並不僅限於此。實例11.1高比活度活性蛋白C製劑的製備從血漿中得到蛋白C製劑的溶液(8.7mg/ml蛋白C，pH7.5，導電率為34.3ms/cm)，經20mM檸檬酸/0.1M氯化鈉緩衝液(pH6.0)滲析，然後稀釋至蛋白C的濃度為4mg/ml。往此溶液中加入人凝血酶至最終濃度為60U/ml，在37℃下，加熱此混合物5小時來活化蛋白C。
活化後，用20mM的檸檬酸緩衝液(pH6.0)稀釋活化後的溶液兩次，用於陽離子交換柱(SP-Toyopearl)，脫除凝血酶。用含60mM氯化鈉的20mM檸檬酸緩衝液(pH6.0)充分洗滌交換劑，然後，用含0.3M氯化鈉的20mM檸檬酸緩衝液洗脫出活性蛋白C。在此條件下，活性蛋白C被單獨洗脫出來，而沒有凝血酶洗脫液。殘存的凝血酶濃度為0.001U/ml或更低。得到的APC製劑顯示出4750.9U/mg的比活度1.2活化後，在陽離子色譜中吸收和洗脫APC條件的研究(1)吸收條件用20mM檸檬酸緩衝液，在pH為6.0-7.0和鹽濃度為0.0-0.15M範圍內，檢測APC的吸收條件，考慮到APC的穩定性，此範圍能夠適用。在pH為7.0和鹽濃度為0.1M條件下，很難吸收APC。在pH為6.5和鹽濃度為0.1M條件下，雖然部分APC被吸收，但大部分APC被洗脫。在pH為6.0和鹽濃度為0.1M條件下，大部分APC被吸收到色譜載體上。
基於這些結果，固定pH為6.0，用不同鹽濃度研究了APC吸收程度。當鹽濃度為0.5M時，不僅APC，而且用於活化作用的部分凝血酶都被洗脫，然而，當鹽濃度為0.1M時，大部分APC被吸收，但吸收並不充分，部分APC如上述情況那樣被洗脫。因此，鹽濃度調節為80mM，此時，可觀察到APC被適當吸收到色譜載體上。(2)洗脫條件用含60mM NaCl的20mM檸檬酸緩衝液(pH6.0)使色譜載體平衡後，在NaCl濃度為60mM-0.5M間進行梯度洗脫。當NaCl濃度為0.1M左右，漸漸開始洗脫APC，當NaCl濃度為0.35M或更高時，凝血酶也被部分洗脫。因此，最佳洗脫條件是NaCl濃度低於0.35M。參考實例1用傳統方法製備活性蛋白C製劑將以上蛋白C製劑的溶液(8.7mg/ml蛋白C，pH7.5，導電率為34.3ms/cm)，用50mM Tris-HCl/0.1M NaCl緩衝液(pH8.0)滲析後，稀釋成蛋白C的濃度為0.7mg/ml。往此溶液中加入凝血酶至最終濃度為10U/ml，在37℃下，加熱此混合物5小時來活化蛋白C。活化後，把反應液加入陽離子交換柱(SP-Toyopearl)中，交換柱預先經洗滌，並用50mM Tris-HCl/0.15MNaCl緩衝液(pH8.0)平衡，由此，凝血酶被吸收，活性蛋白C被回收到洗脫液中。此溶液中，活性蛋白C的比活度為3259.6U/mg。實例2本發明製備方法與傳統製備方法的對比用電泳法等對比實例1和參考實例1製劑的比活度和純度。2.1活性蛋白C活度的測定根據下列過程測定APC的活度。
1個單位APC活度定義為使活性促凝血酶原激酶壽命(APTT，秒)延長兩倍，達到正常人血漿兩倍時所需APC的數量。因此，測定APC活度的方法中，是把稀釋樣品加入到正常人血漿中，測定APTT(秒)，當測得的APTT值是對照液(緩衝液)的兩倍時，稀釋情況被認為是樣品的APC活度。(步驟)樣品用含1％HSA的veronal緩衝液稀釋400倍、500倍、800倍或1000倍。在37℃下，往每100μl的標準液(緩衝液)或樣品稀釋液中相繼加入100μl正常人血漿(如Citrol IBaxterDiagnostics Inc.)和100μl APTT試劑(如ActinBaxter DiagnosticsInc.)，間隔時間為15秒，攪拌此混合物，2分鐘後，加入100μl0.025M的氯化鈣，測定凝結時間。(活度計算)從每個對照樣和樣品的稀釋(X)的APTT值(Y)中，得到如下的線性回歸公式以及相關係數103/X和YY＝A(103/X)+B從下列公式中得到X1的值
X1＝103{(Y1-B)/A}其中，Y1的值是對照樣APTT(秒)的兩倍，被當作樣品的APC活度(U/ml)。(蛋白測定)在測定吸光度A280基礎上，測定活性蛋白C的濃度，如由APC的胺基酸組合物估計值那樣(J.Clin.Invest.，64，761-769(1979))，以估計濃度為1％(W/N)(10mg/ml)APC的吸光度A280是14.5為基礎。因此，由下列公式計算活性蛋白C的濃度活性蛋白C的濃度(mg/ml)＝A280測定值/1.45以上述測定的APC的活度和濃度為基礎，計算出此處所用APC的比活度(U/mg)。2.2活化條件對APC比活度的影響利用剛活化後的樣品，研究不同活化條件對比活度的影響。活化作用進行後，測定APC活度，其中，測定前，往1ml樣品中分別加入1U和10U抗凝血酶和肝素，在37℃下，加熱混合物30分鐘，使凝血酶失活。結果顯示在表1中。發現，與傳統方法的活化條件(pH8.0，NaCl濃度為0.15M)相比，本發明的活化條件(pH6.0，NaCl濃度為0.1M)對比活度無影響。
表1傳統方法 本發明蛋白濃度(mg/ml) 0.72 1.38活度(U/ml) 2069.94133.4比活度(U/mg)2885.93089.32.3用陽離子色譜處理前後比活度的比較利用不同樣品，比較本發明中，用陽離子色譜處理前後，APC的比活度。結果總結在表2中。用傳統製備方法幾乎觀察不到比活度增加。相反，本發明的製劑APC的比活度(U/mg)超過了4500，用色譜處理後，APC的比活度增加了約1.5倍。比活度增加的主要原因還不清楚，但估計脫除用傳統方法無法除去的雜質蛋白(APC降解產品，未經活化的蛋白C，凝結蛋白等)可能是一個主要原因。
表2比活度(U/mg) 增加率樣品前 後 (倍數)色 譜發明1 3089.3 4750.91.54發明2 3108.3 5750.51.85發明3 3869.5 5107.81.32傳統製備方法 2885.9 3259.61.132.4用電泳比較陽離子色譜處理前後在傳統方法的陽離子色譜過程中，是在pH為8.0時洗脫APC，然而，在本發明方法中，首先在pH為6.0時吸收APC，然後洗脫。圖1顯示了在傳統方法和本發明方法中，SDS-PAGE的結果。
按照本發明的方法，其中，當pH為6.0時，APC被吸收，未經活化的蛋白C被洗脫掉，那些分子量比APC或高或低的餾分區域被脫除。另外，與在pH為8.0時洗脫的餾分相比，經pH6.0時吸收，然後洗脫得到的餾分顯示出更尖銳聽對應APC的譜帶，因此，有可能除去未經活化的蛋白C。另一方面，雖然用傳統方法得到的洗脫餾分中，比APC分子量或高或低的餾分區域有一定數量的降低，但並未完全脫除這些餾分帶。2.5 APC製劑中未經活化的蛋白C含量未經活化的蛋白C含量降低被看做是導致本發明中高比度APC製劑比活度增加的一個原因。因此，測定了由本發明和傳統方法製備的APC製劑中，未經活化的蛋白C的含量。根據通常的議定書，使用ELISA系統應用對蛋白C有特效的單克隆抗體進行測定。結果顯示在表3。
表3樣品APC的比活度 未經活化的蛋白C含(U/mg) 量(％W/W)本發明製劑15750.5 0.47本發明製劑25107.8 1.22本發明製劑34457.1 0.36傳統的製劑12661.7 5.41傳統的製劑23286.2 5.83傳統的製劑32470.4 3.93比活度低的傳統製劑中，未經活化的蛋白C含量為4-6％，而比活度高的本發明製劑中，未經活化蛋白C的含量少至0.4-1.2％。雖然傳統製劑中，未經活化的蛋白C含量高於本發明的製劑，但是，含量很小，因此，不易對製劑的比活度產生直接影響。為了證實這一點，往含有極少量未經活化蛋白C的本發明製劑3中，加入蛋白C，直到最後濃度為5％，測定了APC活度(APTT)。結果，與未加蛋白C的製劑相比，沒有觀察到APTT值的變化(參見表4)。因此，未經活化的蛋白C含量降低，並非是本發明APC製劑比活度增加的一個主要因素。
表4APC的比活度(U/mg)樣品 沒加蛋白C加入5％的蛋白C本發明製劑35077.9 5173.7傳統的製劑32726.0 2725.7實例3活性蛋白C製劑的製備不加熱，熔化工業規模的新鮮冷凍的人血漿(100L)，通過離心過濾法分離出產生的沉澱。把得到的上層清液加入到陰離子交換劑(DEAE-葡聚糖凝膠A-50)中。用含0.1M氯化鈉的20mM的檸檬酸緩衝液(pH7.0)充分清洗交換劑，再用含0.5M氯化鈉的20mM的檸檬酸緩衝液(pH7.0)洗脫具有Gla結構的人蛋白C餾分。
往此溶液中加入30mM氯化鈣，然後，將此混合物加入到使用抗蛋白C抗體的親合色譜柱中。用含0.15M氯化鈉和2mM氯化鈣的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)充分清洗柱子，此後，用含0.15M氯化鈉的20mM檸檬酸緩衝液(pH6.0)洗脫蛋白C。
用0.1M的氫氧化鈉將此溶液的pH值調到8.0，然後加入到陰離子交換柱(Q-Sepharose Fast Flow)中。用含0.15M氯化鈉的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)好好清洗交換劑，用含0.4M氯化鈉的0.3M甘氨酸緩衝液(pH7.0)進行洗脫。此步驟得到的蛋白C已被證實，在SDS-PAGE中是單一譜帶。
為了活化，用20mM檸檬酸緩衝液(pH6.0)，將由上述過程得到的純化了的蛋白C溶液稀釋至蛋白C濃度為4mg/ml。往此溶液中加入凝血酶，至最終濃度為60U/ml，在37℃下，加熱混合物5小時，來活化蛋白C。
活化後，為了脫除凝血酶，用20mM檸檬酸緩衝液(pH6.0)把活化後的溶液稀釋兩倍，再加入到陽離子交換柱(SP-Toyopearl)中。用含60mM氯化鈉的20mM檸檬酸緩衝液好好清洗交換劑，然後，用含0.35M氯化鈉的20mM檸檬酸緩衝液(pH6.0)洗脫活性蛋白C。在此條件下，活性蛋白C被單獨洗脫，而不洗脫凝血酶，由此，除去了凝血酶。用脫除病毒膜將得到的活性蛋白C溶液進行過濾(Planova 35N manufactured byAsahi Chemical Industries，K.K.)。反應後的溶液中，活性蛋白C的比活度為5392.7U/mg，殘餘凝血酶的濃度為0.001U/ml或更低。
將濾液調到最終濃度時，含NaCl 0.7％(W/V)，甘氨酸0.5％(W/V)，檸檬酸鈉0.65％(W/V)，人清蛋白2.5％(W/V)，APC的活度600U/ml。這樣製備的活性蛋白C溶液經無菌過渡，冷凍乾燥後，在65℃下，乾燥加熱96小時，使病毒失活，最後得到適合醫療應用的活性蛋白C。
權利要求
1.一種比活度為3500U/mg或更大的人活性蛋白C製劑，比活度的單位定義為使正常人血漿中活性促凝血酶原激酶壽命(APTT)延長兩倍的APC的量，並且基本不含凝血酶或相當的蛋白酶，和/或未經活化的蛋白C。
2.權利要求1中的人活性蛋白C製劑，其中比活度為4000U/ml或更大。
3.權利要求1或2中的人活性蛋白C製劑，其中，上述製劑是用凝血酶或相當的蛋白酶使未經活化的人蛋白C活化而製備的。
4.一種純化人活性蛋白C的方法，包括用凝血酶或相當的蛋白酶活化人蛋白C後，在pH5.0-6.0，鹽濃度為80mM或更低條件下，把含人活性蛋白C的溶液與陽離子交換劑接觸，使交換劑吸收凝血酶和活性蛋白C，並且在鹽濃度為0.1-0.35M條件下，單獨洗脫出人活性蛋白C。
5.權利要求1中的一種製備人活性蛋白C的方法，上述方法包括下列步驟(1)將含人蛋白C的溶液與陰離子交換劑接觸，使蛋白C被吸收到交換劑中，然後，洗脫蛋白C，製備具有Gla結構的人蛋白C部分；(2)將含人蛋白C的溶液與吸收劑接觸，該吸收劑即是一種與鈣離子相連的特殊識別蛋白C的抗體附著的不溶性載體，條件是有使吸收劑能吸收蛋白C的鈣離子存在，然後用檸檬酸緩衝液洗脫蛋白C；(3)將含蛋白C的溶液與陰離子交換劑接觸，使蛋白C被交換劑吸收，然後從上述含蛋白C的溶液中洗脫蛋白C，由此除去蛋白C抗體；(4)用凝血酶或相當的蛋白酶使人蛋白C活化，其中，在pH為6.0-8.0條件下，往含蛋白C的溶液中加入凝血酶，直至凝血酶/蛋白C的比值為1-20U/mg；(5)在pH為5.0-6.0，鹽濃度為80mM或更低條件下，將活化後含人活性蛋白C的溶液與陽離子交換劑接觸，使凝血酶和人活性蛋白C都被交換劑吸收，然後，在鹽濃度為0.1-0.35M條件下，單獨洗脫回收人活性蛋白C。
全文摘要
本發明提供了一種基本不含凝血酶或相當的蛋白酶，和/或未經活化的蛋白C的高比活度人活性蛋白C製劑，及其製備方法。一種人活性蛋白C製劑，該製劑基本不含凝血酶或相當的蛋白酶，和/或未經活化的蛋白C，比活度為3500U/mg或更大，單位比活度定義為使正常人血漿中活性促凝血酶原激酶壽命(APTT)延長兩倍的量。通過一種純化人活性蛋白C的方法來製備上述製劑，包括用凝血酶或相當的蛋白酶活化人蛋白C後，將含人活性蛋白C的溶液與陽離子交換劑接觸，使凝血酶和活性蛋白C都被吸收到交換劑中，然後單獨洗脫出人活性蛋白C。
文檔編號C07K14/755GK1138349SQ94194596
公開日1996年12月18日 申請日期1994年10月27日 優先權日1993年10月29日
發明者緒方洋一, 野內俊伸, 中平伸二 申請人:財團法人化學及血清療法研究所, 帝人株式會社